全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):170-176
收稿日期 ：2014-09-19
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31201938），武汉市晨光计划（201150431078），武汉市农科院英才计划（YC201101）
作者简介 ：阮征，男，高级兽医师，研究方向 ：动物疫病防控 ；E-mail ：paper2006@sina.cn
并列第一作者 ：王莲芳，女，畜牧师，研究方向 ：动物科学技术与推广 ；E-mail ：hygene@qq.com
通讯作者 ：黄海军，男，博士，副研究员，研究方向 ：动物生物技术与疫病防控 ；E-mail ：hhj@stemcell8.com
新生猪骨髓间充质干细胞衍生细胞的分离、培养及
生物学特性分析
阮征1，2  王莲芳1  胡修忠1  吴建英2  张四化2  代长云2  华娟1  夏瑜1   
胡小明3  李杰1  黄海军1，4
（1. 武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉 430208 ；2. 武汉市重大动物疫病防控中心，武汉 430023 ；3. 华中农业大学猪遗传育种农业部重点
实验室 & 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070 ；4. 武汉市畜牧兽医局，武汉 430023）
摘 要 ： 利用骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）治疗疾病已经逐渐成为现实，但是作为被移植的种
子细胞，BMSCs 体外传代能力非常有限，种子细胞来源极为贫乏。本研究通过差速贴壁筛选的方法分离出一种猪 BMSCs 的衍生细
胞株，命名为猪骨髓间充质干细胞衍生细胞（Bone mesenchymal stem-derived cells，BMSDCs）。分别对 BMSDCs 与 BMSCs 细胞进行
细胞生物学特性分析，探讨其体外诱导分化特性，并应用流式细胞术测定细胞表面标记物。结果表明，BMSC 和 BMSDCs 细胞倍
增时间分别为 31.3 h 和 30.3 h，平均传代时间分别为 3-5 d 和 2-3 d ；两种细胞均阳性表达 CD34、CD90，阴性表达 CD44、CD45 ；
经体外诱导后均可分化为成脂细胞和成肌细胞。在传代能力上，前者可传代 15 至 20 次，后者可长期传代（200 次以上）且维持正
常染色体特征。研究认为在适宜的实验条件下，体外培养的猪骨髓间充质干细胞的衍生细胞——BMSDCs 能够稳定生存增殖并维
持 BMSCs 多向分化潜能，可作为组织工程的理想种子细胞。
关键词 ： 骨髓间充质干细胞 ；衍生细胞 ；猪 ；生物学特性 ；组织工程
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.027
Isolation，Culture and Characterization of Derived Cells from
Neonatal Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells
Ruan Zheng1，2 Wang Lianfang1 Hu Xiuzhong1 Wu Jianying2 Zhang Sihua2 Dai Changyun2 Hua Juan1
Xia Yu1 Hu Xiaoming3 Li Jie1 Huang Haijun1，4
（1. Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science，Wuhan 430208 ；2. Wuhan Animal Disease Prevention and Control Center，Wuhan
430023 ；3. Key Laboratory of Swine Breeding and Genetics of Ministry of Agriculture & Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics，
Breeding and Reproduction of Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070 ；4. Wuhan Bureau of Animal
Husbandry and Veterinary，Wuhan 430023）
Abstract: Recently it has become possible to use bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）in the clinical treatment of certain
diseases. However, BMSCs, the seed cells used in transplantation, are limited in vitro proliferation capability and can only be obtained from
very few sources. In order to acquire a substitute for BMSCs, the method of differential velocity adherent screening was used in this study to
isolate a derived strain of porcine BMSCs, named bone marrow mesenchymal stem-derived cells（BMSDCs）. The biological characteristics
of BMSDCs and BMSCs cells were compared by continuous morphological imaging by inverted microscope, and the growth curves of both cells
were monitored by the MTT method. Furthermore, their characteristics of differentiation in vitro were examined, and flow cytometry was used to
measure cell surface markers. Our results suggest that the doubling times of BMSCs and BMSDCs are 31. 3 h and 30. 3 h, respectively, and the
average passaging time is 3-5 d and 2-3 d, respectively. Cultured BMSCs and BMSDCs are both positive for CD34 and CD90 and negative for
2015,31(6) 171阮征等：新生猪骨髓间充质干细胞衍生细胞的分离、培养及生物学特性分析
骨 髓 间 充 质 干 细 胞（Bone mesenchymal stem
cells，BMSCs）是一种存在于骨髓网状间质内的非
造血干细胞，具有分化成各种间叶组织的功能。近
年来研究表明，猪 BMSCs 体外分离培养后，在一定
的诱导条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、
脂肪细胞、心肌细胞等定向分化的能力［1-3］，且取
材方便，免疫耐受性、遗传背景稳定及易于转染外
源基因等。因此，猪 BMSCs 成为目前倍受关注的细
胞及组织工程的干细胞材料［4-6］。将猪 BMSCs 诱导
成上述目的细胞后，用于临床骨损伤、肌肉损伤和
基因治疗以及在防治肥胖症领域是一个非常有临床
应用前景的研究课题。体外成功分离猪 BMSCs 及诱
导成功是其应用的前提。但是，文献［1-3］表明，猪
BMSCs 在实验室条件下培养传代次数非常有限，不
利于其广泛应用于临床治疗疾病。本研究分离了猪
BMSCs 并进行了体外向成骨细胞、成脂细胞及成肌
细胞的定向分化研究。此外，利用差速贴壁法从第
3 代猪 BMSCs 衍生细胞群中分离出一种亚型细胞，
并建立了可稳定传代的细胞系，经细胞生物学分析
证实其仍然具备标准 BMSCs 干细胞特性，可为后续
研究及细胞移植治疗提供充足的细胞材料。
1 材料及方法
1.1 材料
低糖 DMEM 培养基（GIBICO 公司）、10% 胎牛
血清（GIBICO 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、
Ficoll 淋巴细胞分离液（上海士锋生物科技有限公司，
比 重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 单
克隆抗体和 FITC 标记的二抗（Lab vision）、MTT（上
海谱振生物科技有限公司）、荧光倒置相差显微镜
（OLYMPUS）、细胞培养箱（SanYo 公司）、流式细
胞仪（FACSCalibur，BECTON DICKINSON 公司，美
国）及超净工作台等、PCR 仪（ABI 公司）。
普通级新生长白仔猪（10 头，体质量 1.5 kg-5
kg）由武汉市畜牧兽医科学研究所试验猪场提供。
1.2 方法
1.2.1 猪 BMSCs 的分离纯化与传代培养 将猪体
表清洗干净并用酒精棉充分消毒，放血致死，置于
75% 酒精中浸泡 10 min，分离四肢皮肤及肌肉组织。
无菌条件下取出股骨和胫骨，切除两侧干骺端，用
灭菌钢锯将其锯成两段，再用钢钳钳破骨腔，挤压
钢钳使骨髓液流出，收集骨髓液于无菌离心管。吸
取骨髓液缓慢滴加于等量 Ficoll 淋巴细胞分离液（密
度 1.077 g/mL）上，以 1 000 g 的速度离心 20 min，
分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另
一离心管，PBS 洗涤，2 000 r/min 离心 5 min，反复
2 次，弃上清，悬浮于含 15% 胎牛血清的 DMEM 培
养基（青霉素 100 U/mL，链霉素 100 U/mL），轻轻
吹打均匀，接种到 25 cm2 培养瓶，置 37℃，5% CO2
及饱和湿度培养箱中培养。4-6 d 首次换液，以后每
3 d 或 4 d 换液 1 次，14-21 d 细胞生长融合达 80%
以上，以 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1∶3 比例传代
培养。
1.2.2 BMSCs 衍 生 细 胞 的 分 离 与 培 养 BMSCs 生
长融合达 80% 以上，以 0.25% 胰蛋白酶消化细胞，
利用差速贴壁法从中分离出一种短梭形的亚型细
胞，命名为猪骨髓间充质干细胞衍生细胞（Bone
mesenchymal stem-derived cells，BMSDCs）。
1.2.3 BMSCs 和 BMSDCs 细胞倍增时间的确定 取
第 3 代 生 长 良 好 的 细 胞， 用 0.25% 胰 蛋 白 酶 消
化 后 用 含 10% FBS 的 DMEM 培 养 基 制 备 细 胞 悬
液，以每孔 103-104 个细胞于不同时相分别接种
于 8 块 96 孔 板 中 的 8 孔， 每 孔 体 积 200 μL， 置
于 37℃、5% CO2 及 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 孵 育。 于
第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5
mg/mL）20 μL，37℃ 继 续 孵 育 4 h 后， 每 孔 加 入
150 μL 二甲基亚砜，振荡 10 min 后选择 490 nm 波
CD44 and CD45. Both BMSCs and BMSDCs can differentiate into adipocytes and myoblasts by induced differentiation in vitro. Concerning their
passaging abilities, the former can have 15 to 20 passages in vitro, whereas latter can have a longer period of time（more than 200 passages）
while normal karyotypes are still maintained. We conclude that, under certain experimental circumstances, cultured porcine BMSDCs in vitro can
survive and proliferate while maintaining multi-directional differentiation potential of BMSCs, and potentially it can be an ideal type of seed cell
for tissue engineering.
Key words: bone marrow mesenchymal stem cell ；derived cell ；porcine ；biological characteristics ；tissue engineering
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6172
长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以
时间为横轴，光吸收值 A（OD）为纵轴绘制细胞
生长曲线。根据计算公式 ：DT = t ×［lg2/（lgNt-
lgN0）］ 确 定 BMSCs 和 BMSDCs 细 胞 的 倍 增 时 间。
1.2.4 BMSCs 和 BMSDCs 细胞的鉴定
1.2.4.1 化学染色 碱性磷酸酶（ALP）染色 ：细胞
接种于盖玻片上培养，待长满后，细胞爬片用体积
分数 4% 多聚甲醛固定细胞，进行 ALP 染色，即先
用 PBS 洗细胞 3 遍，加入 ALP 染液，室温孵育 20-
30 min，镜下观察，检测成骨细胞，阳性细胞呈紫
红色，每张载玻片随机选择 3 个视野计数 500 个细胞，
计算阳性率。
PAS 染色：细胞接种于盖玻片上培养，待长满后，
细胞爬片用 0.5% 高碘酸水溶液氧化 10 min。流水冲
洗数分钟蒸馏水换洗两次。雪夫试剂暗处浸染 15-
30 min。流水冲洗 10 min。苏木素复染核 1-2 min。
95% 乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶
封固。
瑞氏-姬姆萨染色 ：吸取瑞氏-姬姆萨染液滴至
玻片盖满标本，静置 30 s，再加入 PBS 2-3 倍体积，
染色 1-3 min，倾去染液，水洗，封片。
1.2.4.2 PCR 鉴定 选择生长状态良好的猪 BMSCs
和 BMSDCs 细胞，参考文献［7］的方法，分别提
取 细 胞 总 RNA 并 反 转 录 成 cDNA 进 行 PCR 检 测。
PCR 反 应 体 系 为 50 μL 体 系， 其 中 包 括 ddH2O 10
μL，dNTPs 8 μL（浓度为 10 mmol/L），2×Buffer 25
μL，cDNA 模 板 4 μL， 上 下 游 引 物 分 别 添 加 1 μL
KOD DNA 聚合酶 1 μL。PCR 反应程序 ：94℃预变
性 2 min ；98℃ 变 性 10 s， 退 火 30 s，68℃ 延 伸 1
kb/30 s，35 个循环。PCR 反应的引物和条件见表
1。PCR 反应结束后，取 10 μL PCR 扩增产物，加
0.5 μL 上样缓冲液（10×Loading Buffer），混匀后小
心点样于 0.7％的琼脂糖凝胶胶孔中，同时点 5 μL
DL1k Marker 作为参照，在 150 V 电压条件下，电泳
40 min。电泳结束后，在加有 EB 的缓冲液中染色
15 min，取出用干净的水洗去表面的 EB，然后利用
表 1 PCR 引物
基因 引物序列（5-3） 片段大小 /bp 退火温度 /℃
GAPDH ctcaacgaccacttcgtcaa ；tctgggatggaaactggaag 233 64.0
Sox2 cggcggaaaaccaagacg ；ggtaaccacgggggggct 432 51.8
Pou5F1 acaaggagaagctggagccg ；cgcggaccacatccttctct 453 51.8
Nanog cttattcaggacagccctgattcttc ；aagacggcctccaaatcactg 614 53.0
Lin28 atggggttcggcttcctg ；ttgtagcacctgtctcct 272 59.0
CD29 tgcctttttgaccttttcctcgtga ；cccctcccaactgacttttcctat 361 54.0
CD90 gacatcaaggtcctctac ；gaggtgttctggattagc 170 48.9
G-BOX 凝胶成像系统观察电泳结果。
1.2.4.3 细胞免疫化学 于超净工作台内，打开 6
孔板，放置灭菌盖玻片。将细胞悬液滴加至盖玻片
上，置于 CO2 浓度为 5% 的培养箱中于 37℃培养至
细胞固着（约 2 h）。加入 2 mL 细胞培养液继续培养
约 6 h。倒去培养基，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min。4%
多聚甲醛固定 30 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min。爬
片稍甩干后用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的
位置画圈（防止抗体流走），加 50-100 μL 破膜工作
液，室温孵育 10 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min。去
除 PBS，用 PBS 按一定比例稀释好的一抗（CD34，
rabbit，1∶50 ；CD44，mouse，1∶100 ；CD90，
mouse，1∶100）覆盖组织。爬片平放于冰箱内 4℃
孵育过夜。爬片用 PBS（pH7.4）洗涤 3 次，每次 5
min。去除 PBS 后在圈内滴加与一抗相应种属的荧光
二抗（cy3 标记山羊抗兔 1∶100 ；cy3 标记山羊抗小
鼠 1∶100）覆盖组织，避光室温孵育 50 min。PBS
（pH7.4）洗涤 3次，每次 5 min。去除 PBS 后在圈内
滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10 min。用 PBS（pH
7.4）洗涤 3 次，每次 5 min。爬片稍甩干后将有细
胞的一面朝下用抗荧光淬灭封片剂将玻片封固在载
玻片上封片。切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并
采集图像。
1.2.4.4 流式细胞术测定细胞表面标记 取第 3 代
2015,31(6) 173阮征等：新生猪骨髓间充质干细胞衍生细胞的分离、培养及生物学特性分析
BMSCs，用 0.25% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 离心
5 min，PBS 洗涤 2 次，调节细胞浓度为 1×106/mL，
分为 4 份，分别滴加人抗兔 CD34、CD44、CD45、
CD90 的一抗（以 PBS 代替一抗作为阴性对照），室
温反应 30 min 后，PBS 洗涤 2 次，滴加 CY3 标记
的抗兔 IgG，避光反应 15 min 后，经流式细胞仪检
测细胞表面 CD34、CD44、CD90 阳性细胞的表达。
1.2.4.5 体外诱导分化 选择生长状态良好的猪
BMSCs 和 BMSDCs 细 胞， 用 2.5 g/L 胰 蛋 白 酶 消 化
3 min，制成单细胞悬液，以 1×10 mL 密度接种于
5 个培养皿中，每皿预置 3 张载玻片，待细胞长至
50% 汇合时进行细胞诱导。成肌诱导 ：10%FBS+10
μmol/L 5- 氮胞苷诱导 21 d。成脂诱导 ：10%FBS+1
μmol/L 地塞米松 +0.5 mmol/L IBMX+10 μg/mL 胰岛素
+200 μmol/L 吲哚美辛（2 d），10%FBS+1 μmol/L 地
塞 米 松 +0.5 mmol/L IBMX+10 μg/mL 胰 岛 素（2 d），
10%FBS+10 μg/mL 胰岛素（2 d），10%FBS 培养基。
肉眼可见明显脂滴，用油红 O 进行染色［7］。
2 结果
2.1 猪原代BMSCs的形态及培养特征
原代培养中，可见细胞以分散、克隆集落方式
增殖（图 1-A1）；第 1-3 天细胞大部分呈圆形、椭
圆形生长 ；第 3-7 天贴壁细胞增多，并逐渐延展生
长为多角形、星形或梭形；7-21 d 贴壁细胞明显增多，
并有集落形成，相邻集落融合成片达 80% 以上，细
胞排列呈漩涡状，细胞间界限不清，细胞呈长梭形；
14-21 d 后，原代细胞生长汇合。
2.2 猪BMSCs的传代培养及细胞生物学特性
传代后猪 BMSCs 2-4 h 迅速贴壁，8 h 大部分贴
壁，10 h 细胞全部贴壁，并开始分裂增殖。细胞呈
均匀分布，形态呈细长梭形，并沿一定方向排列（图
1-A2）。细胞倍增时间为 31.3 h，2-5 d 细胞铺满瓶底，
即可消化传代。开始时大多为细长梭形，增殖速度快，
细胞传代周期缩短，待传至第 7-8 代时，细胞铺展
得宽大而扁薄，增殖速度减慢，细胞传代周期延长，
细胞内颗粒物质增多。
PCR 检 测 表 明，BMSCs 表 达 Sox2、Nanog、
CD90 和 CD29 基因，Pou5f 基因表达较弱，不表达
Lin28（图 1-D）。细胞 ALP、PAS 和 Gimsa 染色阳性
（图 1-B）。细胞免疫荧光化学分析，BMSC 细胞表达
CD44 和 CD90，不表达 CD34、CD45（图 1-C）。流
式检测，CD44 和 CD90 的表达比例分别达到 89.77%
和 89.53%，CD34、CD45 的表达分别为 0.9% 和 1.3%
（图 1-E）。体外适当诱导可分化为成肌细胞和脂滴
（图 1-F）。
2.3 猪BMSDCs细胞系的建立及细胞生物学特性
在我们分离的猪 BMSCs 的培养中，发现了两种
主要形态的细胞（图 2-A1）。利用差速贴壁法我们
纯化了短梭状生长的细胞，命名为猪 BMSDCs 细胞
（图 2-A2）。细胞倍增时间为 30.3 h，2-3 d 细胞铺满
瓶底，即可消化传代。
PCR 检测结果表明，BMSDCs 细胞表达 Sox2、
Pou5f、CD90 和 CD29 基 因，Nanog 基 因 表 达 较
弱， 不 表 达 Lin28（ 图 2-D）。 细 胞 ALP、PAS 和
Gimsa 染色阳性（图 2-C）。细胞免疫荧光化学分析，
BMSDCs 细 胞 表 达 CD44 和 CD90， 不 表 达 CD34、
CD45（图 2-B）。流式检测，CD44 和 CD90 的表达
比 例 分 别 达 到 88.92% 和 81.47%，CD34、CD45 的
表达分别为 1.9% 和 1.1%（图 2-E）。体外适当诱导
可分化为成肌细胞和脂滴（图 2-F）。
3 讨论
BMSCs 体外培养的生长特点和生物学特性已有
较多相关文献 报道。BMSCs 在骨髓中的含量极少，
约占有核细胞的 0.001%-0.01%［8］，如何获得高纯
度、足量的 BMSCs，成为 BMSCs 应用研究的关键。
目前常用于 BMSCs 分离方法有贴壁筛选法［9］、密度
梯度离心法［10，11］、免疫磁珠法［12］、流式细胞仪分
离法［13］及 Hung 等［14］研究的特制微孔培养板筛选法。
特制微孔培养板筛选法，可以快速有效获取相对同
质的 BMSCs，利用这种方法可以不用考虑去除红细
胞，但是结果不稳定，目的细胞不易大量获取［15］。
免疫磁珠分离和流式细胞术筛选的方法，优点是可
以获得纯度较高的细胞，但对细胞活性影响较大，
而且操作复杂，成本较高，获得的细胞数目又非常
少［16］。密度梯度离心法主要是根据骨髓中各细胞成
分比重的不同，利用淋巴细胞分离液提取单核细胞，
操作上较贴壁筛选法烦琐，得到的细胞数也比后者
少，但此方法可排除大量红细胞对 BMSCs 贴壁的影
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6174
响，因而被广泛采用［17］。在本研究中，我们也采用
过全骨髓法成功分离出目的细胞。全骨髓法操作简
便，将获得的骨髓直接培养，骨髓中的造血干细胞
能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进 BMSCs 贴壁
生长，同时根据 BMSCs 的贴壁生长特性，通过更换
培养液逐步去除漂浮生长的造血干细胞，获得纯度
较高的 BMSCs。
BMSCs 在生物医学领域有着广泛的应用，然
而 BMSCs 表面标志物由于细胞分离、培养方法和
培 养 时 间 等 的 不 同 而 有 差 异。Pittenger 等［18］ 认
为 人 BMSCs 阳 性 表 面 标 志 物 是 SH2（CD105）、
SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、
CD124，阴性表面标志物是 CD45、CD34 和 CD14
等造血细胞标志。Hung 等［14］采用带孔培养板的
装置培养分离得到人 BMSCs，培养至第 2 代时阳性
表 面 标 志 是 CD90、CD44、CD29、CD51， 阴 性 表
1 2 3 4 5 6 7 8
A1
A
C
B
PAS Gimsa ALP
D
104
103
102
101
100
0 200 400
FSC-H
F1 F2
600 8001000
CD34
CD44
E
CD90
FL
2-
H
CD45 F
Control
A2
104
103
102
101
100
0
FSC-H
1000
FL
2-
H
A ：猪 BMSCs 细胞形态学特征，A1 ：猪原代 BMSCs（40×），A2 ：猪 BMSCs 传代细胞（40×）；B ：猪 BMSCs 细胞化学染色（100×）；C ：猪 BMSCs
细胞免疫荧光化学染色鉴定细胞表面标记物 CD34、CD44、CD45 和 CD90（100×）；D ：猪 BMSCs 主要特异基因表达情况，1 ：Marker（DL2000），2 ：
GAPDH（233 bp），3 ：Sox2（432 bp），4 ：Pou5f（453 bp），5 ：CD29（361 bp），6 ：CD90（170 bp），7 ：Lin28（272 bp），8 ：Nanog（614 bp）；E ：猪
BMSCs 细胞流式细胞术检测细胞表面标记物 CD44 和 CD90 ；F ：猪 BMSCs 细胞诱导成肌和成脂分化（100×），F1 ：成肌分化，F2 ：成脂分化
图 1 猪 BMSCs 细胞生物学特性
2015,31(6) 175阮征等：新生猪骨髓间充质干细胞衍生细胞的分离、培养及生物学特性分析
面 标 志 是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。 研 究 者
们应用不同的分离扩增方法及不同的方式表达细胞
特性，使得对一些研究结果的比较变得困难，阻碍
了其在这些领域的应用［19］。因此在 2005 年，ISCT
（the International Society for Cellular Therapy）定义了
BMSCs 的最低标准 ：首先，BMSCs 在标准培养条
件下必须具备贴壁生长的特点 ；其次，BMSCs 表达
CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或
CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表达
阴性 ；第三，BMSCs 在体外能分化为成肌细胞或脂
肪、成骨等多种细胞［20］。本研究结果表明，获得的
BMSCs 和 BMSDCs 细胞均符合骨髓间充质干细胞的
特点。
实验中还发现，获取的 BMSCs 开始贴壁生长时，
呈短梭形或多角形，具有长短不等的数个细胞突起；
在细胞密集区表现为涡旋状，随着培养时间的延长，
相互重叠成多层。但是 BMSCs 的传代次数非常有限，
最高传代至 18 代。值得高兴的是，我们最终获得
CD45
100
0 1000
FSC-H
101
102
FL
1-
H
103
104CD90
CD44
D 1 2 3 4 5 6 7 8
CD34
B
A
A1 A2
PAS
C
Gimsa ALP
Control
F
E
F1 F3F2
100
0 1000
FSC-H
101
102
FL
1-
H
103
104
A ：猪 BMSDCs 细胞形态学特征，A1 ：猪原代 BMSCs（40×），A2 ：猪 BMSCs 传代细胞（40×）；B ：猪 BMSDCs 细胞免疫荧光化学
染色鉴定细胞表面标记物 CD34、CD44、CD45 和 CD90（100×）；C ：猪 BMSDCs 细胞化学染色（100×）；D ：猪 BMSDCs 主要特异
基因表达情况，1：Marker（DL2000），2：GAPDH（233 bp），3：Sox2（432 bp），4：Pou5f（453 bp），5：CD90（170 bp），6：Nanog（614
bp），7 ：CD29（361 bp），8 ：Lin28（272 bp）；E ：猪 BMSDCs 细胞流式细胞术检测细胞表面标记物 CD44 和 CD90 ；F ：猪 BMSDCs
细胞诱导成肌和成脂分化（100×），F1 ：成肌分化，F2 ：肌细胞胞核 DAPI 染色，F3，脂滴油红 O 染色
图 2 猪 BMSDCs 细胞生物学特性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6176
了由 BMSCs 衍生而来的亚型细胞，其生长形态类似
于成纤维细胞，也具备标准 BMSCs 的特性，而且可
以长期传代培养，生物学性状稳定（至发稿前该细
胞已经传代超过 200 次），为后期基因工程细胞移植
在动物疫病防控领域的应用提供了试验材料。关于
本研究获得的 BMSCs 和 BMSDCs 两者之间的细胞生
物学特性存在差异，可以理解为衍生细胞 BMSDCs
是 BMSCs 向成体细胞分化的中间型分化产物，但是
BMSCs 细胞具体的分化机制还有待于进一步研究。
4 结论
本研究从第 3 代猪 BMSCs 衍生分化的细胞群
中分离出一种亚型细胞，并建立了可长期稳定传代
的细胞系，经细胞生物学分析证实其仍然具备标准
BMSCs 细胞特性，可为后续研究 BMSCs 细胞分化机
制及细胞移植治疗提供充足的细胞材料。
参 考 文 献
［1］Jiang YH, Jahagirda BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of
mesenchymal stem cells derived from adult marrow［J］. Nature,
2002, 418（4）：41-49.
［2］Wagers AJ, Weissman IL. Plasticity of adult stem cell［J］. Cell,
2004, 116（3）：639-648.
［3］Krause DS, Theise ND, Colletor MI, et al. Multi-organ, multi-lineage
engraftment by a single bone marrow-derived stem cell［J］. Cell,
2001, 105（5）：367-377.
［4］Strauer B, Komowski R. Stem cell therapyin perspective［J］.
Circulation, 2003, 107（7）：929-934.
［5］Horwitz EM. Stem cell plasticity ：a new image of the bone marrow
stem cell［J］. Curr Opin Pediatr, 2003, 15（1）：32-37.
［6］屈长青 , 张国华 , 赵丽丽 , 杨公社 . 猪脂肪基质细胞成骨与成脂
分化潜能的研究［J］. 中国生物工程杂志 , 2005, 25（11）：37-
40.
［7］ 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔著 DW, 黄培堂 , 等 , 译 . 分子克隆实验指
南［M］. 第 3 版 . 北京 ：科学出版社 , 2002.
［8］Wakitani S, Saito T, Caplan AI. Myogenic cells derived from rat
marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine［J］.
Muscle Nerve, 1995, 18 ：14-17.
［9］Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage paential
adult human mesenchymal stem cells［J］. Science, 1999, 284
（5411）：143-147.
［10］Lisignoli G, Remiddi G, Cattini L, et al. An elevated number of
differentiated osteoblast colonies can be obtained from rat bone
marrow stromal cells using a gradient isolation procedure［J］.
Connect Tissue Res, 2001, 42（1）：49.
［11］Zhang B, Wang F, Deng L, et al. Isolating and culturing rat marrow
mesenchymal stem cells and studing their phenotypical and
functional properties［J］. Journal of West China University of
Medical Sciences, 2003, 34（4）：738.
［12］Encina NR, Billotte WG, Hofmann MC. Immunomagnetic isolation
of osteoprogenitors from human bone marrow stroma［J］. Lab
Invest, 1999, 79（4）：449 -457.
［13］Zohar R, Sodek J, Mc Culloch CA. Characterization of stromal
progenitor cells enriched by flow cytometry［J］. Blood, 1997, 90
（9）：3471-3481.
［14］Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL, et al. Isolation and characterization
of size-sieved stem cells from human bone marrow［J］. Stem
Cells, 2002, 20（3）：249-258.
［15］赵嫣 , 史剑慧 , 葛均波 . 骨髓源性干细胞移植治疗缺血性心脏
病研究进展［J］. 临床心血管病杂志 , 2004, 20（1）：52-54.
［16］张本斯 , 王凡 , 邓力 , 等 . 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养与
表型和功能特点［J］. 四川大学学报：医学版 , 2003, 34（4）：
738-741.
［17］蒋雯 , 林国生 , 李庚山 , 等 . 兔骨髓间充质干细胞自体移植及
血管新生修复梗死心肌的实验研究［J］. 岭南心血管病杂志 ,
2003, 9（5）：354-358.
［18］Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage paential
adult human mesenchymal stem cells［J］. Science, 1999, 284
（5411）：143-147.
［19］ Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for
defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International
Society for Cellular Therapy position statement［J］. Cytotherapy,
2006, 8（4）：315-317.
［20］Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M, et al. Clarification of the
nomenculture for MSC ：the International Society for Cellular
Therapy position statement［J］. Cytotherapy, 2005, 7 ：393-395.
（责任编辑 李楠）