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复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的影响
梁广胜1，2，3， 殷嫦嫦1* ， 殷 明2， 邬亚华1， 李辉敏1， 刘玉亮2，3， 魏强强2，3
(1. 九江学院医学部分析检测实验室，江西 九江 332000;2. 南昌大学第二附属医院骨一科，江西 南昌
330006;3. 南昌大学研究生院医学部，江西 南昌 330006)
收稿日期:2013-06-11
基金项目:采用常规实验室可用的药理研究模型系统研究复叶耳厥抑制 HIV-1 复制的有效成分 (81160536)
作者简介:梁广胜 (1986—) ，男，硕士生，医师，研究方向:脊柱和骨关节疾病，骨科疾病。Tel:13698416062，E-mail: lgs-
19860322@ 163. com
* 通信作者:殷嫦嫦，女，博士，硕士生导师，教授，研究方向:生物化学与临床生物化学。Tel:13607920508，E-mail:yin-
changchang112@ 163. com
摘要:目的 研究复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化的影响。方法 采用全骨髓差速贴壁法体外分
离、纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞;取 P3 代细胞，分实验组和对照组，用流式细胞仪测定细胞表面标志物鉴定
细胞，采用 MTT法检测细胞生长曲线。显微镜下观察两组的细胞形态和组织化学染色的钙化结节;速率法测定碱性
磷酸酶 (ALP)活性和 ＲT-PCＲ检测骨髓间充质干细胞诱导分化过程中骨桥蛋白和 I型胶原的 mＲNA表达来鉴定成骨
作用。结果 体外培养的细胞表达表面标志;复叶耳蕨总黄酮对骨髓间充质干细胞内 ALP 活性增高并形成明显钙结
节;PCＲ结果显示复叶耳蕨总黄酮上调骨桥蛋白和 I 型胶原的 mＲNA 表达。结论 20 μg /mL 复叶耳蕨总黄酮可促进
大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为成骨样细胞。
关键词:复叶耳蕨总黄酮;骨髓间充质干细胞;增殖;碱性磷酸酶;成骨分化
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2014)03-0456-06
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 03. 004
Effect of total flavonoids from Arachniodes exilis on proliferation and osteogenic
differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells
LIANG Guang-sheng1，2，3， YIN Chang-chang1* ， YIN Ming2， WU Ya-hua1， LI Hui-min1，
LIU Yu-liang2，3， WEI Qiang-qiang2，3
(1． Analysis and Test Laboratory of Jiujiang University，Jiujiang 332000，China;2． First Department of Orthopedics，The Second Hospital Affiliated to
Nanchang University，Nanchang 330006，China;3． Graduate School of Medicine Nanchang University，Nanchang 330006，China)
ABSTＲACT:AIM To study the effect of total flavonoids from Arachniodes exilis on proliferation and osteogenic
differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)． METHODS Ｒat BMSCs，isolated from
rats bone marrow in vitro by whole bone marrow adherent method，was purified and cultured． Identification of the
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surface marker of BMSCs and determination of their growth curve were completed by MTT． They were divided into
experimental (total flavonoids from Arachniodes exilis)and control groups，and osteogenesis was identified by mi-
croscopic cell morphology，the activity of alkaline phosphatase ，the formation of calcified nodules by staining，and
the expression of osteopontin and collagen 1 were tested by ＲT-PCＲ． ＲESULTS Cells cultured in vitro expressed
the surface markers of BMSCs． The total flavonoids from Arachniodes exilis improved the activity of ALP，promoted
the formation of calcium nodule，and increased the expression of osteopontin and I collagen shown by PCＲ results．
CONCLUSION 20 μg /mL total flavonoids from Arachnides exilis can promote rat bone marrow mesenchymal stem
cells to differentiate into bone cells．
KEY WOＲDS: total flavonoids from Arachniodes exilis;bone marrow mesenchymal stem cells;proliferation;
ALP;osteogenesis
江西百姓采用民间秘方复叶耳蕨治疗黄疸性肝
炎有长久的历史，但有不少孕妇在用该草药治疗肝
炎的过程出现流产，故引起研究者的注意，进行了
系列研究。研究结果表明复叶耳蕨具有抗生育、加
强子宫收缩等类激素作用，发挥药理作用的主要成
分是黄酮类化合物［1］。进一步研究发现，复叶耳
蕨总黄酮中含有众多类黄酮、香豆素类化合物、蒽
醌类和其他化合物［2］。有研究报道，黄酮类化合
物在脂质过氧化、DPPH 自由基清除、羟基自由基
清除及 H2O2 清除方面表现出剂量依赖性的抗氧化
能力和调节氧化应激信号通路进而调节成骨分化及
成骨细胞的功能［3-4］。因此推测，复叶耳蕨总黄酮
可能具有较强的促进骨髓间充质干细胞 (BMSCs)
成骨分化作用。本实验研究复叶耳蕨总黄酮对大鼠
BMSCs的增殖和成骨分化的影响。
1 材料和方法
1. 1 实验材料、试剂与仪器
1. 1. 1 动物 4 周龄健康清洁级 SD 大鼠 5 只，雌
雄不限，体质量约 40 g，购自湖南斯莱克景达实验
动 物 有 限 公 司，合 格 许 可 证 号: HNA
SLKJ20122049。
1. 1. 2 受试物 药材于 2012 年 10 月采自江西庐
山的秀峰，经九江森林植物标本馆馆长谭策铭鉴定
为刺头复叶耳蕨 Arachniodes exilis (Hance)Ching
的根茎，标本 (No． AEC1210)存放于九江学院基
础医学院生化教研室实验室。复叶耳蕨总黄酮的提
取由九江学院基础医学院药学系李辉敏副教授提
取。提取方法为采用超声波辅助的 75%乙醇浸提，
用旋转蒸发将乙醇提取液浓缩，后用聚酰胺对其进
行纯化;再经过冷冻干燥得复叶耳蕨总黄酮的干燥
品 (用芦丁作对照品，采用 HLPC法测得所提取的
复叶耳蕨总黄酮含有芦丁样结构的化合物为
75%)。复叶耳蕨总黄酮呈粉末状、黄棕色至红棕
色，木化成品［3］。称取 10 mg复叶耳蕨总黄酮溶于
100 μL 的 DMSO，取 10 μL 上述溶液混入于
9 990 μL完全培养基中，配制成 100 μg /mL的复叶
耳蕨总黄酮贮存液，然后再配制成不同质量浓度的
受试物即配制含药的完全培养基，这些培养基用于
相应实验组的细胞学实验。
1. 1. 3 试剂与仪器 DMEM/F12 (Hyclone 公司，
澳大利亚)、Fetal Bovine Serum (GIBCO 公司，美
国)、碱性磷酸酶 (ALP) ［Assay Kit Based on IF-
CC (2007) ］、MTT 粉 (Solarbio 公司，中国)、
0. 25%胰蛋白酶 (含 EDTA)、PBS 粉剂、细胞裂
解液 (北京普利莱基因技术有限公司)、校准品及
质控血清 (中生北控股份有限公司产品)。6 孔培
养板 (COＲNING公司，美国)、TS100-F 倒置相差
显微镜 (Nikon 公司，日本)、超级恒温水浴 HH-
601 (常州国华电器有限公司)、L-3180 型半自动
生化分析仪 (上海科华实验系统有限公司)、CO2
恒温水浴箱 (SIM 公司)、超净台 (苏州净化设备
有限公司)、Model680 型酶标仪 (BIO-ＲAD 公司，
美国)、血球计算板 (上海求精生化试剂仪器有限
公司)、超速离心机 (Sigma 公司)、二甲基亚砜
(DMSO Sigma公司)、流式细胞仪 (美国 B—D 公
司 Ver3. 0)、茜素红粉 (西陇化工股份有限公司)、
硝酸银 (上海三爱思试剂有限公司)、硫代硫酸钠
(天津市风船化工试剂科技有限公司)、中性红
(天津市科密欧化学试剂有限公司)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 SD大鼠 BMSCs 体外分离、纯化及培养
无菌条件下获取大鼠双侧股骨、胫骨并去两侧骨骺
端，用 PBS 缓冲液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细
胞于离心管中，1 000 r /min 梯度离心 5 min，弃上
清，加入含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基充分吹
打均匀，重复离心 1 次，弃上清，加入含 10% FBS
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的 DMEM/F12 培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密
度为 1 × 106 个 /mL，接种于 25 cm2 的培养瓶中，
置于 37 ℃、5% CO2 相对饱和湿度的培养箱中孵
育。48 h后首次换液，弃掉未贴壁细胞，以后每
2 ～ 3 d换液 1 次，纯化骨髓间充质干细胞。细胞达
80% ～90%的融合，胰蛋白酶消化传代。倒置显微
镜下观察原代及传代细胞的生长状况及形态特征，
流式细胞仪分析细胞表面的标志物 CD44 和 CD90
鉴定骨髓间充质干细胞。
1. 2. 2 细胞生长曲线的测定 (MTT 比色法) 取
生长良好且融合达 80% ～ 90%的 P3 代细胞，常规
消化离心，弃上清，调整细胞密度为 1 × 104
个 /mL，按每孔 200 μL接种于 96 孔板，设立 5 个
实验复孔和空白对照组，置于 37 ℃恒温培养箱中
孵育。每 2 d 更换培养基，分别在第 1 天 ～第 11
天共 11 个时间点各取 1 个 96 孔板行 MTT 检测:
每孔加入 5% MTT 溶液 20 μL 孵育 4 h，然后吸弃
上清液，每孔加入二甲基亚砜 (DMSO)150 μL，
充分摇匀震荡 10 min 待结晶物充分溶解后，应用
酶标仪 490 nm波长检测各孔的吸光度值 (A 值)，
记录结果，并绘制成大鼠 BMSCs 的生长曲线 (X
轴-时间，Y轴-吸光度)。
1. 2. 3 复叶耳蕨总黄酮对 BMSCs增殖的影响 取
P3 代细胞，以 2 000 个 /mL 接种于 96 孔培养板，
在 37 ℃、5%相对饱和湿度的 CO2 培养箱中培养。
24 h后吸去原培养基，加入含不同质量浓度的复
叶耳蕨总黄酮培养基 200 μL 进行培养，对照组加
入等量的普通培养基培养。分别在 12、24、48、
72 h向每孔加入 10 μL的 CCK液体，孵育 2 h，用
酶标仪测定 450 nm处的吸光度并绘制成图表。
1. 2. 4 复叶耳蕨总黄酮对 BMSCs成骨分化的影响
取 P3 代 BMSCs 消化后按 2 × 10
5 个 /mL 接种至
24 孔板，24 h后吸去原完全培养基，按下面分组，
每两组一板进行诱导分化:对照组为每孔加 DMSO
(0. 1%) + DMEM/F-12 培养液;实验组为含 20
μg /mL 复叶耳蕨总黄酮 (0. 1% DMSO)的培养
基。共诱导 7 d，每 3 d 换液 1 次。倒置相差显微
镜观察细胞形态变化并拍照，并用于以下检测。
1. 2. 5 检测 ALP 酶活性 采用 IFCC 推荐的磷酸
对硝基苯酚法测定 (速率法)，操作步骤按说明
书，记录检测样品每分钟吸光度变化值 (ΔA /
min)，计算样品中碱性磷酸酶活力 (U /L) ，并绘
制成表格进行比较。
1. 2. 6 钙化结节染色 成骨诱导培养第 7 天采用
Alizarin Ｒed S (AＲS)染色法和 Von Kossa 染色法
进行钙化结节的组织化学染色，并在 10 × 10 倍显
微镜下观察。Alizarin Ｒed S 法:PBS 冲洗 3 次，
95%乙醇固定 10 min，三蒸水冲洗 3 次;加 2%茜
素红后，置于 37 ℃孵育 30 min;三蒸水冲洗 3 次，
干燥、封片。钙结节成红色。Von Kossa 染色:
PBS冲洗 3 次，95%乙醇固定 5 min，三蒸水漂洗 3
次，加 5%硝酸银溶液，紫外照射 1. 5 h，漂洗 3
遍，加 5% 硫代硫酸钠中和残留硝酸银，漂洗 3
遍，1% 中性红复染 10 min，漂洗 3 遍，干燥，
封片。
1. 2. 7 ＲT-PCＲ检测 常规种板 (24 孔板)，分 2
组:加药组 (20 μg /mL 复叶耳蕨总黄酮)和对照
组 (加等量完全培养基) ，每组设 4 个复孔，培养
24 h后按照康为世纪 ＲNA 提取和逆转录说明书进
行操作，以逆转后的 cDNA为模版扩增检测骨桥蛋
白 (OPN)和 I 型胶原 (Coll-Ⅰ)mＲNA 的表达，
扩增后制胶跑电泳拍照，目标基因 OPN、Coll-Ⅰ、
内参 GAPDH的引物见表 1。
表 1 ＲT-PCＲ的引物序列
Tab. 1 Primer sequence of real time ＲT-PCＲ
基因 引物序列
OPN 上游:5-TGCCTGTTCGGCCTTGCCTC-3
(800 bp) 下游:5-TCCAGGCTGGCTTTGGAACTCG-3
Coll-Ⅰ 上游:5-GACGTCCTGGTGAAGTTGGT-3
(588 bp) 下游 :5-AGCCACGATGACCCTTTATG-3
GAPDH 上游 :5-TTGGCCGTATCGGACGCCTG-3
(876 bp) 下游 :5-GAGCAATGCCAGCCCCAGCA-3
1. 2. 8 统计学分析 所有数据均采用 SPSS 19. 0
软件的 onewayANOVA 方差分析统计分析，结果以
平均数 ±标准差 (x ± s)表示，并两两样本间率的
比较采用 χ2 检验，检验水准 α = 0. 05，P ＜ 0. 05 为
差异有统计学意义，P ＜ 0. 01 为具有高度统计学
意义。
2 结果
2. 1 大鼠 BMSCs形态学特征 第 3 天首次换液可
见分散的悬浮细胞，以折光性强的圆形细胞为主
(图 1A) ;6 ～ 10 d 后，贴壁细胞明显增多，出现
成纤维样细胞外观，呈长梭形 (图 1B 和图 1C) ;
14 d左右细胞可达 80% ～ 90%的融合，细胞排列
具有明显的方向性，呈漩涡状 (图 1D)。多次传
代后，细胞仍呈现梭形细胞群，呈漩涡状平行生长
(图 1E)。
2. 2 大鼠 BMSCs流式细胞仪鉴定 流式细胞仪检
测结果显示 CD44 表达阳性，CD90 阴性，BMSCs
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均一性好，纯度达 90%以上。鉴定结果见图 2。
图 1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态观察 (×100)
Fig. 1 Cellular morphology observation (×100)
图 2 小鼠骨髓间充质干细胞的表面抗原分子表达情况
Fig. 2 Surface antigens of rat bone marrow mesenchymal stem cells
图 3 骨髓间充质干细胞的生长曲线
Fig. 3 Growth curve of rat bone marrow mesen-
chymal stem cells
2. 3 细胞增殖测定 ( MTT比色法) 在酶标仪上
选择 490 nm波长检测各孔吸光值，以时间 (t)为
横轴，吸光度 (A)为纵轴绘制 P3 代细胞生长整
个过程中细胞数目的动态变化 (图 3)。BMSCs 在
接种的 1 ～ 3 d 内增殖相对缓慢，处于潜伏期。在
第 4 天 ～第 9 天生长曲线近似成线性曲线，表明这
段时间内细胞成对数生长，处于指数对数生长期，
第 10 天以后曲线相对变缓，细胞增殖速率减慢，
处于平台期。
2. 4 复叶耳蕨总黄酮对 BMSCs增殖的影响 与对
照组比较，20 μg /mL 复叶耳蕨总黄酮对大鼠的
BMSCs增殖具有轻度促进作用。随着复叶耳蕨总
黄酮质量浓度的增加，促细胞增殖活性降低，高于
40 μg /mL则表现为明显的抑制增殖作用且呈剂量
依赖性地降低大鼠 BMSCs的增殖能力，见图 4。
图 4 复叶耳蕨总黄酮对骨髓间充质干细胞生长的影响
Fig. 4 Effect of growth curve of total flavonoids from
Arachniodes exilis on rat bone marrow mesenchy-
mal stem cells
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2. 5 ALP活性检测 各组成骨分化过程中 ALP 活
性检测结果显示:实验组的第 6 天 ALP 活性明显
高于第 3 天 (P ＜ 0. 05)，而 3 d和 6 d后的实验组
ALP活性明显高于相应的对照组 (P ＜ 0. 05)。见
表 2。
表 2 碱性磷酸酶活性测定 (x ± s，n =5)
Tab. 2 Determination of alkaline phosphatase activity
(x ± s，n =5)
组 别
吸光度 (A)
3 d 6 d
对照组 0. 115 0 ± 0. 002 2 0. 228 6 ± 0. 004 9
实验组 0. 304 4 ± 0. 002 3＊＊ 0. 434 4 ± 0. 004 0＊＊
注:与对照组相比，＊＊P ＜ 0. 01
2. 6 钙结节染色 AＲS 染色:复叶耳蕨总黄酮诱
导组细胞胞浆中可见橘红色矿化结节形成，茜素红
染色阳性，而对照组则为阴性。细胞聚集的地方钙
结节明显增多。Von Kossa染色 :复叶耳蕨总黄酮
诱导组加入硝酸银后，在紫外线下染色 90 min 后
可见黑色颗粒，光镜下可见粗大的黑色结节，且周
围有粉红色细胞结构。见图 5。
2. 7 ＲT-PCＲ检测结果 大鼠经诱导 6 d后结果:
图 5 两种染色法鉴定钙结节
Fig. 5 Identification of two kinds of calcium
nodules staining
与对照组相比，实验组的 OPN 和 Coll-Ⅰ转录水平
明显增强 (P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。说明复叶耳蕨
总黄酮可以促进 BMSCs高表达 OPN和 Coll-Ⅰ，利
于成骨分化进程。见图 6。
与对照组相比，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 6 PCＲ电泳图和 PCＲ灰度扫描定量结果
Fig. 6 PCＲ electrophoresis and quantitative results of PCＲ grayscale scanning
3 讨论
BMSCs 具有众多优点而被认为是临床上较理
想的治疗性细胞，如提取简单方便、来源充足、携
带免疫调节机制和抗炎机制、避免免疫排斥反应、
高度自我更新能力和多向分化潜能等［5-6］。特定的
作用因素促进 BMSCs 分化为成骨细胞，有助于促
进骨折愈合和骨质疏松症的防治［7］，因此寻找促
进 BMSCs分化为成骨细胞的物质对于干细胞治疗
在临床的应用具有重要的意义。获得纯化 BMSCs
是干细胞治疗关键步骤，本实验采用全骨髓贴壁法
分离、纯化 BMSCs，通过细胞形态及流式细胞仪
鉴定细胞表面标记物分析所得的 BMSCs 为高度纯
化的细胞，细胞增殖实验证明 BMSCs 生长良好，
这些结果为下一步实验奠定基础。
黄酮类化合物对细胞作用具有双向性，即在不
同的剂量下可呈现促增殖或抑制增殖作用，因此选
择一个适合实验目的药物剂量是诱导 BMSCs 分化
成骨细胞实验关键环节，通过细胞增殖生长实验，
发现低质量浓度复叶耳蕨总黄酮促进 BMSCs 的增
殖，高质量浓度复叶耳蕨总黄酮具有抑制其增殖。
与对照组相比，20 μg /mL 复叶耳蕨总黄酮组的 A
值在不同时间均略高于对照组，说明复叶耳蕨总黄
酮能轻度促进细胞增殖，然而复叶耳蕨总黄酮质量
浓度高于 40 μg /mL 时，能明显抑制 BMSCs 的增
殖，且随复叶耳蕨总黄酮的质量浓度增高，其抑制
作用越强。增殖与分化是 BMSCs 的两个重要的生
物学特性，两者之间存在相互关联的关系，过度增
殖势必抑制分化，但抑制细胞的增殖亦影响细胞生
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物学活性，因此，本实验选择对 BMSCs 有轻度促
进增殖作用的质量浓度 (20 μg /mL)复叶耳蕨总
黄酮作为实验剂量即为实验组。
目前，ALP 活性、OPN 和 Coll-Ⅰ的表达及矿
化结节的检测是鉴定 BMSCs 成功分化为成骨细胞
的主要标志［8-9］。ALP 可分解有机质中磷酸，增加
局部无机磷酸盐浓度，促进矿化，是成骨细胞分化
和功能成熟的前期标志［10］，其活性越高，说明前
期成骨细胞向成熟成骨细胞的分化越明显。本实验
用 20 μg /mL复叶耳蕨总黄酮干预后的第 3 天和第
6 天，ALP活性明显增大，另外，实验组的 ALP活
性均比对照组高，且在第 3 天时两组的差异性更显
著 (P ＜ 0. 01)，实验组的 ALP 活性比对照组高 2
倍以上，这说明复叶耳蕨总黄酮能明显促进 BM-
SCs生成 ALP 或增强 ALP 的活性。OPN 和 Coll-Ⅰ
是分化成熟成骨细胞分泌的特异性蛋白，可作为成
骨细胞分化的中期指标［11-12］。ＲT-PCＲ 实验还发
现，在诱导的第 6 天，实验组的 OPN 和 Coll-Ⅰ的
mＲNA比对照组的表达量明显增加。另外，矿化结
节的形成是成骨细胞分化成熟的重要标志。实验
中，在诱导的第 7 天，采用了 Alizarin Ｒed S 染色
和 Von Kossa染色两种染色方法分别对两组进行矿
化结节染色定性鉴定，两种染色方法显示实验组矿
化结节染色阳性，表明实验组培养的细胞具有成骨
功能，并且复叶耳蕨总黄酮组的矿化结节阳性率明
显高于对照组。以上结果表明:复叶耳蕨总黄酮对
BMSCs向成骨细胞分化具有明显的促进作用。
本实验通过研究和探讨复叶耳蕨总黄酮对大鼠
BMSCs向成骨分化的影响发现，复叶耳蕨总黄酮
可明显促进 BMSCs 向成骨分化作用;其作用是通
过增强细胞内 ALP 活性、促进钙结节形成、上调
骨桥蛋白和Ⅰ型胶原的表达，进而促进成骨分化进
程。本研究为后续进一步研究复叶耳蕨总黄酮促成
骨的机制奠定一定的基础。
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2014 年 3 月
第 36 卷 第 3 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
March 2014
Vol． 36 No． 3