全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
在干旱、盐碱、高温、低温、化学毒害和氧化
胁迫等非生物胁迫下,植物可通过自身改变体内蛋
白质组成来适应不断变化的外界环境[1]。而植物中
的小分量热激蛋白(small heat shock protein,sHSP)
正是这样一类受干旱、盐碱、低温、氧化胁迫等条
件诱导而特异表达的蛋白质[2,3]。sHSP 分子质量大
都小于 30 kD,由核基因编码,分别定位于细胞质的
class I 和 class II、内质网、叶绿体和线粒体[4]。其
中定位于叶绿体小分子量热激蛋白(CPHSP)的结
构比较特殊,当植物遇到热胁迫时,可有效的保护
收稿日期 : 2012-04-20
基金项目 : 国家自然基金项目(30671242), 山东省科技发展计划(J12LE07)
作者简介 : 郭尚敬 , 男 , 副教授 , 研究方向 : 生物化学与分子生物学 ; E-mail: guoshangjing@lcu.edu.cn
通讯作者 : 冀芦沙 , 女 , 博士 , 讲师 , 研究方向 : 生物化学与分子生物学 ; E-mail: jilusha@lcu.edu.cn
甜椒叶绿体小分子量热激蛋白(CaHSP26)对大肠杆菌
抗氧化能力的影响
郭尚敬 李妹芳 孟庆杰 冀芦沙
(聊城大学,聊城 252059)
摘 要 : 旨在探讨大肠杆菌中 CaHSP26 基因的异源表达对原核生物抗氧化能力的影响。通过构建 CaHSP26 基因原核表达载
体 pET30-CaHSP26,经不同浓度过氧化氢处理后,分析大肠杆菌菌种存活率及抗氧化能力。结果表明,与转空载体 pET-30a(+)
的对照大肠杆菌菌株 P30 相比,过量表达 CaHSP26 提高了转基因的大肠杆菌菌株 P750 过氧化氢胁迫下的存活率,降低了 MDA 的
产生,CaHSP26 的表达可以提高原核生物抗氧化能力。试验初步证实超表达 CaHSP26 的转基因烟草生长势明显高于对照,为今后
研究植物中 CaHSP26 抗氧化能力的作用机理提供依据。
关键词 : 甜椒叶绿体小分子量热激蛋白(CaHSP26) 原核表达 抗氧化能力
Heterologous Expression of CaHSP26 Gene in Escherichia coli
Enhances Its Viability Under Oxidative Stress
Guo Shangjing Li Meifang Meng Qingjie Ji Lusha
(Liaocheng University,Liaocheng 252059)
Abstract: The research is focused on the oxidative stress tolerance of CaHSP26 in Escherichia coli. In the study, CaHSP26 was
constructed in the prokaryotic expression vector pET30-CaHSP26, and the expression was induced by IPTG. The antioxidant capacity and cell
survivalility induced by H2O2 were detected to study the biological functions of CaHSP26 in prokaryote. The results proved that heterologous
expression of CaHSP26 in E. coli highly increased the antioxidant capacity of E. coli and reduced the MDA production compared to the empty
vector pET-30a(+). We thus suggested that CaHSP26 enhanced the oxidative stress tolerance of prokaryote.
Key words: Chloroplast small heat shock proteins gene(CaHSP26) Prokaryotic expression Oxidative stress tolerance
光合作用系统[5,6]。在蓝细菌中 CPsHSP 通过与特
定的膜脂互作保持膜脂的物理相位和脂双层的稳定
结构,从而有效保护 PSII 的电子传递系统[7]。番茄
离体试验证实,高温条件下 CPsHSP 可以保护 PS Ⅱ
的电子传递以及放氧复合体活性。另外,CPsHSP 还
参与植物的低温防御[8,9]。
活性氧的积累是生物响应逆境胁迫的共有机
制[10]。前人的研究表明,植物叶片中 H2O2 降解能
力的下降是逆境胁迫下植物发生氧化伤害和膜脂过
氧化的根源,在胁迫条件下活性氧的累积引起氧化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期156
胁迫,从而影响细胞器甚至整个细胞的功能[11]。逆
境下植物产生的过量活性氧会伤害膜系统,造成膜
脂过氧化,活性氧还伤害到细胞内的其他组分,引
起酶活性的变化[12],造成细胞生命活动受阻,产生
逆境伤害。研究发现,逆境条件下叶绿体 sHSP 对
活性氧清除酶,如 SOD、POD 和 APX 等有一定的保
护作用,但是逆境胁迫下叶绿体 sHSPs 与活性氧伤
害引起的细胞生命活动之间有何种必然联系,一直
未见报道。
本试验以甜椒中的 CPsHSP(CaHSP26)为研
究材料。前期的研究工作表明,CaHSP26 的过量表
达可有效的提高转基因烟草的耐冷性来保护 PSⅠ和
PS Ⅱ的蛋白结构稳定[4],在热激条件下 CaHSP26
有可能具有分子伴侣的作用,参与蛋白质的保护,
从而维持高温条件下细菌的活力[6]。本试验构建
pET-CaHSP26 原核表达载体,在 E. coli BL21 中诱
导表达,在活体内研究氧化胁迫下 CaHSP26 对大肠
杆菌的抗氧化能力的影响。结果证明,CaHSP26 基
因的高表达提高了 E. coli 的抗氧化能力,从而说明
sHSPs 与活性氧清除有必然联系,在氧化胁迫下的
分子反应机制还需进一步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
试材茄门甜椒(Capsicum annuum L.)购自聊城
种子公司。温室播种,盆栽培养 60 d 后在光照培养
箱中 42℃下热激 2 h。克隆受体大肠杆菌菌株为
DH5α,原核表达为 BL21 大肠杆菌菌株,克隆载体
pMD18-T Vector、原核表达载体为 pET-30a(+),限
制性内切酶为宝生物(大连)公司产品。PCR 产物
纯化试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司
产品,MMLV 逆转录酶、T4 DNA 连接酶、碱性磷酸
酶等修饰酶、IPTG、X-Gal、DNA Marker DL2000 等
试剂及胶回收试剂盒为宝生物(大连)公司产品。
Taq DNA 聚合酶为上海博亚生物技术有限公司产品,
氨苄青霉素、低熔点琼脂糖、HRP 标记的羊抗鼠
IgG 二抗为 Sigma 公司产品,其余试剂为分析纯。小
白鼠购自山东济南小白鼠繁殖场。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体的构建与表达 将甜椒幼苗
42℃ 热激 2 h,液氮研磨 Trizol 法提取幼叶总 RNA
(方法参照上海生工生物工程技术服务有限公司
Trizol 试剂盒说明),然后用 MMLV 反转录酶 反转录
cDNA。以甜椒叶片 cDNA 为模板进行 PCR 扩增获
得该基因的全长 cDNA。反应程序为 : 94℃预变性 5
min ;94℃变性 30 s,50℃复性 30 s,72℃延伸 60 s,
35 个循环 ;72℃延伸 10 min。将 PCR 产物与克隆载
体 pMD18-T 进行连接,转化大肠杆菌 DH5α,在含
氨苄青霉素(Kan)的培养基上进行筛选重组克隆,
获得 pMD750 克隆载体重组子菌株。将 pMD750 质
粒与原核表达载体 pET-30a(+)同时进行 BamH I、
Hind III 双酶切,将二者连接,转化 DH5α,在含卡
那霉素的培养基上进行筛选重组克隆 pET-CaHSP26
菌株。提质粒转化大肠杆菌表达菌株 BL21。在含卡
那霉素的培养基上进行筛选,筛出重组克隆菌株,
测序鉴定,并将测序结果与在 GenBank 注册的序列
AY224603.1 比对。将阳性克隆 P750 质粒转化原核
表达菌株 BL21,酶切鉴定并筛选获得阳性单菌落 ;
挑取 P750 的阳性单菌落,接种到 5 mL 含卡那霉素
的 LB 培养基中,于 37℃ 振荡培养过夜 ;取 1 mL 菌
液接入 10 mL 含卡那霉素的 LB 培养基中,于 37℃
振荡培养至 OD600=0.2-0.5 ;加入终浓度 0.5 mmol/L
IPTG,于 37℃继续振荡培养 4 h ;取 1 mL 菌液,参
照 Ni-Agarose NTA 蛋白纯化试剂盒的使用说明,把
IPTG 诱导后的菌体重悬于细菌裂解液(50 mmol/L
Tris·HCl pH7.9;0.5 mmol/L EDTA;50 mmol/L NaCl;5%
甘油 ;0.5 mmol/L TT)中,冰浴超声破碎菌体(超
声 5 s,间隔 5 s,120 次循环,功率 400 W),12 000 r/min
离心 10 min,取上清进行 SDS-PAGE(12% 分离胶,
5% 浓缩胶)电泳。将沉淀分别用 20 mmol/L Tris·
HCl 和 2.0 mol/L 的脲洗涤后,溶于 8 mol/L 尿素溶
液,4℃离心(12 000 r/min)15 min,收集上清,进
行 SDS-PAGE 电泳检测。
1.2.2 制备多克隆抗体 将阳性克隆 P750 质粒转
化原核表达菌株 BL21,酶切鉴定并筛选获得阳性单
菌落 ;挑取 P750 的阳性单菌落,接种到 5 mL 含卡
那霉素的 LB 培养基中,于 37℃ 振荡培养过夜 ;取
1 mL 菌液接入 10 mL 含卡那霉素的 LB 培养基中,
于 37℃振荡培养至 OD600=0.2-0.5 ;加入终浓度 0.5
mmol/L IPTG,于 37℃ 继续振荡培养 4 h ;取 1 mL
2012年第11期 157郭尚敬等 :甜椒叶绿体小分子量热激蛋白(CaHSP26)对大肠杆菌抗氧化能力的影响
菌液,12 000 r/min 离心 30 s,弃上清,加入 2 倍上
样缓冲液,振荡悬浮,沸水中加热 5 min,10 000 r/min
离心 30 s 后准备上样。 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-
PAGE)观察是否有差异带,将聚丙烯酰胺凝胶上的
差异带(多条泳道)切下,收集到 5 mL 离心管中,
用液氮研碎,溶于 PBS 中,多次免疫小白鼠。采取
小鼠血液,分离制备多抗血清作为一抗。
1.2.3 Western blotting 检 测 菌 体 总 蛋 白 经 SDS-
PAGE 分离,转印至 PVDF 膜,5% 牛血清蛋白封闭
过 夜,PBS 洗 涤 后 加 入 1 500 稀 释 的 CaHSP26 多
抗血清,二抗为 1 5 000 稀释的 HRP 标记的羊抗鼠
IgG,DAB/H2O2 显色后双蒸水终止反应。
1.2.4 大肠杆菌抗氧化性测定 细菌细胞在 LB 液体
培养基中 37℃ 培养,当其 OD600=1.0 时取 500 μL 用
新鲜的含卡那青霉素的 LB 培养基 40 mL 稀释,扩
大培养 2 h 后,加 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/L。诱
导培养 4 h 后,将大肠杆菌分别用不同浓度的 H2O2
处理。然后将处理后的菌液梯度稀释 104-107 倍,涂
LB 平板,进行菌落计数。每个浓度 6 个重复。
1.2.5 MDA 测定 参照文献 [6]。每个处理 6 个重复。
1.2.6 植物表达载体构建及烟草叶圆盘转化 将克
隆到的 CaHSP26 基因序列替换掉 pBI121 表达载体
上 GUS 基因区域得到系列植物表达载体 P1。将构
建好的表达载体转入农杆菌菌株 LBA4404 内。农杆
菌感受态细胞的制备、转化及鉴定方法,及叶圆盘
法转化烟草方法见参考文献[4],获得转基因植株,
并对转化的烟草进行分子生物学检测。
1.2.7 转基因烟草的 RT-PCR 鉴定及胁迫条件下转
基因烟草的处理 取对照野生型烟草及转基因卡那
霉素抗性烟草叶片,用 Trizol 法抽提总 RNA(参照
Trizol kit 说明书的方法)。以 RNA 为模板,MMLV 反
转录酶扩增出第一条 cDNA 链,再用 CaHSP26 基因
的特异性引物进行扩增 :FW :5-ACCCACAGATGG-
TTAGAGAGGC-3 ;RV :5-CTCTCCAAATGAAATGA-
ACTTC-3。同时以 28S 作为内参标记基因。
将生长发育阶段一致的 T0 代转基因烟草和未
转基因对照植株移栽到花盆中,待长至 4-6 叶期时
浇足水。高温处理时,将烟草植株处理 7 d[32℃,
120 μmol/(m2 ·s),16 h 光照,8 h 黑暗]。每株系测
定 3 株,平行测定后取平均值。
2 结果
2.1 CaHSP26的原核表达及Western blotting检测
以甜椒 cDNA 为模板,PCR 克隆 CaHSP26 基因,
将其构建到原核表达载体 pET-30a(+),筛出重组
克隆 pET-CaHSP26 菌株,测序鉴定并命名为 P750。
同时转空载体 pET-30a(+)到 BL21 作为对照,命
名为 P30。如图 1-A 所示,经 0.5 mmol/L IPTG 诱导
后大肠杆菌中 CaHSP26 蛋白质的表达情况。1 泳道
为转空载体 P30 的 BL21 菌株总蛋白,2-5 泳道为
P750 菌株经 IPTG 诱导 4 h 后蛋白表达检测。在图中
约 33.5 kD 处出现目的蛋白条带,其中 2、4 和 5 泳
道为表达的可溶性融合蛋白,第 3 泳道目的蛋白以
包涵体的形式表达。在诱导表达的 CaHSP26 蛋白中
可溶性蛋白较多,表明 CaHSP26 异源表达大部分仍
具生物活性,可在大肠杆菌中研究其生物学功能。
图 1-B 为 转 空 载 体 P30 及 P750 的 原 核 菌 株
中 CaHSP26 蛋 白 的 Western blotting 检 测。P750 的
BL21 菌株总蛋白与多克隆抗体 IgG750 杂交检测结
果显示,多克隆抗体 IgG750 与 P750 的 BL21 菌株表
达的蛋白差异带特异性结合,表明 P750 菌株中过量
表达 CaHSP26。
A: 1. P30 空载体菌株;2,4,5. P750 上清蛋白;3. P750 沉淀蛋白;
B :1. P30 空载体菌株 ;2-4. 转 P750 的原核菌株
图 1 CaHSP26 的原核表达(A)及 Western
blotting 检测(B)
1A
B
2 3 4 5
1 2 3 4
M
80
kD
60
40
30
20
12
CaHSP26-His
2.2 不同浓度H2O2胁迫下大肠杆菌的存活率
将诱导表达的 P750 菌液分别加入 H2O2 使终浓
度 为 0、0.3、0.5、0.7、0.9、1 和 2 mmol/L, 处 理
20 min,涂 LB 平板过夜培养,统计菌落数如图 2 所示,
每个浓度 6 个重复。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期158
子的氨基发生作用,导致多肽链的链内交联和链间
交联,从而导致代谢异常。丙二醛(MDA)是植物
细胞膜脂过氧化的产物,其含量大小是衡量植物细
胞膜脂过氧化和质膜受损伤程度的重要指标,被广
泛用来区分胁迫耐性。为了进一步研究大肠杆菌细
胞膜的伤害程度,测定不同 H2O2 处理浓度下大肠杆
菌的 MDA 含量。
图 2 空载体菌株 P30 和转基因菌株 P750 经不同浓度
H2O2 处理后的存活率
P30
P750
120
100
80
60
40
20
0
0 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0 1.2
བྷ㛐
ᵶ㧼
ᆈ⍫
⦷%
H2O2⎃ᓖmmol/L
由图 2 可以看出,随着 H2O2 浓度的提高,两种
基因型的大肠杆菌存活率都逐渐降低,且同浓度下
P30 的存活率明显低于 P750,其中 P30 的存活率随
H2O2 浓度的升高迅速下降,而 P750 的存活率变化
幅度较小。H2O2 浓度低于 1 mmol/L 时,存活率基本
稳定在 50% 以上,当浓度到达 2 mmol/L 时转空载体
菌株不能存活,而 P750 菌株仍然有 32.58% 的存活
率,说明其能承受较高浓度的 H2O2。两种基因型的
存活率差异显著,应该与 P750 的过量表达 CaHSP26
基因有直接关系。
2.3 高浓度H2O2胁迫处理后CaHSP26的表达分析
2 mmol/L H2O2 浓度处理 1 h 后的转基因菌株中
CaHSP26 蛋白的 SDS-PAGE 检测如图 3 所示。第 1
泳道中 P30 大肠杆菌内蛋白质呈弥散降解趋势,但
是转基因的 P750 大肠杆菌的蛋白(2、3 和 4 泳道)
降解较少,条带仍然清晰,表明 sHSP 对细胞内的
蛋白有保护作用。
1. P30 总蛋白 ;2-4. P750 总蛋白 ;M. 预染分子量标准
图 3 空载体菌株 P30 和转基因菌株 P750 经
2 mmol/L H2O2 处理后的蛋白分析
1 2 3 4 M
80
kD
60
40
30
20
A. 不同浓度 H2O2 处理 1.5 h 后 MDA 的含量 ;B. 不同浓度
H2O2 处理 2 h 后 MDA 的含量
图 4 不同浓度 H2O2 处理下转基因菌株 P750 的 MDA 含量
40
30
20
25
35
15
0 2 4 8
0$⎃
ᓖ1
0-
2 m
m
ol
/L
H2O2⎃ᓖmmol/L
P30
P750
A
40
30
20
25
35
15
0 2 4 8
0$⎃
ᓖ1
0-
2 m
m
ol
/L
H2O2⎃ᓖmmol/L
P30
P750
B
如图 4 所示,不同浓度 H2O2 处理不同时间对转
基因 CaHSP26 的大肠杆菌 P750 和转空载体的 P30
的 MDA 含量影响显著。结果表明,不同浓度 H2O2
处 理 1.5 h 后( 图 4-A),P30 和 P750 菌 液 MDA 含
量随着处理浓度的增加均有增加,说明它们都受到
氧化胁迫的影响,导致生物膜不同程度降解。其中
MDA 在转空载体 P30 的菌株中急剧积累,而在转基
因 P750 菌株中含量增长缓慢,说明转基因 CaHSP26
的大肠杆菌 P750 的生物膜在处理较短时间内受破坏
程度低,在 1.5 h 处理时间内具有较强的抗氧化性。
处理 2 h 后(图 4-B),随着处理浓度的增加,P750
菌液 MDA 含量急剧上升,说明过量表达 CaHSP26
短时间内保护细菌的细胞膜不受到氧化胁迫的严重
影响,但长时间的高浓度胁迫超过了保护能力,导
2.4 MDA的测定
MDA 是膜脂过氧化的最终产物,可与蛋白质分
2012年第11期 159郭尚敬等 :甜椒叶绿体小分子量热激蛋白(CaHSP26)对大肠杆菌抗氧化能力的影响
致生物膜快速降解。转空载体的 P30 在低浓度短时
间内 MDA 急剧积累已达到较大值,而趋于稳定。
2.5 CaHSP26在烟草中的功能鉴定
为研究 CaHSP26 的大量积累对植物体自身在氧
化胁迫下提供暂时的保护机制,本试验拟在烟草中
对其表达调控功能进行鉴定。将克隆到的 CaHSP26
基因序列替换掉 pBI121 表达载体上 GUS 基因区域
得到系列植物表达载体 P1,随即转化农杆菌,运用
农杆菌介导烟草叶圆盘法转化,得到稳定表达的转
基因烟草植株。以转基因烟草总 DNA 为模板,用
可扩增 CaHSP26 基因的特异性引物进行 PCR 反应,
检测外源片段是否整合到基因组中(图 5-A)。32℃
高温处理生长发育阶段一致的 T0 代转基因烟草和未
转基因对照植株 1 周,结果如图 5-B 所示,超标达
CaHSP26 基因的转基因烟草生长势显著强于对照。
研究小分子量热激蛋白在活体内的抗氧化功能,以
叶绿体小分子量热激蛋白 CaHSP26 为研究对象,克
隆 CaHSP26 基因的 cDNA 全长,构建原核表达载体
P750,使其在大肠杆菌 BL21 中的过量表达,通过
Western blotting 筛选阳性克隆,再进行逆境抗性分析。
如图 1-A 所示,过量表达的 CaHSP26 大部分
存在于上清中,说明异源表达的 CaHSP26 基因具有
生物活性,在行使生物学功能上发挥积极作用。目
前科学界普遍认为 sHSPs 主要作为分子伴侣来保护
其他蛋白保持正常的活性[16],能有效地阻止胁迫
引起的正常蛋白的聚合和错误折叠[15]。过量表达
CaHSP26 的 P750 菌株在不同浓度的氧化胁迫下,都
比对照转空载体的 P30 菌株存活率高,说明了过
量表达 CaHSP26 基因提高大肠杆菌的抗氧化性。2
mmol/L H2O2 处理 1 h 后转基因大肠杆菌 P750 的蛋
白降解较少,然而转空载体的对照菌株中蛋白已成
降解趋势,因此推测 CaHSP26 可能在胁迫下保护其
他蛋白的构象和活性,维持细胞的稳定性,从而提
高了大肠杆菌细胞逆境胁迫下的存活率。
由于 MDA 含量和质膜透性大小是衡量细胞膜
脂过氧化程度的重要指标,结果显示,在强氧化剂
H2O2 胁迫下过量表达 CaHSP26 基因不仅提高存活
率,而且降低 MDA 含量,因此说明 CaHSP26 可显
著缓解氧化胁迫对细胞造成的伤害。本试验证明了
CaHSP26 不仅与蛋白质互作,也保护膜脂不受氧化
伤害以维持膜稳定性。同时探讨强氧化剂 H2O2 处
理后,大肠杆菌异源表达 sHSPs 与活性氧代谢之间
的关系初步证明,sHSPs 的大量积累将会为植物体
自身在氧化胁迫下提供暂时的保护机制。叶绿体热
激蛋白基因 CaHSP26 基因在提高大肠杆菌抗 ROSs
过程中发挥了积极的作用,可以较大程度的保护细
胞内的蛋白和膜脂,避免 ROSs 对其造成伤害。进
一步说明 sHSP 保护细胞机理方面的功能,从而推
测在植物体内也有类似功效。目前国内外科研工作
者致力于植物 HSP 蛋白在胁迫条件下保护机制的研
究,在热激后蓝藻中,失活的 HSP17 降低了与类囊
体膜互作,从而导致活性氧转化活性的急剧下降[17]。
在胁迫条件下的转 HSP21 基因的烟草中,组成型
表达该蛋白尽管未能提高 PS Ⅱ的耐热性,但证明
了 HSP21 保护 PS Ⅱ免受温度引起的氧化胁迫[18]。
WT
A
B
P1
WT
P1
CaHSP26
tublin
A :高温处理后的转基因烟草及 WT 对照 ;B :转基因烟草及对照的 RT-PCR
检测。P1 为超表达 CaHSP26 的转基因烟草 ;WT 为野生型 ;各 5 个重复
图 5 转基因烟草的检测及高温处理
3 讨论
sHSPs 是植物中含量最为丰富的一类小分子量
热激蛋白,很多试验已经证明 sHSPs 的积累与植物
耐热性或耐冷性等逆境密切相关[13-15]。多种逆境条
件可以诱导 sHSPs 基因的表达,说明 sHSPs 是植物
中一类响应逆境的应激蛋白。同时,sHSP 的产生与
植物的抗逆性有一定的关系。2002 年,Tsvetkova 等[9]
提出 sHSPs 与膜脂互作保持了低温条件下膜脂的流
动性,但对其特有的生物学功能却知之甚少。在叶
绿体中,胁迫诱导 ROS 的产生,类囊体膜上的 PSⅠ
和 PSⅡ反应中心是 ROSs 产生的主要部位[11]。叶绿
体中的 H2O2 可诱导产生·OH 启动膜脂过氧化,从
而引起叶绿体膜脂过氧化产物 MDA 的增加。为了
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期160
Heckathorn 等于 2002 年证实叶绿体 sHSPs 可以保护
光合电子传递链,减轻高温胁迫引起的光抑制。然
而甜椒中 CaHSP26 蛋白在胁迫条件下的保护机制仍
需要进一步深入研究,从而为研究小分子量热激蛋
白的作用机理提供有效的试验和理论依据。
4 结论
本试验以前期分离的甜椒中 CPsHSP(CaHSP26)
为研究对象,构建 pET-CaHSP26 原核表达载体,在
E. coli BL21 中诱导表达,在活体内研究氧化胁迫下
CaHSP26 基因对大肠杆菌的抗氧化能力的影响。结
果 证 明,CaHSP26 基 因 的 高 表 达 提 高 了 E. coli 的
抗氧化能力,从而说明 sHSPs 与活性氧清除有必然
联系。
参 考 文 献
[1] Swindell WR, Huebner M, Weber AP. Transcriptional profiling of
Arabidopsis heat shock proteins and transcription factors reveals
extensive overlap between heat and non-heat stress response
pathways. BMC Genomics, 2007, 8: 125.
[2] Luo HB, Pongpan L, Frank TR. An exceptionally stable Group II
chaperonin from the hyperthermophile Pyrococcus furiosus. Archives
of Biochemistry and Biophysics, 2009, 486(1): 12-18.
[3] Scharf KD, Siddique M, Vierling E. The expanding family of
Arabidopsis thaliana small heat stress proteins and a new family
of proteins containing α-crystallin domains(Acd proteins). Cell
Stress Chaperones, 2001, 6(3): 225-237.
[4] Guo SJ, Zhou HY, Zhang XS, et al. Overexpression of CaHSP26 in
transgenic tobacco alleviates photoinhibition of PSII and PSI during
chilling stress under low irradiance. Journal of Plant Physiology,
2007, 164(2): 126-136.
[5] Török Z, Goloubinoff P, Horvath I, et al. Synechocystis HSP17 is
an amphitropic protein that stabilizes heat stressed membranes
and binds denatured proteins for subsequent chaperone-mediated
refolding. Proc Nat Acad Sci USA, 2001, 98(6): 3098-3103.
[6] 郭尚敬 , 郭鹏 , 董新纯 , 孟庆伟 . 甜椒 CaHSP26 的 cDNA 克隆
与表达 . 园艺学报 , 2006, 33(6): 1247-1252.
[7] Ibolya H, Gabriele M, Alois S, László V. Membrane-associated stress
protein: More than simply chaperones. Biochimica et Biophysica
Acta, 2008, 1778(7-8): 1653-1664.
[8] Sato Y, Murakami T, Funatsuki H, et al. Heat shock-mediated
APX gene expression and protection against chilling injury in rice
seedlings. J Exp Bot, 2001, 52(354): 145-151.
[9] Tsvetkova NM, Horvath I, Török Z, et al. Small heat-shock proteins
regulate membrane lipid polymorphism. Proceedings of the National
Academy of Sciences of USA, 2002, 99(21): 13504-13509.
[10] Anna MT, Maria GE, Lello Z. Proteomics applied on plant
abiotic stresses: Role of heat shockproteins(HSP). Journal of
Proteomics, 2008, 71(4): 391-411.
[11] Nicolas LT, Tan YF, Richard PJ, Harvey MA. Abiotic environmental
stress induced changes in the Arabidopsis thaliana chloroplast,
mitochondria and peroxisome proteomes. Journal of Proteomics,
2009, 72: 367-378.
[12] Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance.
Trends Plant Science, 2002, 7: 405-410.
[13] Heckathorn SA, Ryan SL, Baylis JA, et al. In vivo evidence from
an Agrostis stolonifera selection genotype that chloroplast small
heat shock proteins can protect photosystem during heat stress.
Functional Plant Biology, 2002, 29(8): 933-944.
[14] Friedrich KL, Giese KC, Buan NR, Vierling E. Interactions between
small heat shock protein subunits and substrate in small heat shock
protein substrate complexes. J Biol Chem, 2004, 279: 1080-1089.
[15] Changle M, Martin H, Lavanya B, et al. Identification and
characterization of a stress-inducible and a constitutive small heat-
shock protein targeted to the matrix of plant peroxisomes. Plant
Physiology, 2006, 141(1): 47-60.
[16] Stromer T, Ehrnsperger M, Gaestel M, Buchner J. Analysis of the
interaction of small heat shock proteins with unfolding proteins.
Journal of Biological Chemistry, 2003, 278: 18015-18021.
[17] Hǎmdah IU, Sundby C. Does the chloroplast small heat shock
protein protect photosystem during heat stress in vitro. Physiologia
Plantarum, 2001, 111(3): 273-275.
[18] Inbal NS, Tal I, Susan L, David W. Dual Role for Tomato Heat
Shock Protein 21: Protecting photosystem II from oxidative stress
and promoting color changes during fruit maturation. The Plant
Cell, 2005, 17(6): 1829-1838.
(责任编辑 马鑫)