全 文 ：·药理·
收稿日期:2015-07-06
基金项目:国家自然科学基金计划项目(81160536);江西省教育厅科技课题资助项目(20142BBG70018)
作者简介:胡文龙(1988-)，男，在读硕士研究生，专业方向:中药调控干细胞的研究;Tel:18970015241，E-mail:huwenlong1988@ 126. com。
* 通讯作者:殷嫦嫦，Tel:13607920508，E-mail:yinchangchang112@ 163. com。
复叶耳蕨总黄酮通过 BMP信号通路促进 MSC成骨分化
胡文龙1，2，3，殷嫦嫦1* ，梁广胜3，耿书国2，汪建样2
(1. 九江学院基础医学院，江西 九江 332000;2. 南昌大学研究生院医学部，江西 南昌 330006;3. 南昌大
学第二附属医院骨科，江西 南昌 330006)
摘要 目的:研究复叶耳蕨总黄酮(total flavonoids from Arachniodes exilis，TFA)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone
marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的作用及其分子机制。方法:通过茜素红染色、碱性磷酸酶(alka-
line phosphatase，ALP)活性考查 BMSCs成骨情况;ＲT-PCＲ检测Ⅰ型胶原酶 α1(collagen type Ⅰ α1，COL1A1)、骨钙
蛋白(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(osteopotin，OPN)、BMP2、BMP4、Ｒunx2、Osterix转录水平;ELISA检测骨形态发生
蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号通路相关蛋白 BMP2、BMP4、Ｒunx2 表达情况。结果:TFA 能显著增加
BMSCs碱钙结节的形成、ALP活性，上调 COL1A1、OCN、OPN 的表达，促进 BMSCs 成骨分化，而 Noggin 能抑制该作
用;TFA能显著上调 BMP2、BMP4、Ｒunx2、Osterix的表达。结论:TFA可能通过 BMP信号通路促进大鼠 BMSCs成骨
分化。
关键词 复叶耳蕨总黄酮;骨髓间充质干细胞;成骨分化;BMP信号通路
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)01-0150-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 01. 037
Total Flavonoids from Arachniodes exilis Enhance Osteogenic Capacity of
Mesenchymal Stem Cells via BMP Signaling
HU Wen-long1，2，3，YIN Chang-chang1，LIANG Guang-sheng3，GENG Shu-guo2，WANG Jian-yang2
(1. Basic Medical College，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China;2. Medicine Graduate School，Nanchang University，Nanchang
330006，China;3. Department of Orthopedics，The Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China)
Abstract Objective:To investigate the effects and its molecular mechanism of the total flavonoids from Arachniodes exilis(TFA)
on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs). Methods:Alizarin red staining and alkaline phospha-
tase(ALP)activity were used to evaluate the osteogenic differentiation capacity of BMSCs;ＲT-PCＲ was used to assess the transcription
level of collagen type Ⅰ α1(COL1A1)，osteocalcin(OCN)and osteopotin(OPN) ，BMP2，BMP4，Ｒunx2，Osterix;the expression of bone
morphogenetic protein(BMP)signaling related proteins(BMP2，BMP4，Ｒunx2)were detected by ELISA. Ｒesults:TFA enhanced osteo-
genic differentiation capacity of BMSCs significantly，demonstrated by increasing the formation of calcium nodules，ALP activity and gene
expression of COL1A1，OCN and OPN，while those effects were dramatically attenuated by treatment with Noggin;TFA significantly up-
regulated the expression of BMP2，BMP4，Ｒunx2 and Osterix. Conclusion:TFA promoted the osteogenic differentiation capacity of rat
bone marrow mesenchymal stem cells through BMP signaling.
Key words Total flavonoids from Arachniodes exilis;Bone marrow mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;BMP sig-
naling
我国复叶耳蕨属 Arachniodes 植物种类众多，分
布广泛，其中不乏多种药用种属，如刺头复叶耳蕨、
长叶复叶耳蕨、斜方复叶耳蕨等。研究表明复叶耳
蕨提取成分具有抗菌及抗病毒活性〔1，2〕，Zhou 等〔3〕
的研究表明明刺头复叶耳蕨的乙醇提取物具有强大
的抗氧化能力和护肝作用，可用于肝脏疾病的治疗。
复叶耳蕨提取物成分复杂，其中黄酮类化合物是其
发挥生物学活性的主要成分，有研究表明复叶耳蕨
总黄酮能通过活化 MAPK 信号通路介导 HepG2 细
胞凋亡，从而发挥抗肝癌作用〔4〕。Wu 等〔5〕发现黄
酮类化合物具有促进 BMSCs 成骨分化的作用。
BMP作为转化生长因子(transforming growth factor，
TGF)β家族的分泌型蛋白，参与了多种器官和组织
的形成和分化过程，具有强大的介导间充质干细胞
成骨和成软骨分化的作用。本课题组前期研究发现
TFA具有促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow
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mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的作用，然
而该作用是否与 BMP 信号通路相关笔者未见国内
(外)文献报道。为此，本实验基于 BMP 信号通路
研究了 TFA促进 BMSCs成骨分化的相关分子机制。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 清洁级 3 ～ 4 周龄 SD 大鼠，雌雄
不限，体质量 35 ～ 40 g，由湖南斯莱克景达实验动物
有限公司提供，合格证号:HNASLKJ20122049。
1. 2 药物与试剂 实验用复叶耳蕨药材采自江西
庐山秀峰，经江西省科学院生物资源研究所九江森
林植物标本馆谭策铭教授鉴定为刺头复叶耳蕨
Arachniodes exilis (Hance)Ching 的 根 茎，标 本
(No. AEC1210)存放于九江学院基础医学院生化教
研室实验室，采用超声辅助的乙醇浸提法及聚酰胺
纯化提取复叶耳蕨总黄酮(TFA，芦丁样结构化合物
质量分数为 75%)，TFA 溶于二甲基亚砜(DMSO) ，
调整质量浓度为 100 mg /mL，进一步稀释于含 10%
FBS的 DMEM/F-12 的完全培养基，配制成质量浓
度为 100 μg /mL 的 TFA 溶液;DMEM/F-12 培养基
(批号:NAA1320)，美国 Hyclone公司;胎牛血清(批
号:1699800)，美国 Gibco 公司;成骨诱导液(Stem
XVivoTM osteogenic Supplement， 20 ×，批 号:
CCM008)，美国 Ｒ＆D 公司;青、链霉素混合液(批
号:20141020)，北京索莱宝科技有限公司;碱性磷酸
酶(ALP)检测试剂盒(批号:CH0101203)，四川迈克
生物科技股份有限公司;HiFi-MMLV cDNA 第一链
合成试剂盒(批号:00081309)，北京康为世纪生物
科技有公司;GＲEENspin细胞 ＲNA快速提取试剂盒
(批号:IP409-01)，北京庄盟国际生物基因科技有限
公司;Noggin 重组蛋白(批号:AF-250-38)，美国
Peprotech 公司;大鼠 BMP2(批号:E-EL-Ｒ0002c)、
BMP4(批号:E-EL-Ｒ0116c)、Ｒunx2(批号:E-EL-
Ｒ0866c)酶联免疫吸附实验检测试剂盒，武汉伊莱
瑞特生物科技有限公司。
1. 3 主要仪器 Model680 型酶标仪，美国 Bio-Ｒad
公司;TC-E 型 PCＲ 仪，中国杭州 BIOEＲ 公司;T25
培养瓶、6 孔板、24 孔板、96 孔板，美国 Corning 公
司。
2 方法
2. 1 大鼠 BMSCs分离鉴定与培养 采用本课题组
前期建立的全骨髓贴壁法分离培养 SD 大鼠 BM-
SCs〔6〕;倒置相差显微镜观察细胞形态及贴壁能力;
流式细胞仪检测 CD45、CD90。使用含 10% FBS 的
DMEM/F-12 的完全培养基贴壁培养 BMSCs，细胞融
合达 80% ～90%后按 1∶ 2 传代。
2. 2 茜素红钙结节染色 配制完全成骨诱导液:
将成骨诱导液按 1∶ 20 稀释于完全培养基中。取第
4 代 BMSCs按 1 × 105 /孔接种于 24 孔板内，完全培
养基常规培养，待细胞融合达 50% ～ 70%，更换诱
导液，按诱导液不同分为:对照组(含 0. 4‰ DMSO
的完全成骨诱导液);TFA 5、10、20、40 μg /mL 组
(分别含 5、10、20、40 μg /mL TFA 的完全成骨诱导
液);TFA + Noggin组(含 20 μg /mL TFA及 1 μg /mL
Noggin的完全成骨诱导液)。保证各组 DMSO 含量
均为 0. 4‰，每 3 d 换液 1 次，诱导 9 d 后行茜素红
染色。
2. 3 ALP 活性检测 按“2. 2”项下方法分组并进
行成骨诱导，分别于诱导第 3、6 天按 ALP 检测试剂
盒说明操作，于 405 nm处检测各组每 1 min 光密度
变化值 D(λ)/min，根据公式:ALP 活性(U /L)= D
(λ)/min × F(F = 2713)，计算各组 ALP活性。
2. 4 ＲT-PCＲ检测成骨细胞相关基因和 BMP 通路
相关基因表达水平 取第 4 代 BMSCs，调整细胞密
度为 2 × 105 /mL，接种于 6 孔板内，每孔 2 mL，分为
对照组(含 0. 2‰ DMSO的完全成骨诱导液)和 TFA
组(含 20 μg /mL TFA的完全成骨诱导液)并于诱导
2、4、6 d 后提取各组细胞总 ＲNA，按试剂盒说明书
逆转录为 cDNA后加入相关引物进行 PCＲ 扩增，加
入各组 DNA扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，扫描各
条带并进行灰度分析。GAPDH作为内参，各目的基
因为:COL1A1、OCN、OPN、BMP2、BMP4、Ｒunx2、Os-
terix。各引物序列及产物长度见表 1。
表 1 引物序列与产物长度
基因 引物序列 产物长度
GAPDH Forward:5-TTGGCCGTATCGGACGCCTG-3
Ｒeverse:5-GAGCAATGCCAGCCCCAGCA-3
876 bp
BMP2 Forward:5-CCCAGACCACCGGCTGGAGA-3
Ｒeverse:5-CGACACCCGCAACCCTCCAC-3
903 bp
BMP4 Forward:5-AGCCAGGGAACCGGGCTTGA-3
Ｒeverse:5-GCGCTCAGTTCGGTGGGGAC-3
842 bp
Ｒunx2 Forward:5-TGAGCGACGTGAGCCCGGTA-3
Ｒeverse:5-CGTGTGGAAGACAGCGGCGT-3
883 bp
Osterix Forward:5-GCCCACTGGTGCCCAAGACC-3
Ｒeverse:5-CCCGTGGGTGCGCTGATGTT-3
829 bp
OCN Forward:5-CCTGGCAGGTGCAAAGCCCA-3
Ｒeverse:5-TGCGCTTGTAGGCGTCCTGG-3
224 bp
OPN Forward:5-TGCCTGTTCGGCCTTGCCTC-3
Ｒeverse:5-TCCAGGCTGGCTTTGGAACTCG-3
800 bp
COL1A1 Forward:5-GACGTCCTGGTGAAGTTGGT-3
Ｒeverse:5-AGCCACGATGACCCTTTATG-3
588 bp
2. 5 酶联免疫吸附试验(ELISA) 第 4 代 BMSCs
按“2. 4”项下细胞密度接种于 6 孔板内，按 TFA质量
浓度 0、5、10、20、40 μg /mL 随机分为 5 组进行诱导，
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分别于第 3、6天收集细胞裂解液，按照 ELISA检测试
剂盒说明书检测各组 BMP2、BMP4、Ｒunx2含量。
2. 6 统计学处理 所有数据均以 珋x ± s 表示，采用
SPSS 19. 0 统计软件处理分析，组间比较采用单因
素方差分析，两两比较采用 SNK-q检验，以 P ＜ 0. 05
为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 BMSCs基本生物学特性及鉴定 原代细胞培
养 8 ～ 10 d后可见较多成纤维样细胞贴壁生长，经
过传代培养后，细胞均呈长梭形，排列紧密，呈旋涡
状贴壁生长;本课题组前期流式细胞法检测该法分
离培养的细胞 CD45 阴性表达，CD90 阳性表达，阳
性率 ＞ 90%〔7〕，可确定该细胞为 BMSCs。
3. 2 复叶耳蕨总黄酮对 BMSCs成骨分化能力的影
响 肉眼观及显微镜下钙结节均呈红色，加入一定
浓度 TFA(5 ～ 20 μg /mL)后，红染钙结节均较对照
组增加，TFA 20 μg /mL 组增加最明显。加入 BMP
信号通路抑制剂 Noggin 后，钙结节数量显著减少。
高浓度 TFA(40 μg /mL)反而抑制了 BMSCs 钙结节
的形成，见图 1。各组第 3、6 天 ALP活性检测显示:
在 5 ～ 20 μg /mL范围内，TFA具有促进 BMSCs成骨
分化的作用，且呈现一定浓度依赖性，而 40 μg /mL
的 TFA则表现为抑制作用;Noggin 可显著抑制 ALP
的活性，见图 2。
图 1 复叶耳蕨总黄酮(TFA)对 BMSCs成骨分化能力的影响(标尺:200 μm)
A. 对照组 B. TFA 5 μg /mL组 C. TFA 10 μg /mL组 D. TFA 20 μg /mL组 E. TFA 40 μg /mL组 F. TFA + Noggin组
图 2 复叶耳蕨总黄酮(TFA)对 BMSCs成骨分化
能力的影响(珔x ± s，n =5)
A. 对照组 B. TFA 5 μg /mL 组 C. TFA 10 μg /mL 组
D. TFA 20 μg /mL组 E. TFA 40 μg /mL组 F. TFA + Noggin
组
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05
3. 3 复叶耳蕨总黄酮对成骨相关基因和 BMP通路
相关基因表达的影响 结果如图 3 所示，TFA 组
COL1A1、OCN、OPN表达在第 4、6 天显著升高(P ＜
0. 05)，BMP2、BMP4、Ｒunx2、Osterix 表达在第 2 ～ 6
天显著升高(P ＜ 0. 05)。
3. 4 复叶耳蕨总黄酮对 BMSCs 成骨诱导过程中
BMP2、BMP4、Ｒunx2 含量的影响 结果如图 4 所
示，各组 BMP2、BMP4、Ｒunx2 含量均随着诱导时间
增加而升高;第 6 天时，TFA 各浓度 BMP2、BMP4、
Ｒunx2 含量均显著高于对照组(P ＜ 0. 05)。
4 讨论
ALP、OPN、OCN、COL1A1、Ｒunx2 的表达及钙结
节的形成是 MSCs成骨分化的重要标志〔8〕。ALP 可
促进局部无机磷酸盐形成，因而成为成骨分化的早
期标记物。有研究表明 OPN、OCN能促进骨样结节
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图 3 复叶耳蕨总黄酮(TFA)对成骨相关基因和 BMP通路相关基因表达的影响(珔x ± s，n =5)
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05
图 4 ELISA检测复叶耳蕨总黄酮(TFA)对 BMSCs成骨诱导过程中 BMP2、BMP4、Ｒunx2 表达的影响(珔x ± s，n =5)
A. 对照组 B. TFA 5 μg /mL组 C. TFA 10 μg /mL组 D. TFA 20 μg /mL组 E. TFA 40 μg /mL组
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05
形成，为细胞基质矿化打下基础〔9〕。本实验中 TFA
显著增加了 BMSCs 的 ALP 活性，且在浓度低于 20
μg /mL时呈现剂量依赖性，随着作用时间的增加，
ALP活性成倍数增强;TFA 组 OPN、OCN、COL1A1
基因的转录水平在诱导第 4 天开始显著上调，第 6
天达到高峰;矿化结节是 BMSCs 成骨分化成熟最直
接的证据，与 ALP 活性水平一致，TFA 显著促进了
钙化结节的形成。以上证据表明，TFA 能显著促进
BMSCs成骨分化。
大量研究表明 BMP信号通路在骨组织形成、间
充质干细胞成骨分化及骨再生过程中发挥着关键作
用，特别是 BMP2 和 BMP4 具有强大的促进成骨分
化的作用〔10，11〕。为了阐明 BMP信号通路在 TFA促
进成骨分化的作用，本研究在 TFA 中加入 BMP 信
号通路的阻滞剂 Noggin，结果显示该组 BMSCs ALP
活性和钙结节数量均显著低于对照组，对 BMP信号
通路的阻滞不仅使 TFA的促成骨作用丧失，还显著
削弱了 BMSCs的成骨分化能力。对 BMP 信号通路
相关基因及蛋白的检测进一步明确了其与 TFA 促
成骨作用的相关性，ＲT-PCＲ 和 ELISA 检测发现
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TFA能显著上调 BMP2、BMP4 的表达。Smad 信号
通路是 BMP 发挥作用的的主要通路，有研究表明
BMP /Smad 信号通路能调控多种转录因子，包括
Ｒunx2、Osterix、Msx2、Dlx5 /6、Sox9 等〔11〕。Ｒunx2 是
骨形成和成骨分化过程中关键的转录因子，人类
Ｒunx2 基因突变将会导致颅骨锁骨发育不全综合
征〔12〕，BMP /Smad 信号通路的活化能上调 Ｒunx2 的
表达和功能，从而介导 MSC 成骨分化〔13〕。Osterix
属于 BMP2 特异性转录因子，敲除了 Osterix 的老鼠
出现了严重的骨形成和成骨分化功能损伤〔14〕。
TFA对 BMP2、BMP4、Ｒunx2 和 Osterix 表达的持续
性上调表明 TFA能活化 BMP 信号通路及其下游成
骨相关的转录因子。
综上所述，BMP信号通路的活化是 BMSCs成骨
分化的必要过程，TFA具有促进大鼠 BMSCs 定向成
骨分化作用，且 BMP 信号通路与 TFA 的促成骨分
化作用密切相关，是 TFA促进成骨分化的分子机制
之一。
参 考 文 献
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