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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):186-193
反刍动物瘤胃是一个降解植物纤维的高效厌氧
发酵罐，微生物包括细菌、真菌和原虫等［1］。对瘤
胃厌氧真菌的研究发现瘤胃厌氧真菌的纤维素酶和
木聚糖酶活性比瘤胃纤维素分解细菌、原虫以及工
业用产酶微生物木霉菌等分泌的酶活性都高，如其
纤维素分解酶活性是瘤胃纤维素分解细菌产生的酶
收稿日期 ：2014-09-01
基金项目 ：新疆维吾尔自治区高技术研究发展项目（201211104），新疆研究生科研创新项目（XJGRI2013112）
作者简介 ：汪艳，女，硕士研究生，研究方向 ：酶的基因工程 ；E-mail ：312577269@qq.com ；李晓为共同第一作者
通讯作者 ：陈勇，男，教授，研究方向 ：饲用酶制剂 ；E-mail ：xjaucy@hotmail.com
来源于瘤胃厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶
在毕赤酵母中的表达
汪艳1  李晓1，2  陈勇1  武运2
（1. 新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052 ；2. 新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052）
摘 要 ： 厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 是瘤胃中降解木聚糖和纤维素的主要微生物之一，其木聚糖酶具有潜在的应用价
值。对来源于 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶基因 Xyn11B 进行密码子优化 ；通过全基因合成优化后的木聚糖酶基因 Xyn11Bm，构
建该基因的酵母表达载体 pPIC9K-Xyn11Bm，并在毕赤酵母 GS115 中诱导表达。摇瓶水平时，重组 Xyn11Bm 酶活性最高为 4 874.8
U/mL。在 10 L 发酵罐中诱导 96 h 后，重组 Xyn11Bm 的酶活性为 5 139.7 U/mL，菌体湿重和干重达到 216.7 g/L 和 117.3 g/L。酶学
性质分析表明，重组 Xyn11Bm 的最适反应温度为 50℃，最适反应 pH 为 5.0。在 pH5.0-8.0 时该酶具有较好的稳定性，但温度稳定
性较差。底物特异性分析表明，重组 Xyn11Bm 可水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖 4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，但不
降解地衣多糖和大麦 β-葡聚糖。结果表明重组 Xyn11Bm 具有潜在的应用价值。
关键词 ： Neocallimastix frontalis ；木聚糖酶 ；毕赤酵母 ；密码子优化 ；酶学性质
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.029
Expression of a Xylanase Gene Originated from Rumen Anaerobic
Fungi Neocallimastix frontalis in Pichia pastoris
Wang Yan1 Li Xiao1，2 Chen Yong1 Wu Yun2
（1. College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052 ；2. College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang
Agricultural University，Urumqi 830052）
Abstract: The anaerobic fungus Neocallimastix frontalis is one of main microorganisms in the rumen degrading xylan and cellulose and
its xylanase has the potential application value. In this study, a xylanase gene Xyn11B originated from N. frontalis was codon optimized, and
the optimized gene Xyn11Bm was synthesized. Based on the gene engineering technology, the yeast expression vector pPIC9K-Xyn11Bm was
constructed, and the xylanase was induced and expressed in Pichia pastoris GS115. In shake flask level, enzyme activity of the recombinant
Xyn11Bm reached the maximum up to 4874.8 U/mL. In 10 L fermentor, at 96 h after induction, the activity of recombinant enzyme was 5139.7
U/mL, cell wet weight and dry weight were 216.7 g/L and 117.3 g/L. Enzymatic properties analysis showed that the optimum reaction temperature
and pH of Xyn11Bm were 50℃ and 5.0. In pH5.0-8.0, the enzyme had sound stability, but poor temperature stability. Substrate specificity
analysis showed that recombinant Xyn11Bm could hydrolyze oat spelt xylan, birch xylan and soluble xylan 4-O-Me-D-glucurono-D-xylan, but not
degrade lichenin and barley β-glucan. This indicated that the recombinant Xyn11Bm had potential application value.
Key words: Neocallimastix frontalis ；xylanase ；Pichia pastoris ；codon optimization ；enzymatic properties
2015,31(5) 187汪艳等：来源于瘤胃厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
活性的 5 倍［2］。基因工程技术为利用瘤胃微生物基
因资源提供了可能。通过构建真核和原核工程菌，
一些瘤胃微生物木聚糖酶基因实现了异源表达。如
厌氧真菌 Neocallimastix patriciarum 的木聚糖酶基因
XynA 在大肠杆菌中表达的水平最高为 672 U/mg ；经
截短表达后，其中的一个克隆表达的木聚糖酶活性
达到 1 229 U/mg［3］。另一个来源于 N. patriciarum 的
木聚糖酶基因 Xynsk1-9 在大肠杆菌中表达后，纯
化的木聚糖酶比活性达到 10 371.04 U/mg［4］。来源
于 Orpinomyces sp. PC6 的 Xyn1 基因在毕赤酵母、链
霉菌和芽孢杆菌均获得了表达，最大反应速度达到
1 770 μmol/（min·mg）［5］。Neocallimastix frontalis
与 Neocallimastix patriciarum 相 似， 均 为 单 中 心 菌
体厌氧真菌，由其产生的木聚糖酶在植物细胞壁的
降解中起着重要作用［6］。Xyn11B 是 Neocallimastix
frontalis 木聚糖酶基因簇中的一员，属于糖苷水解
酶第 11 家族成员。研究发现，糖苷水解酶第 11 家
族中的木聚糖酶较其它家族木聚糖酶活力更高［7］。
Xyn11B 是否是值得开发的一种基因资源，目前还不
确定。
密码子优化是提高蛋白质异源表达水平的重要
途径。有关源于 Neocallimastix frontalis 的 Xyn11B 基
因优化及其在毕赤酵母中的表达还未见报道。本研
究以瘤胃厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶
基因 Xyn11B 为基础，在不改变氨基酸序列的情况
下，根据密码子的偏爱性等对该基因进行密码子优
化，构建毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母 GS115 中
进行诱导表达，对重组木聚糖酶的酶学性质进行研
究，以期获得具有工业应用价值的重组木聚糖酶的
基因工程菌。
1 材料与方法
1.1 材料
分泌型表达载体 pPIC9K 及其宿主菌毕赤酵母
（Pichia pastoris）GS115 购自 Invitrogen 公司 ；大肠杆
菌 DH5α 为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 瘤胃厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 木聚糖
酶 Xyn11B 基因的优化与合成 在 GenBank 中检索
出厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶 Xyn11B
基因序列（登录号 ：AY131336.1），根据酵母密码子
偏爱性对 Xyn11B 的密码子进行初步替换 ；为便于后
续基因克隆和重组质粒线性化，采用 Oligo 6.0 分析
替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过
密码子调整，消除基因序列中的 Bgl II、Sac I、Sal I、
EcoR I 和 Not I 的切割位点 ；为提高 mRNA 的稳定性
和表达水平，采用 BioEdit 7.0 分析调整后基因序列
中 mRNA 隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，
以消除其中的隐蔽剪接位点 GGTAAG、GGTGAT、
AATAAA、ATTTA、PolyT 和 PolyA。采用 RNA Stru-
cture 3.2 对 mRNA 二级结构的自由能进行分析，筛
选获得自由能最低的序列，并命名为 Xyn11Bm。以
JCat 程序计算优化前后的相对优化度值（CAI）。将
优化后的核苷酸序列送交上海生工生物工程有限公
司进行全基因合成。
1.2.2 重组 Xyn11Bm 毕赤酵母工程菌的构建与筛选
合成的 Xyn11Bm 用 EcoR I 和 Not I（大连 TaKaRa
公司）双酶切，并重组至经同样限制性内切酶酶
切的毕赤酵母表达载体 pPIC9K（美国 Invitrogen 公
司）上，转化大肠杆菌 DH5α，经 DNA 测序鉴定
无 误 的 重 组 载 体 命 名 为 pPIC9K-Xyn11Bm。 用 Sal
I 对 pPIC9K-Xyn11Bm 线 性 化， 以 ECM399 电 转 化
仪（美国 BTX 公司）电击转化毕赤酵母 GS115（美
国 Invitrogen 公司）感受态细胞，将转化后的菌液涂
布在最小葡萄糖培养基（Minimal dextrose medium，
MD）平板上，于 30℃培养约 48 h 至出现克隆子。
挑选生长正常的菌落进行甲醇利用表型鉴定，对甲
醇利用表型正确的克隆通过遗传霉素 G418 硫酸盐
筛选获得含高拷贝目的基因的重组酵母工程菌。
1.2.3 重 组 Xyn11Bm 毕 赤 酵 母 木 聚 糖 酶 活 性 初
筛 将筛选获得的抗 4 mg/mL 遗传霉素 G418 的 7
个菌株分别接种于含有 5 mL 缓冲复合甘油培养基
（Buffered minimal glycerol-complex medium，BMGY）
的 50 mL 试管中，29℃振荡培养 24 h 后离心用缓冲
复合甲醇培养基（Buffered minimal methanol-complex
medium，BMMY）重悬，每隔 24 h 加入甲醇，共培
养 48 h，甲醇最终浓度为 0.5%。培养结束后离心收
集上清，以燕麦木聚糖为底物测定酶活性。活性最
高的菌株送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微
生物中心保藏。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5188
1.2.4 重组 Xyn11Bm 毕赤酵母的 PCR 鉴定 取 1 mL
菌液参考唐天乐等［8］的方法提取酵母染色体 DNA。
以 5AOX1（5-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-
3）/3AOX1（5-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3）
为上下游引物进行 PCR 鉴定。PCR 体系为 dNTP 2.0
μL、10×PCR buffer 2.5 μL、5AOX1 2 μL、3AOX1 2
μL、Taq 酶 1.0 μL、DNA 2.0 μL、ddH2O 13.5 μL，总
体积 25.0 μL。PCR 反应条件为 ：95℃预变性 5 min ；
94 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， 共 30 个 循 环 ；
72℃延伸 5 min。取 5 μL PCR 产物用 1% 琼脂糖凝
胶电泳检测。
1.2.5 重组 Xyn11Bm 酶活性的测定 采用二硝基
水杨酸法测定木聚糖酶活性［9］。取适当稀释的酶液
200 μL，1.0% 的桦木木聚糖 400 μL，于 50℃反应 5-
10 min，立即加入 1 mL 二硝基水杨酸溶液，振荡混
匀后于 95℃水浴 5 min 显色。冷却后加入 3.4 mL 去
离子水，振荡混匀后于 540 nm 处测定吸光度。
1.2.6 Xyn11Bm-12 在摇瓶水平条件下的表达 选
取在初筛时酶活性最高的重组菌 Xyn11Bm-12，按
照 pPIC9K 产品说明在 250 mL 三角瓶中诱导表达。
分别取诱导培养前和诱导培养后 12、24、36、48、
60、72、84 和 96 h 的样品进行 SDS-PAGE 电泳。取
96 h 的样品上清用平板刚果红法定性判断木聚糖酶
的活性［10］。
1.2.7 Xyn11Bm-12 在 10 L 发酵罐中的高效表达 参
考杨玉霞等［11］的方法利用 10 L 自动发酵罐进行液
体深层发酵，持续诱导 144 h。每 12 h 取样 10 mL 用
于测定酶活性、上清蛋白质浓度、菌体湿重和干重。
1.2.8 重组 Xyn11Bm 的纯化 发酵产物经离心后
取 6 mL 上清以 Vivaspin 6（美国 Millipore 公司）超
滤浓缩至 1 mL，浓缩后的上清用 G-75 葡聚糖凝胶
（美国 Bio-Rad 公司）进行层析纯化，每管收集 1
mL。以 GeneQuant 核酸蛋白检测仪（美国 Anersham
Biosciences 公司）测定层析液 OD280，根据 OD280 值
将处于同一吸收峰的样品等量混合，并测定合并样
品的酶活性。
1.2.9 重组 Xyn11Bm 的酶学性质
1.2.9.1 最适反应温度及热稳定性 最适反应温度
的测定 ：取纯化酶液分别在 20、30、37、40、50、
60、70、80 和 90℃条件下测定酶活性。热稳定性的
测定 ：取纯化酶液分别在 30、37、40、50、60、70
和 80℃条件下保持 30 min，在最适温度及 pH 值条
件下测定其剩余酶活性。
1.2.9.2 最适反应 pH 值及 pH 值的稳定性 最适反
应 pH 值的测定 ：取纯化酶液分别在 pH 为 2.2、3、
4、5、6、7、8、9、10 和 10.6 下在最适温度条件下
测定酶活性。pH 值稳定性的测定 ：取纯化酶液分别
在 pH 为 2.2、3、4、5、6、7、8、9、10 和 10.6 下
保持 30 min，在最适温度及 pH 值条件下测定其剩
余酶活性。
1.2.9.3 底物特异性 取适量纯化后酶液，分别以
大麦 β-葡聚糖、地衣多糖、燕麦木聚糖、桦木木聚
糖和可溶性木聚糖 4-O-Me-D-glucurono-D-xylan（美
国 Sigma 公司）为底物在最适温度及 pH 值条件下测
定酶活性。
2 结果
2.1 瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶
Xyn11B基因的优化
优化前后序列比对如图 1 所示。经 Jcat 软件计
算，优化后的核苷酸序列 CAI 由 0.31 提高到 0.90，
G+C 含 量 由 44.1% 下 降 到 42.2%。 优 化 后 序 列 与
优化前序列的相似性为 85.07%。与优化前序列相
比，优化后序列中共对 121 个氨基酸残基的密码子
进行了优化，有 151 个核苷酸被替换。利用 RNA
Structure 5.3 软件对优化前后的最低自由能进行分析
表明，优化对 mRNA 的最低自由能影响不大，优化
前最低自由能为 -286.60 KJ/mol，优化后为 -277.90
KJ/mol。
2.2 重组Xyn11Bm毕赤酵母工程菌的筛选、活性
测定和PCR鉴定
通过 G418 硫酸的筛选，共获得抗 4 mg/mL 的
菌 株 7 个。 酶 活 性（ 图 2） 显 示，7 个 菌 株 都 具
有 木 聚 糖 酶 活 力， 其 中 最 高 的 是 12 号（ 命 名 为
Xyn11Bm-12），为 2 541 U/mL。该菌株送交中国微
生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心后获得保
藏号为 CGMCC No.9398。图 3 显示，Xyn11Bm-12 工
程菌在 2 000 bp 处出现两条 DNA 条带，其中分子量
大的为 AOX1 基因的 PCR 产物，分子量小的为目的
基因相关产物。这表明 Xyn11Bm 基因已插入毕赤酵
2015,31(5) 189汪艳等：来源于瘤胃厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达ՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾՈॆࡽՈॆਾ
1
1
61
61
121
121
181
181
241
241
301
301
361
361
421
421
481
481
541
541
601
601
661
661
721
721
781
781
841
841
901
901
961
961
图 1 瘤胃厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶 Xyn11B 基因的原始序列和优化序列的比较
母 GS115 染色体 DNA 中。
2.3 重组Xyn11Bm基因在毕赤酵母中的表达
2.3.1 Xyn11Bm-12 在摇瓶水平条件下的表达 如
图 4 所示，随着诱导时间的延长，木聚糖酶活性
逐渐提高，到诱导后 84 h 时，酶活性达到最大值，
为 4 874.8 U/mL。图 5 显示，酵母菌 GS115 和转化
空表达载体 pPIC9K 的酵母菌在培养 96 h 后没有产
生透明圈，说明其培养上清液无木聚糖酶活性。而
Xyn11Bm-12 在诱导 96 h 后的培养上清液产生了清
晰可见的透明圈，进一步表明 Xyn11Bm 基因在毕赤
酵母 GS115 中获得了表达，并且具有木聚糖酶活性。
SDS-PAGE 分析（图 6）表明，随着诱导时间的延长
培养上清液中出现了一条分子量约为 44.3 kD 的蛋
白质条带。在本试验中，该酶蛋白由 339 个氨基酸
组成，理论分子量为 37.02 kD。从 SDS-PAGE 电泳
图谱可以看出，在毕赤酵母中表达的瘤胃厌氧真菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5190
Neocallimastix frontalis 木聚糖酶的分子量比理论分子
量稍微大一些，可能是因为蛋白质糖基化的结果。
似的变化规律。随着诱导时间的延长，木聚糖酶活
性不断增加，在诱导第 96 h 时发酵液的酶活性最高
为 5 139.7 U/mL，之后逐渐下降。在诱导 144 h 结束
时仅为 3 577.2 U/mL。
3000
2000
1000
酶
活
性
/U·mL-1 
500
0
2 4 6 7 12 15 19㧼Ṛ㕆ਧ15002500
图 2 7 个重组 Xyn11Bm 酵母菌株酶活性的比较
2000
bp
M 1 2 3
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：GS115-pPIC9K ；2 ：pPIC9K ；3 ：Xyn11Bm-12
图 3 重组 Xyn11Bm 毕赤酵母的 PCR 鉴定
6000
5000
4000
3000䞦⍫ᙗ/U·mL-1  2000
1000
0
0 12 24 36 48 60 72 84 96䈡ሬᰦ䰤h
图 4 重组木聚糖酶 Xyn11Bm 在摇瓶水平时的酶活性变化
2.3.2 Xyn11Bm-12 在 10 L 发酵罐中的高效表达
图 7 显示，随着诱导时间的延长，发酵物湿重和干
重含量逐渐增加，在诱导 96 h 时菌体湿重和干重达
到最大值，分别为 216.7 g/L 和 117.3 g/L，之后逐渐
下降。到发酵结束时，菌体湿重和干重为 160.7 g/L
和 67.5 g/L。图 8 显示，木聚糖酶活性和比活性呈相
1
2
3
1 ：Xyn11Bm-12 诱导 96 h ；2 ：酵母菌 GS115 ；
3 ：转空表达载体 GS115-pPIC9K
图 5 平板刚果红法鉴定重组木葡聚糖酶 Xyn11Bm 的活性
Xyn11Bm
99.2
kD M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
M ：蛋白质分子量标准 ；1-9 ：分别为诱导前、诱导后 12、24、36、48、
60、72、84 和 96 h 的培养上清液
图 6 Xyn11Bm-12 培养上清的 SDS-PAGE 电泳图谱
250
200
150㧼փ䍘䟿/g·L-1  100
50
0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144䈡ሬᰦ䰤h㧼փ⒯䟽㧼փᒢ䟽
图 7 Xyn11Bm-12 在 10 L 发酵罐中菌体湿重和干重含量
的变化
2015,31(5) 191汪艳等：来源于瘤胃厌氧真菌 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
2.4 重组Xyn11Bm的酶学性质
2.4.1 重组 Xyn11Bm 的最适温度和热稳定性 图 9
显示，在 20-50℃之间，随着温度的升高，相对酶
活性逐渐提高，超过 50℃后，酶活性逐渐下降，表
明该酶的最适反应温度为 50℃。热稳定性试验表明，
重组木聚糖酶 Xyn11Bm 在 20-40℃左右的条件下具
有较好的稳定性。但是当温度超过 40℃后，酶活性
迅速下降，升到 70℃时已基本无活性，表明重组
Xyn11Bm 不耐受高温。
麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖，相对活性
分别为 15%、100% 和 175% ；但该酶不降解地衣多
糖和大麦 β-葡聚糖。
6000
5000
4000
3000䞦⍫ᙗ/U·mL-1  ∄⍫ᙗ /U·mg-1 2000
1000
0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600䈡ሬᰦ䰤h䞦⍫ᙗ∄⍫ᙗ
图 8 Xyn11Bm-12 在 10 L 发酵罐中酶活性的变化
2.4.2 重组 Xyn11Bm 的最适 pH 和 pH 稳定性 如
图 10 所示，重组 Xyn11Bm 的最适反应 pH 为 5.0，
并且在 pH6.0-10.6 条件下也有较高活力，在 pH10.6
时相对酶活性为 96.95%。Xyn11Bm 酶在 pH5.0-8.0
的条件下具有较好的稳定性，剩余的活力在 80% 以
上，表明重组 Xyn11Bm 具有一定的耐酸碱性。
2.5 重组木聚糖酶的底物特异性
图 11 显示，重组木聚糖酶 Xyn11Bm 可水解燕
120
100
80
60⴨ሩ䞦⍫ᙗ/% 40
20
0
0 20 40 60 80 100৽ᓄ⑙ᓖć ᴰ䘲৽ᓄ⑙ᓖ✝っᇊᙗ
图 9 重组 Xyn11Bm 的最适温度和热稳定性
120
100
80
60䞦⍫ᙗ/U·mL-1  40
20
0
-20
0 2 4 6 8 10 12
pH٬ᴰ䘲pHpHっᇊᙗ
图 10 重组 Xyn11Bm 的最适 pH 和 pH 稳定性
3 讨论
木聚糖水解酶系主要包括主链上的水解酶 β-D-
1，4 内 切 木 聚 糖 酶（EC 3.2.1.8， 简 称 木 聚 糖 酶 ）、
β-D-1，4 外切木糖苷酶和侧链上的水解酶 α-L-阿拉伯
呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶
等。在这些酶中，β-D-1，4 内切木聚糖酶对木聚糖降
解起主要作用［12］。厌氧真菌 Neocallimastix frontalis
是 瘤 胃 中 降 解 木 聚 糖 和 纤 维 素 的 主 要 微 生 物 之
一，研究者先后从中分离获得了 Xyn11A、Xyn11B、
Xynsk 等多个木聚糖酶基因并在大肠杆菌中获得
表达，并且 Xyn11B 的比酶活性最高，达到 3 794
U/mg［13］。虽然大肠杆菌表达系统由于其培养成本廉
价以及操作过程简单，常被作为外源基因表达的首
选。但是，木聚糖酶在大肠杆菌中表达后往往表达
0 ਟⓦᙗᵘ㚊㌆ ẖᵘᵘ㚊㌆ ⠅哖ᵘ㚊㌆ བྷ哖β-㪑㚊㌆ ൠ㺓ཊ㌆ᓅ⢙50100150⴨ሩ䞦⍫ᙗ% 200
图 11 重组 Xyn11Bm 的的底物特异性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5192
水平较低甚至没有活性。这主要是因为稀有密码子
的存在和翻译后需后续进一步加工的缘故，如形成
二硫键和糖基化。木聚糖酶通常需要 N-糖基化，而
大肠杆菌对表达的外源蛋白只具有 O-糖基化作用［5］。
与大肠杆菌相比，酵母表达系统更具优势 ：具有翻
译后的修饰、可高密度发酵、将外源蛋白分泌到培
养基便于纯化、不含大肠杆菌毒素更易于在食品中
应用等［14］。因此，本研究首选利用毕赤酵母 GS115
表达 Xyn11B 基因。
提高外源基因在宿主中的表达的途径之一是对
外源基因的密码子进行优化。当外源基因中含有稀
有密码子时将严重制约其在宿主中的表达［15］。在
对外源基因密码子优化时，主要应考虑稀有密码子
的替换、消除 AT 富集区和 G+C 含量的调整。除此
以外，本研究还考虑了 mRNA 隐蔽剪接位点和自
由能。通过对外源基因密码子优化后，大量外源基
因在毕赤酵母中得到了高水平表达。如纤维素酶基
因优化后酶活性提高 1.24 倍［15］，外切葡聚糖酶基
因优化后表达水平提高了 25%［11］。Tsai 等［16］利用
酿酒酵母和毕赤酵母分别表达了源于瘤胃厌氧真菌
Neocallimastix frontalis 的一个木聚糖酶基因，在诱导
10 d 后木聚糖酶活性分别达到 5 400 U/mL 和 6 200
U/mL。在本试验中，优化后的 Xyn11Bm 基因在毕
赤酵母中诱导表达 96 h 时酶活性最高达到 5 139.7
U/mL。这说明，该基因工程菌具有一定的应用价值。
培养基是影响酵母生长的重要因素之一。在利
用 毕 赤 酵 母 GS115 进 行 高 密 度 发 酵 时，Invitrogen
推 荐 基 础 盐 培 养 基（Basal salts medium，BSM） 和
PMT1 微量元素溶液搭配使用［17］。但近期的研究发
现，毕赤酵母在 BSM 中生长时延滞期较长，因此宿
主菌要达到对数生长期所需的时间也较长［18］。毕赤
酵母在高密度发酵时菌体干重一般在 75-100 g/L［19］。
菌体湿重和干重是反映高密度发酵的重要指标，提
高受体酵母菌的生长速度有利于外源基因的表达。
本研究采用了 FM22/PMT4 培养基，在诱导培养 96 h
时发酵液中菌体湿重和干重分别达到了 274.6 g/L 和
123.6 g/L。本研究结果表明，FM22/PMT4 培养基更
有利于毕赤酵母的生长，因此，可能也更有利外源
基因的表达。
范志恒［20］报道，以不同底物评价黑曲霉木聚
糖酶活性时，以小麦木聚糖为底物时的酶活最高，
其次是燕麦木聚糖，再次是山毛榉木聚糖，以桦木
木聚糖为底物时的酶活最低。本研究中表达的重组
木聚糖酶可以水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶
性木聚糖，并且酶活性有较大差别。燕麦木聚糖属
于水不溶性木聚糖，桦木木聚糖属于部分水不溶性
木聚糖，木聚糖酶通过内切方式作用于木聚糖主链
内部的 β-1，4 木糖苷键，降低木聚糖的聚合度［21］。
溶解率大的聚糖，其结构支链多或聚合度小，因此
更易于分解。此外，不同来源的木聚糖在分子结构，
尤其在侧链构成上存在差异，并影响木聚糖酶的结
合与水解［22］。这可能是导致不同底物表现出不同酶
活性的原因之一。
4 结论
本研究实现了 Neocallimastix frontalis 木聚糖酶
基因 Xyn11Bm 在毕赤酵母中的高密度发酵，最高酶
活性为 5 139.7 U/mL，最适反应温度为 50℃，最适
反应 pH 为 5.0。该酶在 pH5.0-8.0 之间具有较好的
稳定性，可水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性
木聚糖，但不降解地衣多糖和大麦 β-葡聚糖。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）