全 文 ：文章编号:1002-8110(2003)04-0047-02
收稿日期:2003-03-18
作者简介:刘　晔(1969-), 女 ,山东人 ,讲师 , 在读硕士 , 主要
从事微生物技术方面的教学与科研。
基因重组技术在啤酒酵母育种 、
改进啤酒风味方面的应用
刘　晔 ,耿建华 ,刘庆军
(山东轻工业学院食品与生物工程学院 ,山东 济南　250014)
摘　要:随着 DNA 重组技术的发展 ,新型啤酒酵母的定向育种工作迅速发展。着重介绍了基因重组技术在育
种 、去除异杂味和改进啤酒风味方面的应用。
关键词:啤酒酵母;基因重组技术;双乙酰;H2S
中图分类号:TS262.5;TS261.15　　　　文献标识码:A
　　近年来 ,随着 DNA重组技术的发展 ,新型啤酒酵母的定
向育种工作迅速发展。相继产生了一些能发酵各种糖类 、改
变凝聚性的菌种;生产出的啤酒风味也有所改进。许多菌种
正处于中试阶段 ,有的菌种已被允许工业使用。酵母用于酒
精饮料的制造已有几个世纪了。最初是自然发酵 , 直到 18
世纪 , 人们才根据菌种的发酵性能将其分选 , 从而大幅度地
提高了啤酒质量及发酵控制技术。长期以来 ,啤酒酵母的育
种工作一直不易控制。这主要是因为实验室所用的酵母菌
种差异明显 ,一些适用于实验室酵母的技术不能直接用于啤
酒酵母。基于同样原因 ,啤酒酵母的基因研究工作也相对滞
后。
1　啤酒酵母改良的必要性
目前 ,工业啤酒酵母有很多局限性。由于酵母过度生
长 ,导致酵母不能将糖类完全发酵 , 麦汁利用率低;酵母凝集
性有差异;只能在有限范围内对酵母产生的风味物质加以控
制;啤酒酵母热稳定性 、耐酒精及渗透压能力较差 , 在发酵过
程中随时会有染菌的危险 ,而具有抗污染能力的酵母会极大
地降低这种危险。近年来 ,特殊性能酵母菌株的选育工作取
得了很大进展。DNA重组技术为解决上述问题提供了可行
的方法。本文着重介绍了基因重组技术在育种 、去除异杂味
和改进啤酒风味方面的应用。
2　低双乙酰啤酒酵母工程菌的构建
双乙酰是啤酒中的一种重要有害风味物质 , 是发酵过程
中缬氨酸合成途径上的一种副产物 ,由α-乙酰乳酸氧化生
成 ,然后从酵母内部渗透到发酵液中。主发酵结束后的风味
物质成熟主要是为了去除嫩啤酒中的双乙酰。许多基因技
术已被用来减少双乙酰的生成和提高发酵速度。一般通过
降低α-乙酰乳酸合成酶酶活来抑制α-乙酰乳酸合成;或
是在α-乙酰乳酸生成双乙酰之前使其迅速分解(增加氨基
酸合成途径中的酶活或引入新的酶活)见图 1。
图 1　S.Cerevisiac缬氨酸合成途径及
α-乙酰乳酸脱羧酶活性位点上的基因
ILV2:乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase), ILV3:二羟基酸脱水
酶(dihydroxyacid dehydratase), ILV5:还原异构酶(reductoi somerase)
ALDC:
α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase)
α-乙酰乳酸脱羧酶能够催化α-乙酰乳酸转化为乙偶
姻 ,从而避免其氧化成为双乙酰。很多细菌都含有这种酶 ,
编码这种酶的基因已从 Ent.Aerogenes 、Kiebs.Terrigena、Lactoc-
coccus lactis和 Acetobacter aceti vav.xylinum 中克隆出来。最初
是将 Ent.Aerogenes的基因表达在多拷贝质粒上 , 用以转化酵
母 ,经基因修饰的酵母产双乙酰大幅度降低。后来 , 人们又
将ALDC基因整合到 rDNA 中 , 由于 rDNA 具有连续重复性 ,
20 多个 ALDC 基因被拷贝整合 , 转化子显示出很高的α-乙
酰乳酸脱羧酶活性;经小型发酵实验表明 , 啤酒的最终双乙
酰含量很低。 进一步研究表明 , 将从 Ent.Aerogenes、Kiebs.
Terrigena中克隆的 ALDC 基因置于 ADH1 和 PGK 表达盒中 ,
通过整合到 rDNA、ADH1 和PGK loci来转化酵母 , 所有转化子
发酵性能都很好。当上述两种基因都置于 PGK 表达盒中且
整合到 PGK 位点时 ,主发酵结束后的双乙酰含量低于口味域
值 ,无需成熟期。目前 , 来源于 Acetobacter aceti ssp.xylinum 的
ALDC基因已被克隆到 PGK 表达盒中并整合到一种工业酵母
的基因组中。小型发酵实验表明:啤酒除双乙酰含量低外 ,
其它性状与亲本无异。而同一菌种的中试表明:在连续发酵
过程中 ,该菌株较普通菌株发酵时间明显缩短 , 啤酒质量也
第 30卷　第 4期
2 0 0 3 年 7 月　 　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUOR MAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.30 ,No.4
July , 　2003
很好 ,
人们还试图通过控制啤酒酵母中编码各种酶的 ILV 基
因来减少双乙酰含量。一种方法是在 ILV2 位点产生阻遏突
变 ,即对啤酒酵母自发减数分裂产生的抗药性分离子进行诱
变 ,然后用异亮氨酸 、缬氨酸缺陷培养基培养 ,选择长得慢的
菌株可分离出乙酰乳酸合成酶酶活很低的菌株。即用一段
ILV2 基因来转化啤酒酵母 , 使之产生抗敏感 mRNA , 从而减
少乙酰乳酸合成酶 mRNA 的量 ,使该酶的合成减少 , 降低双
乙酰含量 ,但酵母的发酵力也降低了。第三种方法是增加缬
氨酸合成途径上的通量 ,即用 ILV3 及 ILV5 基因转化酵母 , 用
其转化的酵母 ,无论是多拷贝质粒或者是整合到酵母基因组
上 ,都能增强乙酰乳酸还原异构酶活性 , 使双乙酰含量大幅
度降低。
3　低H2S 啤酒酵母工程菌的构建
啤酒中的H2S主要来自胱氨酸经半胱氨酸 , 再经半胱氨
酸脱硫酶作用而产生 ,通常后酵时通过 CO2 洗涤将其除去。
图 2　S.Cerevisiaec硫酸盐代谢途径上的基因
MET2:高丝氨酸乙酰转移酶(homoserine acetyltransferase);MET3
ATP硫化(ATP Sulphurylace);MET6:高半胱氨酸甲基转移酶(homocys-
tine methyltransferase);MET10:亚硫酸还原酶(sulphite reductase);
MET14:APS激酶(APS kinase);MET25:0 -乙酰丝氨酸 、0-乙酰高丝
氨酸硫酸盐水化酶(0 -acetylhomoserine , 0 -acetylserine sulphhydrase);
NHS5;胱硫醚 β-合成酶(cystathionine β -synthase)
　　如降低酵母 H2S 生成量 ,可改善啤酒风味和缩短发酵周
期。一种方法是克隆 NHS5 基因 , 该基因能够加强胱硫醚的
合成 ,减少 H2S 的生成。否则 , 过量的 H2S 会由酵母进入到
啤酒中(见图 2)。小型发酵实验证明 , 用此基因转化的啤酒
酵母产H2S 的量明显降低。 另一种方法是将克隆 MET25 基
因置于糖酵解启动子控制之下 ,并将这一构建整合到啤酒酵
母的 rDNA中 , 转化子 MET25 基因的表达比亲本高出几倍。
中试发酵正常 ,产 H2S 量大幅度降低。
4　产 SO2 啤酒酵母工程菌的构建
成品啤酒中的 SO2 是在发酵过程中由酵母从硫酸盐中
形成的 , SO2 的含量对啤酒风味稳定性十分重要。 SO2 不仅
是一种抗氧剂 ,而且能够与带来老化味的羰基化合物螯合 ,
美国对进口啤酒中规定游离 SO2 必须低于 8mg/ L ,人们发现
在不添加任何 SO2 抗氧剂啤酒中的 SO2 含量波动于 5 ～
12mg/ L。采用以下方法可控制 SO2含量:分别编码 ATP硫化
酶和APS 激酶的 MET3 和MET14 基因 , 并以多拷贝质粒的形
式表达在啤酒酵母中。
5　讨论
目前各国已广泛应用 DNA 重组技术构建新型啤酒酵
母 ,许多新型啤酒酵母已用于中试生产且成效很好;但有许
多问题有待于进一步研究 ,考虑到转基因菌种有可能带来的
危险 ,有关部门应建立新型食品法;另外从事这方面工作的
专业人员必须严格谨慎 ,正确预见可能带来的危险 , 否则 , 食
品 、饮料新型生物技术的应用会受到限制 , 而新技术所带来
的一系列效益也会被拒之门外。
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The Application of Recombinant DNA Technology in
Beer Breeding and Improving Beer Flavor
YE Liu , JIAN Hua-Geng ,QING Jun-Liu
(The Shandong University of Light Industry , Jinan 250100, China)
ABSRACT:With the development of recombinant DNA technology , a new directional breeding of brewer yeast is rapidly developing.The appli-
cation of recombinan DNA technology in breeding , removing miscellaneous peculiar smell and improving beer flavor are reported in this article.
KEY WORDS:brewer s yeast;recombinant DNA technology;diacetyl;H2S
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