全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第5期
随着市场需求量的增加，果蔬的种植面积越来
越大，特别是保护地栽培面积的增加，病害的防控
成为生产环节的重中之重。传统的化学防治，不仅
造成果蔬上的农药残留，危及人畜健康，而且严重
的污染环境，已不符合当前人们对品质生活的要求。
同时，化学农药的大量使用，导致了耐药性菌株的
出现，使防治效果不断下降［1-3］。运用微生物进行
生物防治是一种有效的防治手段，在农业生产中的
作用也逐渐体现［4］。近年来，越来越多的微生物被
分离和鉴定出来，用于生物防治的研究［5，6］。
真核生物的 rRNA 基因是高度重复的串联序列
单位，由 18S、5.8S 和 28S rRNA 联结组成 1 个转录
收稿日期 ：2013-11-13
基金项目 ： 国家自然基金青年项目（31301780），教育部科学技术研究重点项目（211043），黑龙江省教育厅海外学人项目（1252HQ011），
教育厅新世纪优秀人才项目（1251-NECT-004），东北农业大学博士启动金项目（2012RCB20）
作者简介 ：陈秀玲，女，博士，助理研究员，研究方向 ：植物病害生物防治 ；E-mail ：xiuling.chen@ymail.com
通讯作者 ：王傲雪，男，博士，教授，研究方向 ：植物细胞分子生物学与植物病害生防机理 ；E-mail: axwang@neau.edu.cn
一株淡色生赤壳菌的生防作用分析及系统发育树构建
陈秀玲  李景富  张丽莉  张俊峰  王傲雪
（东北农业大学，哈尔滨 150030）
摘 要： 保护地栽培面积的增加使果蔬病害的防治难度加大，生物防治手段越来越受到青睐。采用平板对峙法、扫描电镜法、
5.8S rDNA-ITS 序列分析及系统发育树构建对一株从草炭土中分离的菌株进行研究。该菌对番茄灰霉病、番茄叶霉病、番茄绵疫病、
番茄黄萎病、番茄枯萎病、杨树烂皮病、杨树枯萎病和黑穗醋栗叶斑病均有抑制作用。扫描电镜显示，该生防菌对番茄灰霉病具
有明显抑制作用。5.8S rDNA-ITS 序列分析及系统发育树构建表明该菌为淡色生赤壳菌，为果蔬病害的生物防治提供了新的选择。
关键词 ： 淡色生赤壳菌 5.8S rDNA-ITS 系统发育树 番茄灰霉病
Biocontrol Efficacy and Phylogenetic Tree Analysis of a New
Bionectria ochroleuca Strain
Chen Xiuling Li Jingfu Zhang Lili Zhang Junfeng Wang Aoxue
（Northeast Agricultural University，Harbin 150030）
Abstract:  The fruit and vegetable disease controls are more difficult because the increase of protected cultivation area. Biological control
means became more and more popular in disease control process. By dual culture on PDA plates, WY-1 inhibited the growth of Botrytis cinerea,
Cladosporium fulvum, Phytophthora parasitica, Vertillium dahliae, Fusarium wilt, Valsa sordida Nit., Alternaria and Pseudopeziza ribis Kleb.
Scanning electron microscopy revealed that WY-1 inhibited the Botrytis cinerea growth significantly. 5.8S rDNA-ITS sequence alignment and
neighbor-joining phylogenetic tree reveal that WY-1 belongs to Bionectria ochroleuca, which may provide a new choice in disease control.
Key words:  Bionectria ochroleuca 5.8S rDNA-ITS Phylogenetic tree Botrytis cinerea
单位，彼此被转录单元内间隔区（ITS）分开［7］。其
中核糖体 RNA 中的 ITS 序列的进化速率较快，已被
广泛用于探讨属内种间甚至种内个体间的遗传关系。
在动物、高等植物、真菌以及藻类等种质鉴定及系
统进化研究中发挥了重要作用［8-11］。
本实验室从草炭土中分离得到一株生防真菌，
对多种病害均能起到抑制作用。本研究在对该菌生
防作用研究的基础上，对其 5.8S rDNA-ITS 的基因片
段进行扩增分析，构建系统发育树，对其遗传分类
地位进行分析，旨在为进一步利用该菌进行生物防
治奠定理论基础。
2014年第5期 185陈秀玲等：一株淡色生赤壳菌的生防作用分析及系统发育树构建
1 材料与方法
1.1 材料
供试生防菌从吉林市郊草炭土中分离得到，供
试病原菌番茄灰霉病（Botrytis cinerea）、番茄叶霉病
（Cladosporium fulvum）、 番 茄 绵 疫 病（Phytophthora
parasitica）、番茄黄萎病（Vertillium dahliae）、番茄
枯萎病（Fusarium wilt）、杨树烂皮病（Valsa sordida
Nit.）、杨树枯萎病（Alternaria）、黑穗醋栗叶斑病
（Pseudopeziza ribis Kleb.）病原真菌由实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 供试生防菌的分离 采用平板分离法，每升
分离培养基包含 MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 0.8 g、
KCl 0.15 g、NH4NO3 1 g、葡萄糖 3 g 和琼脂 20 g。高
压灭菌后，加入终浓度为 0.5 g/L 的氯霉素制备分离
平板，以抑制细菌的生长。取 1 g 土样，溶解于 9
mL 无菌水中，涂布平板后置于 22℃恒温培养箱倒
置培养，待长出菌落后，转接到马铃薯葡萄糖琼脂
培养基（potato-dextrose agar，PDA）上，进行单孢分离。
取纯化的菌落，进行后续试验。
1.2.2 供试菌株抑菌效果分析 利用对峙培养法，
对供试菌株生防作用进行研究。生防菌与病原菌分
别接种于相同组分的 PDA 培养基上活化，然后分
别从各活化菌落边缘用打孔器打下 10 mm 直径的菌
丝饼，将病原菌分别与生防菌对峙培养。生防菌菌
丝饼与病原菌菌丝饼间距离为 4 cm，并以单独培养
的病原菌菌丝饼为对照。每组试验重复进行 3 次，
对峙培养试验培养皿在 22℃恒温培养箱中倒置培
养。分别在接种后第 4 天、第 8 天测量菌落生长直
径，计算抑菌率。抑菌率计算公式为 ：抑菌率（%）
=［（对照平均直径-处理平均直径）/ 对照平均直
径］×100%。
1.2.3 供试菌株与番茄灰霉病病原菌共生的扫描电
镜分析 供试生防菌与番茄灰霉病菌共培养在同一
个培养皿中，两种菌接种间距为 1 cm，在共培养的 3、
4、5、6 和 7 d 分别取样，以供试生防菌和番茄灰霉
病菌的单独培养为对照，扫描电镜下观察不同培养
时间两种菌间的相互作用。
1.2.4 供试菌株基因组 DNA 提取 从生长 10 d 的
PDA 固体培养基上刮取 100 mg 菌丝体，在液氮中
迅速研磨，基因组 DNA 提取采用改良 CTAB 法［12］。
经 5 μL RNaseA（10 mg/mL）的消化后，DNA 沉淀
溶于 30 μL ddH2O 中，经琼脂糖电泳及分光光度计
检测后保存到 -20℃备用。
1.2.5 供试菌株 5.8S rDNA-ITS 基因片段扩增 5.8S
rDNA-ITS 基因片段扩增采用引物 ITS4 5-TCCTCCG-
CTTATTGATATGC-3，ITS5 ：5-CCTTGTTACGACT-
TTTACTTCC-3［13］。PCR 反应体系 25 μL，包括 DNA
模板 25 ng，上下游引物各 1 μL，PCR 缓冲液（10×）
2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，0.5 U Taq 酶
1.0 μL， 用 ddH2O 补 齐 25 μL。 扩 增 条 件 ：94℃ 变
性 3 min ；94℃变性 40 s，52℃退火 1 min，72℃延
伸 2 min，35 次循环 ；最后 72℃延伸 10 min。利用
UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒（上海生工生物
工程技术服务有限公司）纯化 PCR 产物，peasy-T1
cloning vector 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）
连接、转化后，进行蓝白斑筛选。选取单克隆进行
PCR 检测，阳性克隆送至北京六合华大基因科技股
份有限公司测序。
1.2.6 序列分析及系统发育树构建 序列比对利
用 NCBI 数 据 库 的 BlastX 工 具（http ：//www.ncbi.
nlm.nih.gov/BLAST/）进行，序列多重比对利用 EBI
数 据 库 的 Clustal 在 线 工 具（http ：//www.ebi.ac.uk/
Tools/clustalw2/index.html） 和 Clustalx 2.012 软 件 进
行［14］。系统发育树构建利用 MEGA 5.0（http：//www.
megasoftware.net/）［15］，采用相邻连接法（Neighbor-
joining，NJ）构建系统发育树，对构建的树进行自检
（Bootstrap），重复设定为 1 000 次。
2 结果
2.1 供试生防菌的获得及菌株抑菌效果分析
分离到的菌株培养初期菌落为白色，随培养时
间的增加逐渐转黄 ；在光照条件下为粉红色或橘红
色。抑菌试验（图 1）表明，供试生防菌对供试病
原菌都有一定抑制作用，抑菌效果随培养时间的增
加而逐渐提高。供试生防菌与病原菌接触后病原菌
菌落直径不再增加，而供试生防菌逐渐侵入病原菌
生长圈。在培养后 8 d 供试生防菌对 B. cinerea、P.
parasitica、P. ribis Kleb. 抑菌率达 87.5%，对 Vertill-
ium dahliae、Alternaria、F. wilt、C. fulvum 和 V. sord-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第5期186
ida Nit. 的 抑 菌 率 分 别 为 80%、78%、75%、62.8%
养后期（7 d），灰霉病菌的菌丝体较弱，且无分生
孢子产生，而供试生防菌生长旺盛，并且产生大量
分生孢子（图 2-C）。由此进一步证实番茄灰霉病病
原菌的生长受供试生防菌的抑制。
2.3 菌株DNA的提取
提取出的菌株 DNA，稀释 10 倍后，经紫外分
光 光 度 计 测 定，OD260/OD280>1.8，DNA 纯 度 较 好。
经计算后，DNA 浓度为 396.5 ng/μL（表 1）。
表 1 菌株 DNA 提取物纯度和含量测定结果
OD 值
DNA 浓度（ng/μL）
230nm 260nm 280nm 260nm/280nm
0.413 0.793 0.401 1.978 396.5
2.4 5.8S rDNA-ITS序列分析
以基因组 DNA 为模板，通过 PCR 反应，对 5.8S
rDNA-ITS 和 18S rDNA 扩增产物纯化、测序后，得
到 593 bp 的片段（图 3）。
0
20
40
60
80
100ᣁ㧼⦷% 4 d 8 d
B. cinerea C. fulvum P. parasitica V . dahliae㧼Ṛ F. wilt V. sordida Nit. Alternaria P. ribis Kleb.
图 1 抑菌效果分析
B. cinerea⭏䱢㧼⭏䱢㧼
B. cinerea
B. cinerea
A
B
C
A ：培养后 3 d ；B ：培养后 5 d ；C ：培养后 7 d
图 2 供试菌株与番茄灰霉病菌共生的电镜分析
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
bp
M 1 2
M ：DNA Marker ；1 ：18S rDNA PCR 产物 ；2 ：5.8S rDNA-ITS PCR 产物
图 3 18S rDNA 及 5.8S rDNA-ITS PCR 产物
和 62.5%，说明供试生防菌具有一定的抑菌作用。
2.2 供试菌株与番茄灰霉病病原菌共生的扫描电
镜分析
供试菌株与番茄灰霉病菌共培养时，番茄灰霉
病的生长受到明显抑制。在共培养 3 d 时，两种菌
的菌丝刚刚接触，灰霉病病原菌的生长几乎未受到
影响（图 2-A）。随着共培养时间的增长（5 d），B.
cinerea 的受抑制状况明显加强（图 2-B）。到了共培
2014年第5期 187陈秀玲等：一株淡色生赤壳菌的生防作用分析及系统发育树构建
GTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTTAATTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGT---A
GTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTTAATTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGT---A
GTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTTAATTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGT---A
GTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGT---A
GTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACCTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGT---A
GTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTCAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGT---A
GTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGT---A
GTGCGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGT---A
GTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTTAATTCTTGTTTTATTTTGGAGCCTCGTGTGCCCCG
***.*****************************..**.*****************..**..**.*. .*
GTTTTCACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
GTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
GTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
GTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
GTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
GTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
GTTTTTACAAACAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAGTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
GATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTT-AATTCTTGTTTTATT--TTGGAGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
.*....*.......**..**..**.**.....*.*.*.**..**...***********************
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
**********************************************************************
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
AGTATTCTGGCGGGCATGCCCGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA
********************.*************************************************
TCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
TCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
TCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
TCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
TCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
TCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
TCGGCCAAAGCCCGCGAGG-ACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
TCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
TCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGA
*******************.**************************************************
AGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT
AGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT
AGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT
AGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT
AGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT
AGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT
AGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT
AGTAGTAATATTCCGCATCGGACAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCTAAGGTTGACCT
AGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCT
******.***************.***********************************.***********
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATATGCGGAGGA-
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA---------------------
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA---------------------
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-
CAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-
*******************************....................
FJ478131
AB369487
AB470910
FJ025204
EU326187
FM998715
DQ325453
GU586836
WY-1
consensus
FJ478131
AB369487
AB470910
FJ025204
EU326187
FM998715
DQ325453
GU586836
WY-1
consensus
FJ478131
AB369487
AB470910
FJ025204
EU326187
FM998715
DQ325453
GU586836
WY-1
consensus
FJ478131
AB369487
AB470910
FJ025204
EU326187
FM998715
DQ325453
GU586836
WY-1
consensus
FJ478131
AB369487
AB470910
FJ025204
EU326187
FM998715
DQ325453
GU586836
WY-1
consensus
FJ478131
AB369487
AB470910
FJ025204
EU326187
FM998715
DQ325453
GU586836
WY-1
consensus
FJ478131
AB369487
AB470910
FJ025204
EU326187
FM998715
DQ325453
GU586836
WY-1
consensus
66
42
01
42
16
23
23
42
66
01
133
109
068
109
083
090
090
109
136
71
203
179
138
179
153
160
160
179
206
141
273
249
208
249
223
230
230
249
276
211
343
319
278
319
293
300
300
309
346
281
413
389
348
389
363
370
369
379
416
351
483
459
418
459
433
440
439
449
486
421
AB470910 ：Bionectria ochroleuca isolate X1 ；FJ025204 ：Bionectria ochroleuca strain QLF2 ；FJ478131 ：Bionectria ochroleuca strain xsd08089 ；EU326187 ：Bionectria
ochroleuca isolate XSD-79 ；DQ325453 ：Bionectria ochroleuca isolate TU-GM4 ；JF311931 ：Bionectria ochroleuca strain P295_D3_10 ；FM998715 ：Bionectria ochroleuca
isolate C7.1 ；AB369487 ：Bionectria ochroleuca isolate BFM-L88 ；GU586836 ：Bionectria ochroleuca isolate Ppf32.
图 4 基于 5.8S rDNA-ITS 序列的多序列比对分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第5期188
将测序得到的 5.8S rDNA-ITS 序列与 GenBank/
EMBL/DDBJ 数据库中已知菌株的 5.8S rRNA-ITS 经
BLAST 搜索比对及（http ：//www.ebi.ac.uk/Tools/clus
talw2/ index.html）和（http ：//www.ch.embnet.org/softw
are/BOX_form.html）在线比对，得知 5.8S rDNA-ITS
序列包括了菌株的部分 18S rDNA、全部 ITS1、5.8S
rDNA、ITS2 序列和部分 28S rDNA 序列（图 4）。该
菌株 5.8S rDNA-ITS 与 Bionectria ochroleuca xsd08089
（淡色生赤壳菌）最为接近，其相似性达 94%。结
合该菌株的菌落、菌丝及分生孢子的形态特征，初
步确定该菌株属于淡色生赤壳菌。将该菌株 5.8S
rDNA-ITS 序列登陆 GenBank，登记号为 GU112754，
命名为 WY-1。
2.5 供试菌株的系统发育分析
在 NCBI 数据库中，搜索已报道的具有生防作
用的真菌的 5.8S rDNA-ITS 序列，进行的系统发育树
构建（图 5）。以常见的木霉属（Trichoderma）为例，
木霉属为无性型，其有性型为肉座菌属（Hypocrea），
本研究中利用 5.8S rDNA-ITS 序列将 T. harzianum、T.
viride、T. atroviride、H. pachybasioides 和 H. virens 聚
为一大类，表明此进化树构建成功。供试菌株 WY-1
与 B. ochroleuca 和 Clonostachys rosea 聚为一类，其中
C. rosea 为 B. ochroleuca 的无性型，进一步证明了供
试菌株 WY-1 属于淡色生赤壳菌。
100
100
99
100
94
100
88
100
99
100
55
42
100
100
100
100
50
73
65
83
32
32
Hypocrea virens
Trichoderma harzianum
Hypocrea pachybasioides
Trichoderma atroviride
Trichoderma viride
Paecilomyces lilacinus
Beauveria brongniartii
Beauveria bassiana
Pochonia chlamydosporia
Verticillium lecanii
Metarhizium album
Metarhizium cylindrosporae
Fusariumoxysporum f. cubense
Metarhiziumanisopliae
Metarhizium flavoviride
Clonostachys rosea
Bionectria ochroleuca
WY-1
Scopulariopsis brevicaulis
Aspergillus aculeatus
Coniothyrium minitans
Ampelomyces quisqualis
Phlebiopsis gigantean
Pythium oligandrum
Lagenidium giganteum
Bionectria ochroleuca ：FJ478131 ；Clonostachys rosea ：HQ596905 ；Beauveria bassiana ：U18953 ；Beauveria brongniartii ：JX110388 ；Metarhizium album ：
JQ958302 ；Metarhizium anisopliae ：EU307931 ；Metarhizium cylindrosporae ：GU980048 ；Metarhizium flavoviride ：KC461520 ；Pochonia chlamydosporia ：
FR799458 ；Paecilomyces lilacinus ：GU980035 ；Scopulariopsis brevicaulis ：AB369902 ；Aspergillus aculeatus ：HF545315 ；Phlebiopsis gigantean ：
JQ781838l ；Coniothyrium minitans ：AJ293811 ；Ampelomyces quisqualis ：HQ108051 ；Fusarium oxysporum f. cubense ：DQ889176 ；Pythium oligandrum ：
HQ643716 ；Trichoderma harzianum ：JX416572 ；Trichoderma viride ：AF018953 ；Trichoderma atroviride ：AB712292 ；Hypocrea pachybasioides ：
DQ093710 ；Hypocrea virens ：AB257271 ；Verticillium lecanii ：AJ292383 ；Lagenidium giganteum ：JQ745259
图 5 基于 5.8S rDNA-ITS 序列的系统发育树
3 讨论
淡色生赤壳菌是优良的生防菌，是一类广泛存
在于土壤中近似于木霉的植物病原真菌的重寄生菌，
可寄生多种植物病原真菌的菌丝和菌核，具有较好
2014年第5期 189陈秀玲等：一株淡色生赤壳菌的生防作用分析及系统发育树构建
的生防潜力，已用于防治多种植物病害。
核糖体 RNA 基因（rDNA）序列分析被认为是
最能反应物种之间遗传关系的指标之一［16］，真菌
核糖体内转录间隔区（ITS）是位于核糖体大小亚基
rRNA 之间的区域，被 5.8S rRNA 基因分隔为 ITS1
和 ITS2 片段。ITS1 和 ITS2 是中度保守区域，其保
守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明
显。这种特点使 ITS 非常适合于真菌物种的分子鉴
定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系
统发育关系分析［17，18］。
本研究通过对供试菌株的 5.8S rDNA-ITS 序列的
测序结果分析，确定该菌株为淡色生赤壳菌，但该
菌株的 5.8S rDNA-ITS 序列与 GenBank 核酸数据库
中的已知淡色生赤壳菌序列只有 94% 的相似性。说
明该菌株在进化过程中基因发生了突变，发育成一
株新的淡色生赤壳菌菌株，可用来防治菌核病菌、
尖镰孢霉、最终极腐霉等真菌病害，在苗床使用其
制成的菌剂，提高育苗与移植的成活率，保持秧苗
健壮生长，被认为是以菌治菌最有希望的生物农药。
4 结论
本研究对一株从草炭土中分离的生防菌进行了
抑菌作用分析，该菌对番茄灰霉病、番茄叶霉病、
番茄绵疫病、番茄黄萎病、番茄枯萎病、杨树烂皮病、
杨树枯萎病和黑穗醋栗叶斑病均有抑制作用。利用
5.8S rDNA-ITS 序列比对分析及系统发育树构建表明，
该菌为淡色生赤壳菌，确定了其遗传分类地位。
参 考 文 献
［1］ Palmer CL, Horst RK, Langhans RW. Use of bicarbonates to inhibit
in vitro colony growth of Botrytis cinerea［J］. Plant Disease, 1997,
81（12）：1432-1438.
［2］ Knight SC, Anthony VM, Brady AM, et al. Rationale and perspectives
on the development of fungicides［J］. Annual Reviews of
Phytopathoogy, 1997, 35 ：349-372.
［3］ Zhang CQ, Hu JL, Wei FL, et al. Evolution of resistance to different
classes of fungicides in Botrytis cinerea from greenhouse vegetables
in eastern China［J］. Phytoparasitica, 2009, 37 ：351-359.
［4］ Sharma RR, Singh D, Singh R. Biological control of postharvest
diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists ：A
review［J］. Biological Control, 2009, 50 ：205-221.
［5］ Janisiewicz WJ, Pimenta RS, Jurick WM. A novel method for
selecting antagonists against postharvest fruit decays originating from
latent infections［J］. Biological Control, 2011, 59（3）：384-389.
［6］ Junaid JM, Dar NA, Bhat TA, et al. Commercial biocontrol agents
and their mechanism of action in the management of plant patho-
gens［J］. Int J Modern Plant& Anim Sci, 2013,1（2）: 39-57.
［7］ 张志华 , 洪葵 . 核酸序列直接分析在真菌鉴定方面的应用［J］.
华南热带农业大学学报 , 2006, 12（2）：39-42.
［8］ Mark A, Ragan, Carolyn J, et al. Amolecular phylogeny of the marine
red algae（Rhodophyta）based on the nuclear small-subunit rRNA
gene［J］. Plant Biology, 1994, 91 ：7276-7280.
［9］ Freshwarer DW, Fredericq S. A gene phylogeny of the red algae
（Rhodophyta）based on plastid rbcL［J］. Plant Biology, 1994,
91 ：7281-7285.
［10］ Gurgel CFD, Liao LM, Fredericq S, et al. Systematics of Gracilario-
psis（Gracilariales, Rhodophyta）based on rbcL sequence analyses
and morphological evidence［J］. Journal of Phycology, 2003, 39
（1）：154-171.
［11］ 李敏 , 隋正红 , 易恒 , 等 . 龙须菜 5.8S rRNA 和 ITS 区的克隆
与系统学分析［J］. 中国海洋大学学报 , 2009, 39 ：77-83.
［12］ 吴发红 , 黄东益 , 黄小龙 , 等 . 几种真菌 DNA 提取方法的比
较［J］. 中国农学通报 , 2009, 25（8）：62-64.
［13］ White TJ, Bruns TD, Lee SB, et al. Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, ［M］//
Imis MA. PCR Protocols ：A guide to methods and applications.
Academic Press, 1990 ：315-322.
［14］ Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, et al. Clustal W and Clustal
X version 2.0［J］. Bioinformatics, 2007, 23 ：2947-2948.
［15］ Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5 ：molecular
evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,
evolutionary distance, and maximum parsimony methods［J］.
Molecular Biology and Evolution, 2011, 228（10）：2731-2739.
［16］ 孙广宇 , 彭友良 , 李振歧 , 等 . 核苷酸序列分析在真菌系统学
研究中的应用［J］. 西北农林科技大学学报 ：自然科学版 ,
2003, 31（6）：187-192.
［17］ 哈瑞根 . 食品微生物实验室手册［M］. 李卫华 , 译 . 北京 ：中
国轻工业出版社 , 2004.
［18］ 林晓民 , 李振岐 , 王少先 . 真菌 rDNA 的特点及在外生菌根菌
鉴定中的应用［J］. 西北农业学报 , 2005, 14（2）：120-125.
（责任编辑 马鑫）