全 文 ：基因重组酵母细胞测定中药中雌激素类
化合物的研究
祝娉婷 t o卜 平 t o陈秀云 t o吴玉娟 u o陈春波 v o李湘鸣 t3
ktq扬州大学医学院 o江苏 扬州 uuxsst~ uq扬州大学 动物科学与技术学院 o江苏 扬州 uuxss|~
vq扬州大学 兽医学实验动物专业 o江苏 扬州 uuxss|l
≈摘要   目的 }研究不同性味中药中植物性雌激素的含量 ∀方法 }用重组人雌激素受体 k«∞• l基因酵母细胞
k• vsv2t„ r«∞• 2∞• ∞2¤¦l测定清热药 !解表药 !利水渗湿药 !止血药 !补益药 !收涩药中的植物性雌激素的活性 ∀
通过定量测定 Β2半乳糖苷酶活性表示中药的雌激素强度 ∀结果 }清热药中雌激素含量最高 o为 y1vx ≅ tspv ±°²¯ #
ªpt o止血药与补益药中雌激素含量较低 o几乎测不出 ∀结论 }虎杖 !连翘 !秦皮 !黄芩 !麦冬中可与雌激素受体结合
的植物性雌激素含量较高 ∀
≈关键词   中药 ~植物性雌激素 ~基因重组酵母细胞 ~雌激素受体
≈中图分类号   • u{xqx ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszluw2uyvy2sw
≈收稿日期   ussy2sz2ts
≈基 金 项 目   教 育 部 留 学 回 国 人 员 科 研 启 动 基 金
k°Žswsztw|l~江苏省高校自然科学基金项目 ksvŽ…ytsty{l~江苏
省卫生厅医学科技发展基金项目 kussvu{l
≈通讯作者   3 李湘鸣 oר¯}kstsl{wzv{ysyo∞2°¤¬¯} ¬¯°xztss|
ƒ ¼¤«²²1¦²°1¦±
植物雌激素 k³«¼·²¨ ¶·µ²ª¨ ±l对雌激素相关疾病
如乳腺肿瘤 !子宫肿瘤 !心血管疾病 !骨质疏松和更
年期综合征等有广泛的预防作用 ≈tou  ∀许多中草药
含植物雌激素 o然而 o就何种中草药的植物雌激素可
与雌激素受体 Αk∞• l结合以及植物雌激素含量高
低的研究较少 ∀为此 o笔者等用重组基因酵母细胞
• vsv2t„ r«∞• 2∞• ∞2¤¦对有关中草药中的植物雌
激素进行了研究 ∀
1 材料
1q1 基因重组酵母细胞
基因重组酵母细胞 • vsv2t„ r«∞• 2∞• ∞2¤¦
由扬州大学医学院预防医学教研室构建 ∀该重组酵
母细胞采用附加体型载体 o用质粒双表达的方式检
测雌激素类化合物 ∀其表达质粒为 ³≠Š r«∞• o采用
酵母最强启动子 Š°⁄k糖酵解的 v2磷酸甘油醛脱氢
酶 l促进 «∞• k人雌激素受体 Αl在酵母细胞中的表
达 ~报告质粒为 ³ °usyr∞• ∞2¤¦o由 u个串联的
∞• ∞k雌激素反应元件 l调控 ¤¦k编码 Β2半乳糖
苷酶 l基因的表达 k图 tl≈vow  ∀
图 t • vsv2t„ r«∞• 2∞• ∞2¤¦重组酵母细胞工作原理
1q2 药材
清热解表药 }黄芩 !连翘 !秦皮 ~解表药 }白芷 !细
辛 !柴胡 !木贼 ~利水渗湿药 }虎杖 !茵陈 ~止血药 }仙
鹤草 !三七 ~止咳平喘药 }紫菀 !桑白皮 ~补益药 }黄
芪 !甘草 !补骨脂 !麦冬 ~收涩药 }五味子 ∀中药饮片
原料购于扬州市大德生药店 o由扬州大学医学院张
洪泉教授鉴定黄芩为唇形科植物黄芩 Σχυτελλαρια βα2
ιχαλενσισŠ ²¨µª¬的根 ∀连翘为木樨科植物连翘的果
实 Φορσψτηια συσπενσα ∂ ¤«¯q∀秦皮为木犀科植物苦
枥白蜡树 k大叶白蜡树 l Φραξινυσ ρηψνχηοπηψλλα
‹¤±¦¨∀白芷为伞形科植物杭白芷 Ανγελιχα δαηυριχα
√¤µq φορµ οσανα的干燥根 ∀细辛为马兜铃科植物北
细辛 Ασαρυµ ηετεροτροποιδεσ ƒµq ≥¦«°¬§·√¤µq µ ανδ2
σηυριχυµ k ¤¬¬°ql Ž¬·¤ªq的根 ∀柴胡为伞形科植物
柴胡 Βυπλεωυµ Χηινεσε ⁄≤q∀木贼系木贼科植物
#yvyu#
第 vu卷第 uw期
ussz年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ uw
⁄ ¦¨¨°¥¨ µo ussz
Εθυισετυµ ηιεµ αλε q的干燥地上部分 ∀虎杖为蓼科
植物虎杖 Πολψγονυµ χυσπιδατυµ ∀茵陈为菊科植物
茵陈蒿 Αρτεµ ισια χαπιλλαλισ ׫∏±¥q的干燥地上部分 ∀
仙鹤草来源为蔷薇科植物龙牙草 Αγριµ ονια πιλοσα
¨§¨ ¥q的全草 ∀三七为五加科植物三七 Παναξ νοτο2
γινσενγk…∏µ®ql ƒq ‹ q ≤«¨ ±的干燥根 ∀紫菀为菊科
植物紫苑 Αστερ ταταριχυσq ©q的干燥根及根茎 ∀桑
白皮为桑科植物桑 Μορυσ αλβα 1的干燥根皮 ∀黄
芪为豆科植物蒙古黄芪 Αστραγαλυσ µ εµ βραναχευσ
…∏±ª¨ q √¤µq µ ονγηολιχυσk…ª¨ ql‹¶¬¤²的根 ∀甘草为
豆科植物甘草 Γλψχψρρηιζα υραλενσισ ƒ ¶¯¦«q的根及根
茎 ∀补骨脂为豆科植物补骨脂 ΠσοαρΛαεα χορψλιφολια
q的果实 ∀麦冬为百合科植物阔叶麦冬 Λιριοπε
πλατψπηψλλα • ¤±ª ·¨×¤±ª的块根 ∀五味子为林兰科
华中五味子 Σχηισανδρα σπηεναντηερα • «¨§q ∞·• ¬·¶q
的果实 ∀
1q3 试剂
≥⁄2·µ³k缺乏色氨酸 lo为美国 ≤ ²¯±·¨¦«公司产
品 ∀ tzΒ2雌二醇 oΒ2巯基乙醇 o邻 2硝基酚 2Β2∆2半乳
糖苷 k’‘°Šl均为 ≥¬ª°¤产品 ∀
1q4 仪器
仪器 zuu型可见光分光光度计 o购于上海第三
分析仪器厂 ∀
2 方法
2q1 重组酵母细胞的 °≤• 鉴定
将 • vsv2t„ r«∞• 2∞• ∞2¤¦划线接种于 ≥⁄r2
·µ³2∏µ¤k无色氨酸和尿嘧啶 l培养平板上 ovs ε 培养
v ∗ w §o待其长出 v ∗ w °°菌落用保鲜膜密封 ow ε
保存备用 ∀从 ≥⁄r2·µ³2∏µ¤培养平板挑取 • vsv2t„ r
«∞• 2∞• ∞2¤¦克隆 o置于 ≥⁄r2·µ³2∏µ¤培养液中 ovs
ε 振荡过夜 o按文献方法 ≈vow 对酵母克隆进行
°≤• 鉴定 o以验证 «∞• 和 ¤¦基因的存在 ∀
2q2 中药处理
精确称取每味中药 vs ªo加入去氯自来水 wss
°o浸泡 vs °¬±后 o武火煎熬 x °¬±后 o文火煎熬 vs
°¬±~将药汁用沙布过滤置入灭菌的烧杯内 o于水浴
锅 ys ε 蒸发至 ys °o即浓缩为含生药 xss °ª#
°pt ∀将所浓缩的中药用双蒸水呈 tss倍梯度稀
释 o即配成质量浓度为 xsso xo s1sx °ª# °pt o加
盖密封 ow ε 冰箱保存备用 ∀
2q3 植物雌激素的测定
从 ≥⁄r2·µ³2∏µ¤培养平板上 o挑取单菌落 • vsv2
t„ r«∞• 2∞• ∞2¤¦o置于 ≥⁄r2·µ³2∏µ¤培养液中 ovs
ε 振荡过夜 o取 s1x °酵母细胞液 o加入 w1x °
≥⁄r2·µ³2∏µ¤培养液 o使溶液在 yss ±°波长处的吸光
度 kΑl值为 s1wo加入各种不同质量浓度的中药 ts
ˏo使其终质量浓度为 tos1stos1sss t °ª# °pt o
vs ε 振荡 w «o测 Β2半乳糖苷酶活性 ∀
阳性对照 }取 tzΒ2雌二醇用无水乙醇配成不同
浓度的 tzΒ2雌二醇作为标准 o加入体积同中药受试
物 o使其在 x °酵母培养液中终浓度 k°²¯ # pt l
为 t ≅ tsp| otspts otsptt otsptu otsptv otsptw otsptx和
sk对照 ts ˏ乙醇 l∀其余操作同中药受试组 ∀
2q4 Β2半乳糖苷酶活性测定
2q4q1 Β2半乳糖苷酶活性定义 每毫升单位吸光
度的酵母细胞 vz ε 作用 t °¬±o使邻 2硝基酚 2Β2∆2半
乳糖苷 k’‘°Šl产生 t ±°²¯ # pt的邻 2硝基苯酚定
义为 t个活性单位 ∀
2q4q2 标准曲线 取 x °°²¯ # pt邻 2硝基苯酚储
存液 u °o加碱性  缓冲液 k含 s1v °²¯ # 
‘¤u ≤’v l至 tss °o配制成浓度为 s1t °°²¯ # pt
的邻 2硝基苯酚 ∀取 x支 ts °比色管 o分别加入
s1t °°²¯ # pt的邻 2硝基苯酚 sos1suxos1sxos1to
s1txos1u °o用碱性 缓冲液定容至 x °owus ±°
处比色 o并求标准曲线回归方程为 }hΨ € tyx1xΞ p
t1yttykΡu € s1||xoΠ s1sxl∀
2q4q3 Β2半乳糖苷酶活性的测定方法 取经受试
物作用 w «的酵母培养液 o测定并记录溶液在 yss
±°波长处的吸光值 o取 s1x °培养液于 t1x °离
心管中 ow sss µ# °¬±离心 ts °¬±o弃上清 o加入 t
°缓冲液 k‘¤u ‹°’w # ‹u ’ ty1to‘¤u ‹°’w # ‹u ’
x1xsoŽ≤¯s1zxo ª≥’w # z‹u ’ s1uwyo³‹ z1so室温
下贮存可用 t年 lo洗涤 t次 ∀用 s1t °缓冲液
重悬细胞 o置于 pus ε 冷冻 us °¬±o立即置 vz ε 水
浴中 u °¬±o如此冻融 v次 ∀加入 zss ˏ含有 Β2巯
基乙醇的 缓冲液 otys ˏ’‘°Škw °ª# °pt o溶
于 缓冲液中 o现配 lo迅速混匀 ∀置 vz ε 水浴中
并立即计时 o直至有黄色出现 o加入 s1x °‘¤u ≤’v
中止反应 o计算显色时间 ∀ tv sss µ# °¬±pt离心 ts
°¬±o取上清于 wus ±°处测定 Αo用空白对照调零 ∀
Β2半乳糖苷酶活性按下式计算 }
酶活性单位 k˜l € Μ ≅ t1vyt ≅ Αyss ≅ τ
式中 τ为加入 ’‘°Š后显色时间 k以 °¬±计 l~
#zvyu#
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⁄ ¦¨¨°¥¨ µo ussz
Μ为样品管邻 2硝基苯酚浓度 k±°²¯ # °pt lo由标
准曲线回归方程求得 ∀
2q4q4 中药中植物性雌激素的换算 根据阳性对
照组的剂量效应关系 o用 ∞¬¦¨ 求¯回归方程 ∀以某
中药作用于重组酵母细胞产生的 Β2半乳糖苷酶活
性与多少雌二醇 k∞u l相当 o表示中药中植物性雌激
素的含量 k±°²¯# ªpt l∀
判断标准 ≈x  }某中药所产生的 Β2半乳糖苷酶活
性大于阳性对照最大酶活性的 tsh o即 k本底值 p
最大值 l ≅ tsh n本底值 o则判断为雌激素活性阳
性 ∀由于中药中植物雌激素波动极大 o呈对数正态
分布 o用几何均数 !中位数表示集中趋势 ∀
3 结果
3q1 基因重组酵母细胞的 °≤• 鉴定
°≤• 产物经 t1sh琼脂糖电泳见有 u条特异性
条带 o一条大小约为 t1{ ®¥o此为 «∞• ¦⁄‘„o另一
wss ¥³的条带为 ³ °usyr∞• ∞2¤¦的部分序列 o说
明该重组酵母具有 «∞• 和 ∞• ∞2¤¦两基因 o符合

实验要求 ∀见图 u∀
图 u 基因重组酵母细胞的 °≤• 鉴定
tou1t1{ ®¥o为 «∞• ⁄‘„平行样 ~vow1wss ¥³o为 ⁄°³usy2∞• ∞2
¤¯¦½部分片断 ~ 1标准品
3q2 各类中药中植物性雌激素的含量
将各类中药进行分类汇总 o通过均数 k cξl和中
位数 k l可以发现 o清热药和利水渗湿药中植物性
雌激素含量最高 o其次分别是解表药和补益药 o而止
血药平均含量最低 ∀但标准差 kσl较大 o多数大于
均数的一半以上 o说明每味中药中植物性雌激素变
异较大 ∀见表 t∀
表 t 不同种类中药中植物性雌激素 k∞u l的含量 ±°²¯# ªpt
中药 ν cξ ? σ  波动范围
补益药 w ky1{w ? s1ttl ≅ tspw t1zty ≅ tspw t1vz ≅ tspy ∗ u1ws ≅ tspv
解表药 w kx1xs ? y1sxl ≅ tspw v1wwy ≅ tspw z1vy ≅ tspx ∗ t1ws ≅ tspv
利水渗湿药 u kx1xt ? z1zsl ≅ tspv x1xts ≅ tspv y1uu ≅ tspx ∗ t1ts ≅ tspu
清热药 v kx1z{ ? t1{xl ≅ tspv y1vxs ≅ tspv v1zs ≅ tspv ∗ z1vs ≅ tspv
收涩药 t z1w{ ≅ tspx p p
止血药 w ku1zz ? x1xwl ≅ tspw x1yzs ≅ tsp| v1uy ≅ tspts ∗ t1ts ≅ tspv
对每味中药含雌激素量的分析报告 o虎杖中植
物性雌激素的含量较高 o其次分别是连翘 !秦皮 !黄
芩 !麦冬 !木贼 !仙鹤草 !细辛 !白芷 !黄芪 !甘草 ∀而
五味子 !柴胡 !茵陈等中药植物性雌激素呈阴性结
果 o低于重组细胞检出限 ∀见表 u∀
4 讨论
近年来 o人体及动物实验已经证实植物性雌激
素具有抗动脉粥样硬化 o舒张血管 o防止骨质疏松 o
抑制肿瘤发生 o保护神经系统 o抗感染等一系列作
用 o且未发现不良影响 ∀目前有关植物性雌激素的
研究已引起学术界的广泛关注 ∀传统中药中 o不少
方 !药对雌激素缺乏所引起的病症具有良好治疗作
用 o所表现的效应与植物雌激素类似 o有些成分已经
成为正在研究的植物雌激素 ∀但是鲜有测定中药中
雌激素含量的实验研究 ∀
中药的雌激素作用和抗雌激素作用 o取决于剂
量及机体的甾体雌激素状态 ∀研究表明 o低剂量时 o
因中药植物性雌激素与雌激素竞争结合 ∞• o主要表
现为抗雌激素作用 ~中剂量时 o可以产生一定的雌
激素活性 ~高剂量时 o产生雌激素增强效应 ≈y  ∀有
学者观察虎杖等含有蒽醌的生药以及各种生药的甲
醇提取物对源于人乳腺癌的雌激素依赖型增殖细胞
株  ≤ƒ2z的雌激素样活性 ≈z  ∀结果表明 o虎杖提取
物的活性最强 o以活性为指标进行分离纯化 o其活性
成分之一为大黄素 ≈z  ∀研究证明 o大黄素结构和药
理作用与雌激素相似 o这与本研究的报道相一致 ∀
连翘 !木贼 !仙鹤草 !细辛中某些成分都可治疗妇科
疾病 o其中仙鹤草水提醇沉法制成的 tΒt溶液对某
些雌激素依赖性肿瘤有较好的抑制作用 ∀
• vsv2t„ r«∞• 2∞• ∞2¤¦是用 Β2半乳糖苷酶
活性强度表示中药的雌激素强度 o比较敏感 ∀但用
酶作为评价指标 o受时间 !空间 !温度 !菌液浓度的影
#{vyu#
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表 u 不同中药的植物性雌激素含量 k∞u l kcξ ? σ, ν € vl
±°²¯# ªpt
中药种类 药物 ∞u
利水渗湿药 虎杖 s1sts |xx ? s1ssy
清热药 茵陈 s1ssz uz{ ? s1ssw
连翘 y1uu∞2sx
秦皮 s1ssy vwx ? s1ssx
黄芩 s1ssv zsx ? s1ssu
补益药 麦冬 s1ssu v|t ? s1ssu
解表药 木贼 s1sst wvz ? s1ss{
止血药 仙鹤草 s1sst ts{ ? s1ss|
解表药 细辛 s1sss vxv ? s1ss|
柴胡 z1vy∞2sx
白芷 s1sss vvx ? s1sss u
补益药 黄芪 s1sss tz{ ? s1sss t
麦冬 s1ssu v|t ? s1sss u
甘草 s1sss tyw ? s1sss t
收涩药 五味子 z1w{∞2x
解表药 柴胡 z1vy∞2sx
止血药 仙鹤草 s1sst ts{ ? s1ss|
利水渗湿药 茵陈 y1uu∞2sx
补益药 补骨脂 t1vz∞2sy
止血药 桑白皮 |1vz∞2s|
紫菀 t1|y∞2s|
三七 v1uy∞2ts
响较大 o不同时间的测定结果不相同 o所以研究时应
注意受试物与对照同时进行 ∀同时也应看出 o每类
中药中所研究的每味中药数量较少 o测定的植物性
雌激素含量波动较大 o因此 o各类中药中植物性雌激
素的变化规律还有待研究 ∀
≈参考文献  
≈t  王 陶 o王 辉 q植物雌激素及其对人类的作用 ≈ q湖南中医
药导报 ot|||oxkul}twq
≈u  „ §¯¨ µ¦µ¨∏·½ ‹ o  ¤½∏µ• q °«¼·²¨ ¶·µ²ª¨ ±¶¤±§º ¶¨¨µ± §¬¶¨¤¶¨≈ q
„±±¤¯  §¨o t||zou|}|xq
≈v  李湘鸣 o罗方妮 o陈春波 o等 q人雌激素受体 ¦⁄‘„在酵母细胞中的
表达 ≈ q扬州大学学报 k农业与生命科学版 loussxouyktl}t|q
≈w  陈春波 o罗方妮 o李湘鸣 q环境雌激素调控的 Β2半乳糖苷酶酵
母细胞的建立 ≈ q扬州大学学报 k农业与生命科学版 loussxo
uy kvl}utq
≈x  °¤∏¯ ƒo ‹ ²¨ ®¶·µ¤…o Ž¨±·…∏µ±¬¶²±o פ±±¬¶‘¨ «¨ ¬¯o ·¨¤¯1 ∞±¤±·¬2
²° µ¨2¶³¨ ¦¬©¬¦¤¦·¬√¬·¼ ²©²o³χ2⁄⁄× º¬·«·«¨ «∏°¤± ¶¨·µ²ª¨ ± µ¨¦¨³·²µ
≈ 1ײ¬¬¦²¯²ª¼ ¨·¨µ¶ousstktuxl}zx1
≈y  马吉祥 o李会庆 1植物雌激素与肿瘤 ≈ 1国外医学 #肿瘤学
分册 ousstou{kyl}wty1
≈z  松田久司 q虎杖及大黄中的雌激素样活性成分 }蒽醌类的结构
与活性 ≈ q国外医学 #中医中药分册 oussuouwkxl}vtzq
Υσε Ω vsv2tΑ /ηΕΡ 2ΕΡ Ε 2Λαχ Ζ το δετερµ ινε εστρογενιχ χοµ πουνδσ
ιν τραδιτιοναλΧηινεσε µ ατερια µ εδιχα
‹˜ °¬±ª2·¬±ªt o …’ °¬±ªt o ≤‹∞‘÷¬∏2¼∏±t o • ˜ ≠∏2­∏¤±u o ≤‹∞‘≤«∏±2¥²v o Œ÷¬¤±ª2°¬±ªt
(t. ΜεδιχαλΧολλεγε οφ Ψανγζηου Υνιωερσιτψ, ϑιανγσυ Ψανγζηου uuxsst, Χηινα;
u. Σχιενχε ανδ Τεχηνολογψ Χολλεγε οφ Ψανγζηου Υνιωερσιτψ, ϑιανγσυ Ψανγζηου uuxss|, Χηινα;
v. ςετεριναρψΜεδιχινε Χολλεγε οφ Ψανγζηου Υνιωερσιτψ, ϑιανγσυ Ψανγζηου uuxss|, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¶·∏§¼ ·«¨ ¦²±·¨±·²©³«¼·²¨ ¶·µ²ª¨ ± ¬± §¬¶¶¬°¬¯¤µ¬·¼ «¨ µ¥¶q Μετηοδ : ׫¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²©³«¼·²¨ ¶·µ²ª¨ ± ¬±
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¯¨ ±·l ¬± «¨ ¤·2¦¯ ¤¨µ¬±ª§µ∏ª¶º¤¶·«¨ «¬ª«¨ ¶·º«¬¯¨ ·«¤·¬± ¤±¤¶·¤¯·¬¦¤±§·²±¬¦§µ∏ª¶º¤¶·«¨ ²¯º ¶¨·o º«¬¦« º¤¶¯¨¶¶·«¤± ·«¨ §¨ ·¨¦·¨§
¬¯°¬·q Χονχλυσιον: ≤²°³¤µ¨§º¬·«·«¨ ²·«¨ µ·µ¤§¬·¬²±¤¯ ≤«¬± ¶¨¨ °¤·¨µ¬¤° §¨¬¦¤o ·«¨ ¦²±·¨±·²©³«¼·²¨ ¶·µ²ª¨ ±o º«¬¦«¦¤± ¥¬±§·² ¶¨·µ²2
ª¨ ± µ¨¦¨³·²µo ¬± ª¬¤±·®±²·º¨¨ §µ«¬½²° o¨ ©²µ¶¼·«¬¤¶∏¶³¨ ±¶¨o ¤¶«¥¤µ®o ¥¤¬¦¤¯ ¶®∏¯ ¦¯¤³µ²²·¤±§²³«¬²³²ª²±¬¶·∏¥¨ µº µ¨¨ «¬ª«¨ µq
[ Κεψ ωορδσ] ·µ¤§¬·¬²±¤¯ ≤«¬± ¶¨¨ °¤·¨µ¬¤° §¨¬¦¤~ ³«¼·²¨ ¶·µ²ª¨ ±~ µ¨¦²°¥¬±¤±·¼¨ ¤¶·¦¨¯¯~ ¶¨·µ²ª¨ ± µ¨¦¨³·²µ
≈责任编辑 古云侠  
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