全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 ：2011-09-19
基金项目 ：国家林业局林业公益性行业科研专项（200904050）
作者简介 ：姜宁宁 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 园林植物资源育种 ; E-mail: ericaningjiang@gmail.com
通讯作者 ：戴思兰 , 女 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 园林植物遗传育种 ; E-mail: silandai@gmail.com
中国传统菊花品种‘小林静’再生及转化体系的建立
姜宁宁 付建新 戴思兰
（北京林业大学园林学院 国家花卉工程技术研究中心，北京 100083）
摘 要： 以中国传统菊花品种‘小林静’叶片为外植体，建立了‘小林静’较好的再生体系及遗传转化体系。结果表明，‘小
林静’叶盘最适不定芽分化培养基为 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，不定芽分化率为 92.76%，平均再生不定芽数为 2.376 7个；
试管苗最佳生根培养基为 1/2MS，生根率达 100%。移栽采用灭菌的蛭石，再生苗移栽成活率达 90%以上。采用根癌农杆菌 C58C1
介导的叶盘转化法进行‘小林静’的遗传转化试验，农杆菌 OD600=0.5-0.6，侵染 10 min后，将叶片外植体接种到 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5
mg/L NAA的培养基中黑暗共培养 2 d，之后转接到附加 10 mg/L硫酸卡那霉素和 400 mg/L羧苄青霉素的分化筛选培养基中进行转
化细胞的筛选，待长出抗性芽后转接至生根培养基中进行培养，最终建立了菊花品种‘小林静’的遗传转化体系。
关键词： ‘小林静’ 再生体系 转化体系
Establishment of Regeneration and Transformation Systems in
Chrysanthemum×morifolium ‘Xiao Linjing’
Jiang Ningning Fu Jianxin Dai Silan
（College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, National Engineering Research Center for Floriculture, Beijing 100083）
Abstract: This research established leaves of Chrysanthemum × morifolium ‘Xiao Linjing’ stability of high efficient plant regeneration
and transformation systems. The results showed that the best adventitious buds differentiation medium was MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA
and the rate of adventitious buds differentiation was 92.76%. The average adventitious buds per explant were 2.376 7. For the rooting medium,
1/2MS was the best and the rate of rooting was 100%. Living tube seedlings transplanting survival rate was over 90% using vermiculite after
sterilization. Agrobacterium C58C1 was chosen for the genetic transformation experiment. The OD600 ranged from 0.5 to 0.6 and the infection
time was 10 minutes. Co-cultured in the dark for two days, then the leaf explants were put in antibiotic selection medium that contain 10 mg/L
kanamycin and 400 mg/L carbenicillin. When resistant shoots formed, it was cultured on the rooting medium.
Key words: ‘Xiao Linjing’ Regeneration system Transformation system
菊花（Chrysanthemum × morifolium Ramat.）起
源于中国，在我国已有两千多年的栽培历史，菊花
种质资源丰富，现有栽培品种约 3 000 个，是我国
十大传统名花之一［1］。虽然通过自发突变、杂交和
其他传统的育种方法产生了一些重要的品种，但是
传统方法所能提供的基因库是有限的，而植物基因
工程则可以将其他生物如细菌、病毒和其他植物的
外源基因导入到观赏植物中，以此改变园艺品种的
观赏特性［2］。菊花再生及转化体系的研究源于 20 世
纪 70 年代，经过多年研究建立了以叶片［3-7］、叶柄［8］、
茎段［5, 9, 10］、花器官［11, 12］、薄层细胞［13, 14］等为外植
体的不同菊花品种的再生体系和转化体系。中国传
统菊花品种繁多，基因型差异很大，适宜的培养基
条件和外植体类型也因品种的基因型不同而存在差
异，多数品种再生体系的建立极为困难。‘小林静’
（C. × morifolium ‘Xiao Linjing’）为典型的中国传统
菊花品种。本研究选取其叶片为外植体，在添加不
同浓度的 NAA 和 6-BA 为生长调节物质的 MS 基本
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期88
培养基中进行离体培养，直接分化出不定芽，获得
了菊花品种‘小林静’的再生体系 ；通过对叶片外
植体硫酸卡那霉素临界筛选压及农杆菌适宜侵染时
间进行试验，建立了菊花品种‘小林静’的高效遗
传转化体系。旨在通过这一研究为其他中国传统菊
花品种再生体系的建立提供参考，也为进一步通过
基因工程改良菊花品种‘小林静’的观赏特性奠定
良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料及培养环境 中国传统菊花品种‘小
林静’由本课题组种质资源圃提供。培养室温度为
（25±1） ℃，日光灯光源，光照强度 2 000 lx，光周
期 16 h 光照 /8 h 黑暗。
1.2 方法
1.2.1 ‘小林静’再生体系的建立
1.2.1.1 菊花品种‘小林静’无菌苗体系的建立 选
取生长健壮、无病虫害的插穗剪掉顶芽、叶片，保
留部分叶柄，用纱布包裹，流水冲洗 0.5-1 h 后于超
净工作台中进行以下操作 ：将洗净的茎段用无菌水
冲洗 2-3 遍，75% 酒精灭菌 15-30 s，无菌水冲洗 1-2
遍后再用 1% NaClO 浸泡灭菌 15 min，无菌水彻底
清洗 3-4 遍后将茎段插入 MS 培养基进行初代培养。
培养茎段 24 个，每个三角瓶 3 个茎段，共 8 瓶。一
个月后，至无菌苗长出腋芽后用同样的培养基扩繁
继代。
1.2.1.2 不定芽的诱导与分化 以 MS 为基本培养
基，6-BA 浓度为 2.0 和 3.0 mg/L，NAA 为 1.0、1.5
和 2.0 mg/L 的两因素三水平的均匀设计。选取‘小
林静’20-25 d 苗龄的无菌苗中上部充分展开的幼嫩
叶片为外植体，将其切为 5 mm×5 mm 的叶盘，随
后接种到不定芽再生培养基中，使叶盘近轴面接触
培养基。每一处理接种 45 块外植体，3 次重复。每
隔 6 d 观察一次，14 d 更换培养基一次，30 d 后统
计不同外植体的再生率。计算方法如下 ：分化率
（%）= 分化不定芽的外植体数目 / 接种的外植体数
目 ×100% ；外植体平均再生芽数 = 外植体再生不定
芽总数 / 再生不定芽的外植体数。
1.2.1.3 不定芽生根培养基的筛选 待不定芽生长
至约 1.5 cm 时自基部剪下，移至附加 0、0.1、0.2
mg/L NAA 的 1/2MS 培养基中，每隔 3 d 观察一次，
20 d 后统计根数和生根率，筛选最佳生根培养基
配方。
1.2.1.4 试管苗的炼苗及移栽 不定芽在生根培养
基中培养 20 d 后，将瓶盖打开，于组培室炼苗 3 d。
将试管苗根部琼脂洗净，移栽于用 121℃高温或 0.1%
浓度高锰酸钾灭菌的蛭石基质中，保持基质和空气
中的湿度，7 d 后进行常规培养。
1.2.2 ‘小林静’转化体系的建立
1.2.2.1 根癌农杆菌菌株和载体 根癌农杆菌工程
菌株为 C58C1。植物表达载体 pBI121-CaMV35S-
Sense DFL、pBI121-CaMV35S-Antisense DFL 由本实
验室构建和保存。
1.2.2.2 卡那霉素抗性选择压的确定 为了确定卡
那霉素对‘小林静’不定芽分化的影响，将 20-25
d 苗龄、生长健壮的甘菊无菌苗上部充分展开的幼
嫩叶片剪成 5 mm×5 mm 的方形叶盘接种到分别加
有 0、5、10、15、20、25、30 和 35 mg/L 硫酸卡那
霉素的最适不定芽分化培养基中，每个浓度接种 3
个培养皿，每个培养皿 20 个叶盘，共计 60 个叶盘，
每隔 10 d 统计一次结果，筛选出能够抑制外植体芽
分化的适宜硫酸卡那霉素浓度。
1.2.2.3 工程菌液制备 取 -80℃超低温冰箱保存的
菌液于冰上融化，用接种针蘸取少量菌液，在添加
有 50 mg/L 硫酸卡那霉素和 80 mg/L 利福平的固体平
板培养基上划线，于 28℃恒温培养箱中倒置暗培养
2 d。用牙签挑取单菌落接种到含 50 mg/L 硫酸卡那
霉素和 80 mg/L 利福平的液体 LB 培养基中，28℃，
200 r/min 振摇培养 16-24 h 至对数生长期，然后按
1 100 比例转接入不含抗生素的新鲜液体培养基中
继续振摇培养 5-6 h 至 OD600=0.5-0.6。无菌条件下
取新鲜菌液于 50 mL 离心管中常温 5 000 r/min 离心
10 min，去除上清液，用 1/2MS 液体培养基重悬沉淀，
用于侵染转化。
1.2.2.4 农杆菌侵染时间的确定 用 OD600 值为
0.5-0.6 的农杆菌C58C1侵染‘小林静’叶片外植体5、
10 和 15 min 后接种到共培养培养基（MS+2.0 mg/L
6-BA+1.5 mg/L NAA）中共培养 2 d，叶片正面与培
养基接触，暗培养。观察比较侵染时间对转化效果
2012年第4期 89姜宁宁等 ：中国传统菊花品种‘小林静’再生及转化体系的建立
的影响，确定农杆菌的最佳侵染时间。
1.2.2.5 农杆菌转化菊花品种‘小林静’ 将 20-25 d
苗龄、生长健壮的甘菊无菌苗上部充分展开的幼嫩
叶片剪成 5 mm×5 mm 的方形叶盘放入制备好的菌
液中侵染，侵染后用无菌滤纸中吸干表面多余菌液，
置于共培养培养基中共培养 2 d。2 d 后用无菌水和
300 mg/L 羧苄青霉素清洗叶片，接种到 MS+2.0 mg/L
6-BA+1.5 mg/L NAA+10 mg/L 卡那霉素 +400 mg/L 羧
苄青霉素的筛选培养基中培养，每 20 d 左右转接一
次。待抗性芽长至 1 cm 左右，转接到生根培养基中，
继续培养直至生根。转化效率计算方法如下 ：抗性
芽生成率（%）= 获得的卡那霉素抗性芽数 / 外植体
总数 ×100%。
1.2.3 数据统计与分析 所得数据采用 Microsoft
Excel 和 SPSS13.0 软件进行方差分析与多重比较（邓
肯式检验，P=0.05），百分数经反正弦（y=arcsin x1/2）
转换后再进行分析和比较。
2 结果
2.1 菊花品种‘小林静’无菌苗再生体系的建立
2.1.1 生长调节剂对‘小林静’不定芽分化的影
响 在 6 种附加不同激素浓度的不定芽分化培养基
中，以 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA 的不定芽分
化培养基诱导不定芽分化频率最高，达 92.76% 左右，
且不定芽长势最好。当 6-BA 浓度为 2.0 mg/L 时，随
着 NAA 浓度提高，不定芽诱导率呈先上升后下降的
趋势，当 6-BA 浓度增加到 3.0 mg/L 时，随着 NAA
浓度升高，不定芽诱导率有所降低，其中以 MS+3.0
mg/L 6-BA+2 mg/L NAA 的不定芽分化培养基诱导效
果最差，不定芽诱导率只有 64.27%，且不定芽长势
一般。不同激素浓度的不定芽诱导培养基对平均分
化不定芽数没有明显影响。
双因子方差分析结果（表 1）表明，不同浓度
的 6-BA 对‘小林静’不定芽分化有显著影响，而不
同浓度的 NAA 以及 6-BA 和 NAA 的交互作用对‘小
林静’不定芽分化没有显著影响。叶盘接种到不定
芽分化培养基中，第 5 天开始可以看到叶盘明显膨
大。13 d 后，叶盘产生愈伤组织，叶盘稍微加厚，
叶缘周围叶脉伤口处少量愈伤成点状，16 d 后陆续
有芽点出现，随后长出丛生不定芽，不定芽叶片正
常，茎段生长较快。培养 30 d 后观察统计长度在
5 mm 以上不定芽的数目，并计算不定芽诱导率。
表 1 不同激素浓度配比对不定芽再生的影响
激素种类及浓度（mg/L）
不定芽分化率（%） 平均再生不定芽数
6-BA NAA
2.0 1.0 87.94% ± 0.07ab 2.1667 ± 0.56a（+）
2.0 1.5 92.76% ± 0.07a 2.3767 ± 0.76a（+ +）
2.0 2.0 85.09% ± 0.05ab 2.0200 ± 0.40a（+）
3.0 1.0 85.41% ± 0.04ab 1.7133 ± 0.07a（+）
3.0 1.5 72.17% ± 0.23bc 1.9033 ± 0.52a
3.0 2.0 64.27% ± 0.24c 1.5567 ± 0.76a
邓肯式显著性检验，小写字母不同表示在 P<0.05 水平上存在显著差异 ;（+）表示长势一般，（+ +）表示长势良好
2.1.2 生长调节剂对试管苗生根的影响 试验结果
表明，在不同的生根培养基中菊花品种‘小林静’
不定芽均在 5 d 以后开始生根，19 d 后统计结果见
表 2。3 种不同的生根培养基不定芽生根率均达到
了 100%。其中 1/2MS 培养基中不定根须根数多且分
枝丰富，根总数最多。而在 1/2MS+0.1 mg/L NAA 和
1/2MS+0.2 mg/L NAA 培养基中不定根须根数较少，
其中以 1/2MS+0.2 mg/L NAA 培养基中不定根须根数
最少，分枝也最少。
2.1.3 再生植株移栽 不定芽在生根培养基中培养
20 d 后，将瓶盖打开，于组培室炼苗 3 d。将试管苗
根部琼脂洗净，移栽于用 121℃高温或浓度为 0.1%
高锰酸钾灭菌的蛭石基质中，保持基质和空气中的
湿度，7 d 后进行常规培养，移栽成活率达 90% 以上。
2.2 菊花品种‘小林静’无菌苗转化体系的建立
2.2.1 硫酸卡那霉素对叶盘分化抑制的影响 由表
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期90
3 可知，在不含硫酸卡那霉素的对照培养基中叶片
分化率最高，达到 92.76%。5 mg/L 硫酸卡那霉素的
分化培养基中叶片稍微膨大，叶盘呈现黄绿色，10
mg/L 及以上浓度硫酸卡那霉素的培养基中叶片出现
黄化和白化现象，叶片生长阻滞。随硫酸卡那霉素
梯度的增加，叶片白化现象越明显。30 d 后 5 mg/L
硫酸卡那霉素浓度下的叶片仍保持黄绿色，但不进
行不定芽分化，而 10 mg/L 以上浓度的叶片则白化
死亡，因此 10 mg/L 的硫酸卡那霉素可以作为菊花
品种‘小林静’叶片临界抗性选择压。
有农杆菌菌落产生，菌落清晰可见，在培养皿中较
为均匀的分布，大部分叶片周围出现了菌落。农杆
菌菌液侵染 15 min 的‘小林静’叶片在 1 d 左右就
已产生菌落，在第 2 天有少部分叶片周围出现菌斑
的迹象，转接至分化培养基之后农杆菌过长，羧苄
青霉素不能抑制农杆菌的过长，几天后叶片外植体
褐化死亡。因此农杆菌菌液侵染 10 min 是适宜的农
杆菌侵染时间。
表 2 不同激素配比对试管苗生根的影响
基本培养基 激素NAA浓度（mg/L） 生根率（%） 平均根数（条） 根长（cm） 株高（cm）
1/2MS
0 100 6.09±1.76 4.09±0.79 1.97±0.17
0.1 100 4.21±1.59 3.36±0.43 1.56±0.20
0.2 100 4.48±1.96 3.36±0.37 1.55±0.14
表 3 不同浓度硫酸卡那霉素对叶盘分化的影响
硫酸卡那霉素浓度
（mg/L）
分化率
（%） 叶盘生长情况
0（CK） 92.76 叶片膨大有大量不定芽长产生
5 0 叶片稍微膨大，中央绿色，边缘黄化
10 0 叶片黄化
15 0 叶片黄化，边缘白化
20 0 叶片黄化，边缘白化现象明显
25 0 叶片大部分出现白化，黄化较少
30 0 叶片白化
35 0 叶片白化
2.2.2 农杆菌侵染时间对不定芽生长的影响 农杆
菌侵染时间对植物遗传转化体系有重要影响，侵染
时间过短不能让农杆菌很好地侵染叶片外植体切口
边缘，而侵染时间过长会导致植物细胞受损，严重
可导致叶片外植体死亡。因此有必要对菊花品种‘小
林静’的农杆菌侵染时间进行选择。
从表 4 可以看出，农杆菌菌液侵染 5 min 的‘小
林静’叶片切口没有明显的菌落产生，叶片保持绿
色，没有损伤和褐化现象产生，这表明农杆菌侵染
时间过短不容易侵染叶片伤口，较难产生菌落，降
低了 T-DNA 与外植体叶片伤口接触的机会，转接到
分化培养基以后，产生的抗性愈伤和抗性芽都很少。
农杆菌菌液侵染 10 min 的‘小林静’叶片切口周围
表 4 农杆菌侵染时间对遗传转化的影响
侵染时间（min） 菌落生长情况 叶片损伤程度
5 有少许菌落产生 叶片无损伤
10 菌落清晰可见，在叶片周围分布较均匀 少部分叶片出现损伤
15 菌落清晰可见，少部分菌落成片状，有过长现象 叶片损伤出现
2.2.3 菊花品种‘小林静’抗性苗的获得 对菊花
品种‘小林静’的 406 个叶片外植体采用农杆菌介
导的叶盘转化法进行转化，共培养 2 d 后转接到抗
生素筛选培养基中，培养 35 d 左右发现未转化的外
植体逐渐褐化死亡，长出的芽点也逐渐白化死亡。
产生抗性愈伤的外植体为 151 个，占外植体总数的
37.19%。抗性愈伤继续在筛选培养基中发育，产生
抗性芽 15 个，抗性芽生成率 3.69%。当抗性芽长至
1 cm 左右时将其转接到含有抗生素的 MS 固体培养
基上，经过 15-20 d 的筛选培养，一部分抗性芽逐
渐黄化至白化死亡，剩余的抗性芽继续生长并生根。
3 讨论
3.1 菊花品种‘小林静’再生体系的建立
建立再生体系首先要建立无菌苗的组培体系。
本试验选取中国传统菊花品种‘小林静’为试验材料，
选取茎段作为外植体，利用 70% 酒精 +1% NaClO 联
合消毒的方法，达到对外植体良好的消毒效果。菊
花品种‘小林静’茎段利用这种方法消毒在初代培
2012年第4期 91姜宁宁等 ：中国传统菊花品种‘小林静’再生及转化体系的建立
养过程中长势良好，出芽率维持在 62.5% 左右，消
毒剂对外植体毒害作用小，为其再生体系的建立提
供了基础。
本试验采用两因素三水平的激素配比试验，对
‘小林静’叶片外植体进行不定芽诱导，建立了‘小
林静’稳定高效离体再生体系。试验结果发现菊花
品种‘小林静’具有较高的不定芽诱导分化率，再
生率最高为 92.76%，平均每个外植体产生的不定
芽数最高可达 2.3 个。经过重复试验，该体系稳定、
再生周期短、分化率高、过程简洁、可以满足建立
其遗传转化体系的要求。
本研究还发现，选用不同苗龄及不同部位的无
菌苗叶片做外植体，其分化频率及分化时间均受不
同程度的影响。其中 20-30 d 左右的无菌苗不定芽
分化能力强，随着苗龄增长，叶片不定芽分化能力
降低。相同苗龄不同部位的叶片生理状态不同 ：叶
片浓绿、质地较厚的叶片不定芽分化能力强 ；而叶
片嫩绿、质地较薄的叶片不定芽分化能力弱。因此
在试验过程中应选择 20-30 d 苗龄、植株中上部的
叶片做外植体以提高不定芽的分化能力并缩短不定
芽的分化时间。此外，高浓度的细胞分裂素也会抑
制不定芽的分化［15］。
褐化现象是组培过程中较常见的一种现象，同
时也是组培过程中亟需解决的难题。不同植物、同
一植物的不同品种在组织培养过程中褐化程度均不
同［16］。本试验发现菊花品种‘小林静’褐化程度较轻，
这可能与其基因型有关，但仍存在轻度褐化现象。6
种不同的不定芽分化培养基中，NAA 浓度越高，褐
化现象越明显。
试管苗玻璃化是在植物组织培养中非常普遍的
一种试管苗畸形的现象，草本及木本植物材料均可
发生［17］。试管苗玻璃化与激素［18, 19］、阳离子和凝
胶剂的浓度［20］、培养环境［21］等因素有关。本研究
发现在 6-BA 为 3 mg/L，NAA 分别为 1.5 mg/L 和 2.0
mg/L 时部分叶片出现了玻璃化现象。在试管苗的建
立过程中，MS 培养基中从外植体茎段叶腋处长出的
小芽长势良好，没有玻璃化现象，但是在不定芽分
化过程中，随着细胞分裂素浓度升高，玻璃化现象
从无到有，因此本试验中的玻璃化现象主要与激素
浓度有关。
3.2 菊花品种‘小林静’转化体系的建立
3.2.1 抗生素在遗传转化中的作用 抗生素抗性选
择是植物遗传转化体系中关键的一步，利用抗生素
淘汰非转化细胞从而获得转化植株，不同的植物材
料、品种和外植体类型对不同的抗生素有不同的敏
感性［22］。抗生素抗性选择是淘汰非转化细胞或植
株的过程，其作用原理是转化植株具有抗性，可以
在含有抗生素的分化筛选培养基中生长 ；而非转化
植株由于不含抗性不能在此培养基中生长，从而达
到筛选转化植株的目的。不同菊花品种、不同部位
对硫酸卡那霉素的敏感性不同。叶片外植体对硫酸
卡那霉素的敏感浓度一般为 10-100 mg/L 之间［3, 23］，
而茎段外植体对硫酸卡那霉素较为敏感，一般为
5-50 mg/L 之间［24］。本试验发现，菊花品种‘小林静’
对硫酸卡那霉素非常敏感，10 mg/L 硫酸卡那霉素就
可以抑制叶片外植体愈伤的产生和不定芽的分化。
3.2.2 农杆菌侵染时间和共培养时间在遗传转化中
的作用 本试验采用的农杆菌菌株为 C58C1，其特
点是生长速度快、不结球、易于操作和侵染能力
强［22］。侵染时间过长或过短都会对遗传转化造成
不利的影响。农杆菌和外植体的共培养时间是遗传
转化中的重要一环，T-DNA 的转移整合是在共培养
时期完成的。因此合适的共培养时间不仅可以使外
源基因整合到受体植物中，还可以提高遗传转化效
率［25］。研究表明，菊花的共培养时间多为 2 d 暗培
养，2-4 d 光照培养，这样可以提高遗传转化效率［5］。
本试验采用 2 d 暗培养，形成的菌丝分布均匀，后
期的抗性芽生长状况良好，适宜用作菊花品种‘小
林静’的最佳共培养时间。
4 结论
本研究以中国传统菊花品种‘小林静’叶片
为外植体，建立了‘小林静’较好的再生体系及遗
传转化体系。‘小林静’叶盘最适不定芽分化培养
基为 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA ；试管苗最
佳生根培养基为 1/2MS。采用根癌农杆菌 C58C1 介
导的叶盘转化法预培养最佳培养基为 MS+2.0 mg/L
6-BA+1.5 mg/L NAA，而最佳筛选培养基为 MS+2.0
mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+10 mg/L 硫酸卡那霉素 +
400 mg/L 羧苄青霉素。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期92
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（责任编辑 马鑫）