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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）是一种碱性球
蛋白，该酶的作用机理是水解细菌细胞壁 N-乙酰胞
壁酸和 N-乙酰氨基葡萄糖之间的 β-1，4 糖苷键，进
而破坏细胞的肽聚糖致使细胞壁破裂，从而使细菌
溶解［1，2］。目前已知的溶菌酶可分为 6 类 ：c-型、g-
型、i-型、植物溶菌酶、细菌溶菌酶和噬菌体溶菌
酶［3， 4］。海参溶菌酶属于 i-型溶菌酶。
目前海参溶菌酶还没有工业产品，对海参溶菌
收稿日期 ：2014-01-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31070164），辽宁省教育厅重大平台专项（LT2011008），辽宁省自然科学基金资助项目（20102009）
作者简介 ：孙璐，女，硕士研究生，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：561166567@qq.com
通讯作者 ： 刘志文，男，博士，副教授，研究方向 ：海洋生物基因工程菌的开发和应用 ；E-mail ：alzw@dlpu.edu.cn
丛丽娜，女，博士，教授，研究方向 ：海洋生物活性物质的研究和开发 ；E-mail ：congln@dlpu.edu.cn
海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建
孙璐  刘志文  邹丹  李丹  潘博  丛丽娜
（大连工业大学 生物工程学院，大连 116034）
摘 要 ： 通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和
稳定性分析。结果表明，海参溶菌酶基因特异引物在 400 bp 处扩增出特异性条带，与预期的海参溶菌酶基因大小一致 ；重组表达
质粒 pHT43-SjLys 经双酶切验证得 8 000 bp 和 400 bp 左右的片段 ；重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌与原始菌株 WB600
相比生长趋势基本一致，外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响 ；在无选择压力的条件下，重组质粒的稳定性良好，
连续传 5 次后的遗传稳定性为 94%，并且提取质粒和双酶切验证后发现工程菌没有发现重排或丢失现象。表明重组海参溶菌酶基
因工程菌 pHT43-SjLys/WB600 构建成功。
关键词 ： 基因重组 海参溶菌酶 枯草芽孢杆菌 基因工程菌 表达载体
Construction of Genetic Recombination for Sea Cucumber Lysozyme in
Bacillus subtilis
Sun Lu Liu Zhiwen Zou Dan Li Dan Pan Bo Cong Lina
（College of Bioengineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034）
Abstract:  The expression of lysozyme from sea cucumber Stichopus japonicus in Bacillus subtilis were constructed by the method of
recombinant DNA technique, and the expression plasmid pHT43-SjLys of growth curve and stability were analyzed. Results showed that a
specific strip about 400 bp was visible in the result of agarose gel electrophoresis, which was consistent with expected size of sea cucumber
lysozyme gene. Construction of the lysozyme was performed in a vector pHT43 and validated by double digestion with BamH Ⅰ and Sma Ⅰ ,
witch indicated the fragment size was consistent with the expected result. The growth trend of engineering bacteria was consistent compared
with the wild type strain WB600, and insertion of foreign genes did not affect the cell’s metabolism. In the absence of selection pressure, the
recombinant plasmid was stability, and there was no gene rearrangement and lost. The results showed that the recombinant sea cucumber
lysozyme genetic engineering bacteria pHT43-SjLys/WB600 is constructed successfully.
Key words:  Genetic recombination Sea cucumber lysozyme Bacillus subtilis Genetic engineering bacteria Expression vector
酶的研究多集中在产酶菌株的筛选、异源高效表达
等方面，国内已有实验室成功将海参溶菌酶在大肠
杆菌中进行了高效表达［5］。但用大肠杆菌作为宿主
时表达产物会有包涵体，分离纯化较困难。然而枯
草芽孢杆菌为单层膜便于产物分离纯化，并且它是
一种益生菌［6，7］，自身不产生内毒素［8，9］，对人畜
无致病性，因此枯草芽孢杆菌是极具潜力的基因工
程菌［10-13］。目前已有研究表明侧孢短芽孢杆菌碱性
2014年第6期 151孙璐等 ：海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建
蛋白酶基因 BLG4［14］、甘露聚糖酶基因 Man23［15］、
耐高温 α-淀粉酶基因［16］等已经在枯草芽孢杆菌中
得到了高效表达。
本课题组已克隆得到海参溶菌酶基因，为了得
到重组海参溶菌酶基因工程菌，本试验构建该基因
在枯草芽孢杆菌中的重组表达载体，经转化验证后，
对基因工程菌的生物活性及稳定性进行分析，以期
获得较稳定的工程菌株，为重组海参溶菌酶基因工
程菌的高效表达及实际应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质 粒 和 菌 株 质 粒 pHT43 和 枯 草 芽 孢 杆
菌 WB600 购 自 上 海 今 迈 生 物 有 限 公 司，DH5α 和
pMD18T-Simple 购自于大连宝生物有限公司。
1.1.2 试 剂 Taq DNA 聚 合 酶、dNTP、 限 制 性 内
切 酶 BamH Ⅰ、Sma Ⅰ、Solution Ⅰ 连 接 液、DNA
Marker、氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cam）、胶回
收试剂盒、质粒提取试剂盒。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与目的基因 SjLys 的扩增 根据海
参溶菌酶基因 SjLys 的 cDNA 全序列设计一对引物，
上游引物 HS-Q-P11 ：5-GCCGGATCCATGCAAGTTC-
CTTCTG-3，下游引物 HS-Q-P12 ：5-GCCCGGGAA-
TTCTCAGTTGTTGCTC-3，下划线分别为 BamH I 和
Sma I 酶切位点。以实验室保存的 pMD18T-SjLys 质
粒为模板进行 PCR 扩增，反应条件 ：94℃ 5 min ；
94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，循环 30 次 ；72℃
10 min。扩增完成后，用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 目的基因 SjLys 的克隆和序列比对 将上述
PCR 扩增产物用限制性内切酶 BamH Ⅰ和 Sma Ⅰ双
酶切回收后连接到 pMD18T-Simple 载体上，转化至
大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，经 Amp 筛选后，提
取质粒，通过双酶切鉴定后，筛选出阳性克隆子，
将阳性克隆子 pMD18T-Simple-SjLys 送至北京华大基
因有限公司进行测序，然后进行序列比对分析。
1.2.3 重组表达质粒 pHT43-SjLys 的构建及转化 将
上述重组克隆质粒 pMD18T-Simple-SjLys 用限制性内
切酶 BamH Ⅰ和 Sma Ⅰ双酶切回收目的片段 SjLys 后，
与同样双酶切回收后的 pHT43 用 Solution Ⅰ连接液
进行连接，构建了重组表达载体 pHT43-SjLys。然后
将构建好的重组表达质粒转化至大肠杆菌 DH5α 感
受态细胞中，经 Amp 筛选后，提取质粒，通过双酶
切鉴定后，筛选出阳性克隆子。
1.2.4 工 程 菌 株 pHT43-SjLys/WB600 的 构 建 及 鉴
定 将上述构建好的重组表达质粒 pHT43-SjLys 通
过电转化法转化至枯草芽孢杆菌 WB600 感受态细胞
中［17，18］，在 10 μg/mL 的 Cam 的 LB 平板上筛选转化子，
挑取单菌落做菌落 PCR 验证，然后挑取菌落 PCR 验
证为阳性的转化子于 5 mL 含有 Cam 抗性的 LB 培养
基中培养，提取质粒［19］，用限制性内切酶 BamH Ⅰ
和 Sma Ⅰ双酶切鉴定，筛选阳性克隆子。
1.2.5 工程菌株 pHT43-SjLys/WB600 的生长曲线测
定 将枯草芽孢杆菌 WB600 和基因工程菌 pHT43-
SjLys/WB600 分别在 LB 平板上活化（后者加入 10
μg/mL Cam），分别挑取单菌落接种到 LB 培养基中
培养（后者加入 10 μg/mL Cam），然后分别离心收集
菌体，再用 LB 培养基重悬菌体。用紫外分光光度
计测定两菌的 OD600 值，使两菌的 OD600 值相当后按
1% 接种量分别将两菌接种于无抗生素的 LB 培养基
中振荡培养（两者条件相同），每株菌设 3 个重复试
验，每隔一段时间取样测定其 OD600 值。
1.2.6 工 程 菌 株 pHT43-SjLys/WB600 的 稳 定 性 分
析 参考蒋岚［20］的方法挑取重组菌的单菌落，接
种至 5 mL 不含抗生素的 LB 培养基中，37℃ 培养
12 h，再按 1% 接种量转接到另一个不含抗生素的培
养基中培养 24 h，再将此菌液稀释后涂布于无抗生
素的 LB 平板上，然后挑取 100 个单菌落分别点接
在不含抗生素的 LB 平板上和含 Cam 的 LB 平板上，
37℃ 培养 12 h 后计数平板上的单菌落数，作为传 1
次的质粒稳定性的标准。如此每隔 24 h 按 1% 接种
量重新培养，直至计数传 5 次的稳定性。
2 结果
2.1 海参溶菌酶基因SjLys序列的获得
以含海参溶菌酶基因的质粒 pMD18T-SjLys 为模
板，特异引物 HS-Q-P11 和 HS-Q-P12 扩增出的海参
溶菌酶基因 SjLys，结果（图 1）显示，在 400 bp 左
右处有明显的条带，与预期大小相符，表明扩增成功。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期152
2.2 重组克隆质粒pMD18T-Simple-SjLys的构建与
鉴定
将上述的溶菌酶基因 SjLys 进行回收和纯化，并
将其克隆转化到 pMD18T-Simple 质粒中，获得重组
克隆质粒 pMD18T-Simple-SjLys，该质粒的双酶切验
证结果（图 2）显示，在 400 bp 和 3 000 bp 左右处
有明显的特异性条带，条带大小与预期相符。并进
一步对其溶菌酶基因 SjLys 的测序验证，测序结果
通过 Clustal 序列比对分析后，结果表明溶菌酶基因
SjLys 的重组克隆质粒构建成功。
和原始菌株的生长趋势基本一致，枯草芽孢杆菌
WB600 在接种 1.5 h 后进入对数生长期，6 h 后对数
生长期结束，而工程菌株在 1 h 后进入对数生长期，
比原始菌株提前了 0.5 h，对数生长期在 5 h 后结束，
比原始菌株提前了 1 h，之后两菌株的生长速度基本
保持一致。因此可以看出，外源基因的插入对菌体
的生理代谢未造成太大影响。
M ：100 bp DNA ladder Marker ；1 ：目的基因 SjLys PCR 产物
图 1 PCR 扩增目的基因 SjLys
400
bp
M 1
400
3000
bpbp
M1 1 M2 2
M1 ：100 bp DNA Marker ；M2 ：1000 bp DNA Ladder Marker ；1 ：双酶切产物 ；
2 ：重组克隆质粒 pMD18T-Simple-SjLys
图 2 重组质粒 pMD18T-Simple-SjLys 双酶切验证
2.3 重组表达质粒pHT43-SjLys的构建与鉴定
上述的重组质粒 pMD18T-Simple-SjLys 和载体
pHT43 用 BamH Ⅰ 和 Sma Ⅰ 双 酶 切 后 进 行 连 接，
构建了重组表达载体 pHT43-SjLys。重组表达质粒
pHT43-SjLys，片段长为 8 432 bp（图 3）。将重组质
粒转化至枯草芽孢杆菌 WB600 中后提取质粒并进行
双酶切验证，结果（图 4）显示，在 400 bp 左右和
8 000 bp 左右有明显的特异性条带，条带大小与预
期大小相符，表明重组表达载体的质粒已构建成功。
2.4 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的生长曲线测定
两 株 菌 的 生 长 曲 线（ 图 5） 显 示， 工程 菌 株
Kpn IBamH I
SjLys
Sma I
SamyQ
Pgrac
La
cl
Sac I
Mun I
Afl II
ColE1
AmpR
CmR
ORF-2
Bsa IXho I
Cla I
Sex A1
ORF-1
ORF-3
pHT43-SjLys
400
3000
bp
bp
M1 1 M2 2
图 3 重组表达载体 pHT43-SjLys 图谱
M1 ：100 bp DNA ladder Marker ；M2 ：1000 bp DNA ladder Marker ；1 ：重组
表达质粒 pHT43-SjLys 双酶切产物 ；2 ：重组表达质粒 pHT43-SjLys
图 4 重组载体 pHT43-SjLys 双酶切验证
0.18
0.68
1.18
1.68
2.18
0.5 2.5 4.5 6.5 8.5
O
D
60
0
WB600
pHT43-SjLys/WB600
ᰦ䰤h
图 5 枯草芽孢杆菌 WB600 和基因工程菌 pHT43-SjLys/
WB600 的生长曲线
2014年第6期 153孙璐等 ：海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建
2.5 工程菌株pHT43-SjLys/WB600的稳定性分析
对 于 工 程 菌 株 稳 定 性 的 分 析 是 将 工 程 菌 株
pHT43-SjLys/WB600 在没有抗生素的 LB 培养基中连
续培养，每传 1 次取菌液进行测定，结果（图 6）显示，
在无选择压力的条件下，重组质粒的稳定性良好，
连续传 5 次后的遗传稳定性为 94%。然后分别提取
连续传 3 次和 5 次的工程菌 pHT43-SjLys/WB600 的
质粒并进行双酶切检测，得出传 3 次和 5 次的菌，
在含 Cam 的培养基上没有生长的菌提取不到质粒，
而依然在 Cam 抗性平板上生长的细菌可以提取到
质粒并且质粒大小与出发菌株大小一致，而且酶切
结果也相同，因此说明工程菌没有发生重排或丢失
现象。
参溶菌酶的高效表达提供了一个新的途径。有研究
发现，枯草芽孢杆菌会分泌至少 7 种不同的胞外蛋
白酶，这些蛋白酶没有底物的专一性，会将外源蛋
白进行降解［24］，但有研究表明，可以通过使枯草芽
孢杆菌自身的蛋白酶基本失活的方法来减少蛋白酶
对外源蛋白的降解，进而提高外源蛋白得率［25］。所
以本研究选取了缺失 6 种胞外蛋白酶的枯草芽孢杆
菌 WB600［26］作为表达宿主，大大减少了胞外蛋白
酶对外源蛋白降解的问题。由于重组质粒导入宿主
菌后可能会影响其生长规律，而生长曲线可以较好
地反应出菌株的生长情况，因此本研究对重组菌株
与原始菌株进行了生长曲线的测定，试验结果表明
重组质粒的导入对菌体的生理代谢未造成太大影响。
在枯草芽孢杆菌的表达质粒中，Bron 等［27］研究发
现枯草芽孢杆菌的可复制质粒进行复制时会产生单
链 DNA，容易导致质粒的丢失，但这个问题可以通
过引入 θ-复制模式质粒克服，所以本研究选用了具
有 θ-复制模式的 pHT43 表达载体，减少了质粒丢失
的问题。并且本研究进一步通过对工程菌株稳定性
的测定来验证重组质粒的丢失情况，试验结果表明，
本试验构建的基因工程菌没有出现重排或丢失的现
象。综上所述，重组海参溶菌酶基因工程菌成功的
构建，为近一步研究海参溶菌酶的高效表达奠定了
基础。
4 结论
本研究成功将海参溶菌酶基因 SjLys 克隆到了
pHT43 表达载体上，构建了 pHT43-SjLys 重组表达
载体，并转化入枯草芽孢杆菌 WB600 中，成功构建
了重组海参溶菌酶基因工程菌。结果表明，构建的
基因工程菌与原始菌株的生长趋势基本一致，并且
外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响；
同时在工程菌株稳定性上本试验构建的工程菌株在
连续传 5 次后遗传稳定性为 94%，在提取质粒和双
酶切后的结果表明，构建的基因工程菌没有出现重
排或丢失的现象。
参 考 文 献
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图 6 工程菌 pHT43-SjLys/WB600 稳定性分析
92
94
96
98
100
1 2 3 4 5
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3 讨论
海参溶菌酶存在于海刺参的各个组织中，由于
海洋高盐、高压、低温等独特的地理环境使得该酶
具有了其它陆地生物来源的溶菌酶所不具备的特点，
所以，这类溶菌酶的研究也越来越广泛［21，22］。传统
方法生产溶菌酶具有成本高，生产工艺复杂等问题，
所以应用生物工程的方法生产溶菌酶基因工程菌已
成为了当今的发展趋势。目前对海参溶菌酶的研究
多是构建海参溶菌酶大肠杆菌基因工程菌［23］，但大
肠杆菌作为表达菌株会产生包涵体，分离纯化比较
困难，生产成本较高等问题，这也是目前该酶在工
业上难以推广的原因。枯草芽孢杆菌是一种益生菌，
对人体无致病性，有较强的胞外分泌能力，且外源
蛋白不会经过大肠杆菌包涵体复性，因此简化了外
源蛋白的分离纯化。
本研究采用枯草芽孢杆菌作为表达宿主，为海
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期154
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（责任编辑 马鑫）