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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):125-130
由于存在基因转录调控和转录后修饰，单纯基
因层面研究细胞代谢调控具有很大的限制性［1］，如
高估实际的细胞调控过程［2］。而通过蛋白质组表达
分析则可以将静态的细胞基因组信息与特定环境下
动态的细胞代谢调控联系起来［2］，因此，双向电泳
技术是在蛋白质水平研究基因表达和代谢调控最有
收稿日期 ：2015-02-04
基金项目 ：国家科技计划项目（2013BAD10B04-1），广东省中国科学院全面战略合作项目（2012B091100268），海洋经济创新发展区域示范
专项（SZHY2012-B01-003）
作者简介 ：贾其坤，男，硕士研究生，研究方向 ：微藻生物能源 ；E-mail ：wdyywxh@163.com
通讯作者 ：向文洲，男，研究员，研究方向 ：微藻生物能源 ；E-mail ：xwz@scsio.ac.cn
栅藻 Scenedesmus sp. 蛋白质提取方法优化及氨氮与
硝态氮处理下蛋白质组表达差异
贾其坤1，2  梁青1，2  吴后波1  王广华1  吴华莲1  李涛1  王兵3  向文洲1
（1. 中国科学院南海海洋研究所，广州 510301 ；2. 中国科学院大学，北京 100049 ；3. 深圳海王药业有限公司，深圳 518057）
摘 要 ： 旨在寻找一种快速高效提取栅藻 Scenedesmus sp. 蛋白质的方法并研究氨氮对该藻的毒害机制。使用液氮研磨和超
声细胞破碎进行细胞破碎，丙酮沉淀和 TCA-丙酮沉淀法进行蛋白纯化，SDS-PAGE 进行蛋白样品丰度检验，2-DE 电泳技术对差异
表达蛋白进行分析。结果显示，对于栅藻 Scenedesmus sp.，液氮研磨破碎细胞效果明显优于超声细胞破碎法，前者细胞破碎完全，
内容物充分外泄。TCA-丙酮沉淀纯化得到的蛋白样品不仅浓度高，而且丰度和纯度均显著优于丙酮沉淀法。氨氮毒害作用下栅藻
Scenedesmus sp. 蛋白差异表达分析结果显示 85 个表达降低的蛋白和 25 个表达升高的蛋白，这些蛋白涉及光合作用、二氧化碳固定、
糖酵解、蛋白质合成及非正常折叠蛋白降解、细胞分裂和物质运输，以及自由基清除等途径。应用液氮研磨和 TCA-丙酮沉淀法可
快速高效地提取栅藻 Scenedesmus sp. 蛋白质，氨氮毒害作用涉及光合作用、脂肪酸合成、非正常折叠蛋白降解等多种代谢途径。
关键词 ： 双向电泳 ；栅藻 ；细胞破碎 ；蛋白纯化 ；氨氮毒害
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.014
An Optimized Protocol for Crush Cell and Isolation of Protein from
Scenedesmus sp. and Ammonia Toxicity Analysis
Jia Qikun1，2 Liang Qing1，2 Wu Houbo1 Wang Guanghua1 Wu Hualian1 Li Tao1 Wang Bing3 Xiang Wenzhou1
（1. South China Sea Institute of Oceanology Chinese Academy of Science，Guangzhou 510301 ；2. University of Chinese Academy of Sciences，
Beijing 100049 ；3. Shenzhen Haiwang Pharmaceutical Co.，LTD，Shenzhen 518057）
Abstract: Propose an optimized protocol for crush cell and isolation of protein from Scenedesmus sp. and study the ammonia toxicity of
this algal with this protocol. Liquid nitrogen grinding and ultrasonic crushing method was used to disrupt the algae and acetone precipitation and
TCA-acetone precipitation methods to extract and purify protein. Results showed that we found that the combination of liquid nitrogen grinding
and TCA-acetone precipitation was effective and efficient as the cell crushed adequately and the protein sample was purified well and the protein
amount and abundance was higher. The preliminary inquiry of ammonia toxicity to Scenedesmus sp. with two-dimensional gel electrophoresis（2-
DE）technology found that 85 protein spots decreased and 25 protein spots increased as the algae cultured with ammonia compared with nitrate
nitrogen. Those proteins have been identified as involved in photosynthesis, carbon dioxide fixation, glycolytic, protein synthesis and degradation
of ubiquitinated protein, cell division and material transportation, and radical scavenging pathway.
Key words: 2-DE ；Scenedesmus ；crush cell ；protein purification ；ammonia toxicity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11126
效的手段之一［3，4］。但如何快速高效地提取细胞内
全部蛋白，蛋白沉淀后如何保证其复溶性，如何提
高双向电泳图谱分辨率等问题依然限制着这一技术
的发展［5］。虽然目前有很多方法可以使哺乳动物
和组织的蛋白样品达到 3 000-10 000 个蛋白点，但
当应用到微藻时，结果往往很不理想，出现诸如细
胞破裂不完全、蛋白复溶度低等问题。如研究者对
Synechocystis sp. Strain PCC 6803 进行实验时，仅得
到不足 400 个蛋白点［6］。另外，由于不同种的微藻
其细胞生化成分不同（尤其是微藻内含有的大量的
叶绿素和类胡萝卜素），而这些成分的差异可能会影
响到蛋白的溶解性及提取率［5］，因此双向电泳蛋白
样品的制备方法因不同的种属而异。
无论陆生环境还是水生环境，对于其中的生物
来说，氮都是一个重要的限制条件［7］。与硝态氮和
尿素中的氮元素相比，大多数微藻更倾向于利用氨
态氮，因为这种形式的氮可以在不需要还原的情况
下直接参与细胞内各种代谢途径［8］。在栅藻中也发
现同样的现象，氨态氮培养的微藻的生长速率显著
高于硝态氮和尿素等其他形式［9］。但高浓度的氨态
氮却会严重抑制微藻的生长和油脂含量［10，11］，更
高浓度的氨态氮甚至会产生严重的毒害作用［12］。不
同种属的微藻对氨氮的耐受能力差别很大［7］，研究
表明，在 pH>8.0 的情况下，当氨态氮浓度大于 2.0
mmol/L 时可以显著抑制栅藻 Scenedesmus obliquus 的
光合速率和生长速率［13］。
本实验初步探究栅藻 Scenedesmus sp. 双向电泳
蛋白样品的制备方法及氨氮毒害作用下该藻蛋白差
异表达情况，为研究氨氮对其的毒害机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源 栅藻 Scenedesmus sp. 为实验室自
行分离保种，经 18S rRNA 和 ITS 鉴定，为栅藻科栅
藻属的微藻。微藻正常培养使用改进的土壤浸出液
培 养 基（Modified soil extract medium，MSE）， 培 养
基配方，见表 1。
1.1.2 主要仪器 紫外分光光度计（Ultrospec 6300
pro，General Electric）、 台 式 微 量 离 心 机（5415D、
Eppendorf）、光学显微镜（Olympus BX53）、恒温培
养箱（SHP-250）、水浴培养箱（OLS 200）、超声细
胞破碎仪 Sonics VCX 130-PB、琼脂糖凝胶电泳仪
Bio-Rad JUNYITM、2-DE 电泳仪 GE Healthcare Ettan
DALT six。
1.1.3 主要试剂 丙酮、甲醇、乙醇、磷酸、硫酸铵、
冰醋酸和超纯水，购自广州化学试剂厂 ；30% 的丙
烯酰胺、TEMED、SDS、pH6.8/8.8 的 1.5 mol/L Tris-
HCl、CHAPS、DTT、APS、TCA、矿物油、考马斯亮
蓝 G-250（电泳纯）、低熔点琼脂糖、蛋白酶抑制剂，
购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 微藻藻种首先在正常培养基上进
行活化，取活化后处于对数期的微藻藻种以 10%
的比例接种到正常培养基和氨态氮培养基上。氨
氮 培 养 基 的 配 方 与 上 述 MSE 培 养 基 一 致， 但 以
0.315 g/L 的 NH4Cl 代替 MSE 培养基中的 0.5 g/L 的
NaNO3，两种培养基中的 N 元素含量一致，为 5.88
mmol。此浓度的氨态氮对栅藻可产生严重的毒害作
用。培养条件为 24 h 光照，光照强度为 100 mmol
photon/（m·s），培养温度控制在（24±1）℃。
1.2.2 细胞破碎方法 目前常用的细胞破碎提取全
细胞蛋白质的方法主要有两种，超声细胞破碎法和
液氮研磨破碎法。本实验使用两种方法进行细胞破
碎并通过显微镜观察细胞破碎情况。
液氮研磨时首先将研钵用液氮预冷，然后取适
量 -80℃冻存的藻泥，加入液氮充分研磨 15 min，研
磨后的藻粉加入 1.5 mL 裂解液，裂解液配方如下 ：
8 mol 尿素，4% CHAPS，65 mmol DTT 和蛋白酶抑
制剂。涡旋震荡 20-30 min 使其充分裂解。超声细
胞破碎时为防止超声过程中起热，操作需在冰上进
行，藻泥中加入 1.5 mL 裂解液，超声震荡 10 min，
表 1 MSE 微藻培养基配方
营养物 含量 单位 营养物 含量 单位
NaHCO3 3 g/L soil extract 1 mL
NaH2PO4·2H2O 0.05 g/L H3BO3 2.86 ppm
NaNO3 0.5 g/L MnCl2·4H2O 1.80 ppm
CaCl2 0.02 g/L ZnSO4·7H2O 0.22 ppm
MgSO4·7H2O 0.05 g/L CuSO4·5H2O 0.08 ppm
KCl 0.1 g/L Na2MoO4·2H2O 0.39 ppm
EDTA-Fe3+ 1 mL
2015,31(11) 127贾其坤等 ：栅藻 Scenedesmus sp. 蛋白质提取方法优化及氨氮与硝态氮处理下蛋白质组表达差异
每超声 5 s 停止 10 s 以防止起热和起泡。
细胞破碎后，12 000 ×g 4℃离心 10 min 将未破
碎的细胞和破碎细胞的残渣去除，蛋白质与细胞内
多糖、脂质、细胞器，细胞质等其他细胞内容物共
同存在于上清中，主要通过两种方法进行蛋白纯化：
TCA 丙酮沉淀法和丙酮沉淀法。其中 TCA 丙酮沉淀
法的主要步骤如下 ：
（1）向上清液中加入 4 倍体积预冷的 10% TCA-
丙 酮 溶 液（20 mmol DTT）， 于 -20 ℃ 自 然 沉 淀 30
min，8 000×g -4℃离心 10 min。
（2） 去 上 清， 加 入 30 mL 预 冷 的 80% 丙 酮
（水）溶液（20 mmol DTT），用枪吹打沉淀，尽量分
散，-20℃沉淀 30 min 后同样条件离心 10 min。
（3）依次用 90% 丙酮（20 mmol DTT）和纯丙酮
（20 mmol DTT）重复步骤（2）。
（4）去上清，沉淀在冰上沥干，用滤纸擦拭试
管内壁，尽量擦去残留的丙酮溶液。
（5）加入 1.5-2 mL 复溶液，震荡器上充分震荡
溶解 20 min，-20℃备用。复溶液配方与裂解液相同。
丙酮沉淀法步骤（1）中使用的为纯丙酮溶液
（20 mmol DTT）而非 10% 的 TCA-丙酮，其他步骤
与上述 TCA-丙酮沉淀法一致。
1.2.3 蛋白浓度及纯度测定 提取的蛋白质样品在
双向电泳开始前需要对其进行蛋白定量和蛋白丰度
检验。蛋白质定量使用非干扰型蛋白质定量试剂盒，
一般认为当蛋白质浓度介于 4-10 mg/mL 时较适合进
行双向电泳实验。同时 SDS-PAGE 胶可以初步检测
所提蛋白的丰度，一般提取成功的蛋白样品条带清
晰丰富 ；而蛋白种类较少则会导致 SDS-PAGE 胶条
带较少，多是由于提取方法不当、细胞破碎不够完
全或提取过程中蛋白降解等原因造成的。因此，在
双向电泳前进行 SDS-PAGE 胶检验是非常必要的。
电泳结束后拆除电泳装置，将胶块放在方盒中，加
入考马斯亮蓝进行染色 1 h，加入双蒸水进行摇床震
荡脱色。在 Image Scanner III 扫描仪上扫描观察。
1.2.4 双向电泳及差异蛋白点的检测分析 取出蛋
白样品，加入水化液至 350 mL，蛋白样品与上样
缓冲液的比例以蛋白样品的含量而定。本实验使用
的是 pH4-7，17 cm 的胶条，一般要求蛋白总量在
800-1 000 mg 之间。在水化槽中加入适量的矿物油
以覆盖胶条防止水分挥发。被动水化 16 h 后进行等
电聚焦电泳，等点聚焦结束后，取出胶条，依次在
DTT-平衡缓冲液和碘乙酰胺 - 平衡缓冲液中分别平
衡 15 min，然后进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。电泳结
束后取出凝胶，用超纯水清洗后经固定液固定 1 h，
然后考马斯亮蓝 G-250 染色 1 h，最后超纯水脱色，
在 Image Scanner III 扫描仪上扫描观察。
应 用 Melanie version 7.0 software（Swiss Institute
of Bioinformatics）对凝胶进行分析，对差异蛋白进行
挖取，应用 MALDI-TOF-MS/MS 进行检测，检测结
果在 NCBI 蛋白数据库进行比对，得到其蛋白种类
和功能及其他信息。
2 结果
2.1 细胞破碎方法的比较
经液氮研磨，藻细胞破碎较完全（图 1-A），完
整细胞较少，细胞内容物外泄，视野中充斥大量的
细胞碎片和残渣 ；而经超声细胞破碎仪处理的样品
（图 1-B），细胞破碎率明显较低，大量细胞保持原
有的圆球形结构，细胞颜色鲜艳，几乎没有内容物
外泄，仅有少量空壳细胞及碎片。
A B
20 μm 20 μm
图 1 Scenedesmus sp. 经液氮研磨（A）与超声破碎（B）
处理后显微照片
2.2 蛋白提取方法的比较
经丙酮沉淀和 TCA-丙酮沉淀两种方法纯化后
的蛋白样品复溶效果略有差异，对其进行蛋白定
量。结果显示，丙酮沉淀法得到的蛋白样品浓度为
5 mg/mL，而 TCA-丙酮沉淀法得到的蛋白样品浓度
略低，为 3.5 mg/mL。但 PAGE 胶检验蛋白丰度时
发现 ：丙酮沉淀法制备的蛋白样品条带较少且不清
晰，样品中的蛋白种类单一（图 2-A）。TCA-丙酮
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11128
法纯化蛋白获得的蛋白样品种类多，条带丰富清晰
（图 2-B）。
无法有效地破碎细胞，而液氮研磨作为最剧烈的破
细胞方法，同时加入裂解液和反复冻融的协同作用，
样品破碎较完全，可作为一种有效快速的破碎细胞
提取蛋白的方法使用。
藻类细胞中含有大量的盐、核酸、多糖和脂质
等物质，尤其是盐离子，对双向电泳的结果影响极
大。盐离子浓度过高通常会导致聚焦电流过大，聚
焦时间过长或最终达不到设定电压等问题，严重的
会导致 IPG 胶条拱起或烧坏。双向电泳蛋白样品不
仅要求纯度高，蛋白丰度也有很高的要求。如果在
蛋白提取或纯化过程中损失大量的蛋白，就失去了
差异蛋白分析的意义。本实验通过丙酮沉淀和 TCA-
丙酮沉淀两种方法纯化蛋白发现 ：丙酮沉淀法制备
的蛋白样品条带较少且不清晰，样品中的蛋白种类
单一，说明在提取过程中有大量的蛋白损失。此法
不可作为一种有效的蛋白纯化手段用于双向电泳。
TCA-丙酮法纯化法获得的蛋白样品种类多，表现为
条带丰富清晰，说明 TCA-丙酮法较之丙酮法，在蛋
白纯度和丰度上具有显著的优势，用此法纯化的蛋
白适于双向电泳实验。
对不同氮源培养的微藻进行蛋白提取发现，氨
氮培养的微藻在同样提取条件下得到的蛋白样品浓
度始终低于 MSE 培养的微藻蛋白样品。说明氨氮培
养条件下细胞内可溶性蛋白含量降低，这一结果与
之前的报道一致［14］。如前所述，低浓度的氨态氮可
以更容易被微藻吸收利用，但高浓度的氨态氮却可
以抑制微藻的生长。而更高浓度的氨态氮则会对微
藻产生严重的毒害作用。这些毒害作用包括较低的
生物量合成速率、油脂含量以及细胞代谢速率。显
然，这些宏观的表征的变化是由细胞内部代谢调控
的变化引起的，甚至可能在基因表达调控的层面。
比较正常培养基（硝态氮）与氨态氮培养的微藻蛋
白表达差异发现，氨氮毒害下微藻蛋白表达确实发
生了很大的变化。相比于正常状态，氨氮培养的微
藻表达蛋白谱中有 85 个表达量降低的蛋白，25 个
表达升高的蛋白。值得注意的是，有些蛋白点虽然
具有不同的相对分子量和 pH（A70 和 A82），但其
飞行质谱检测结果却是同样的蛋白。其他的研究也
曾报道过类似的现象并推测它们是同一个基因的表
达产物，只是表达后修饰不同而引起的，或者也可
250
kD
M A B A B
150
100
75
50
37
25
20
15
10
M ：蛋白 Marker ；箭头指示为差异蛋白条带
图 2 丙酮沉淀法（A）与 TCA-丙酮沉淀法（B）提取微
藻 Scenedesmus sp. 蛋白 SDS-PAGE 电泳图
2.3 不同氮源培养微藻蛋白表达差异
比较正常培养基（硝态氮）与氨态氮培养基培
养的微藻其蛋白表达的差异发现，两种培养模式的
微藻蛋白表达发生了很大的变化（图 3-A 和 3-B）。
和正常培养基相比，氨氮培养的微藻表达蛋白谱中
有 85 个表达量降低的蛋白（图 3-C），25 个表达升
高的蛋白（图 3-D）。根据 pH 和 MW 选择了 26 个表
达量降低的蛋白和 6 个表达量升高的蛋白进行飞行
质谱 MALDI-TOF-MS/MS 检测（图 4）。检测结果与
NCBI 数据库比对发现，这些蛋白涉及光合作用、二
氧化碳固定、糖酵解、蛋白质合成及非正常折叠蛋
白降解、细胞分裂和物质运输，以及自由基清除等
途径（表 2）。由于微藻相关蛋白数据库目前尚不完
备，因此飞行质谱结果在数据库上检索匹配率较低，
仅检测到 9 个蛋白，其中 6 个表达量降低的蛋白分
别为：甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（A24）、烯醇化酶（A28）、
肌动蛋白（A50）、核酮糖 -1，5- 二磷酸羧化酶（A70
和 A82）和细胞分裂相关蛋白（A83）。3 个表达含
量增高的蛋白分别是 ：50S 核糖体蛋白（B05）、Fe-
氢化酶（B15）和 30S 核糖体蛋白（B17）。
3 讨论
栅藻 Scenedesmus sp. 细胞体积较大，细胞壁的
三层结构提供坚固的保护壁，因此超声细胞破碎法
2015,31(11) 129贾其坤等 ：栅藻 Scenedesmus sp. 蛋白质提取方法优化及氨氮与硝态氮处理下蛋白质组表达差异
能是隶属于同一个蛋白家族［15］。飞行质谱检测和数
据库检索发现，这些蛋白涉及光合作用、二氧化碳
固定、糖酵解、蛋白质合成及非正常折叠蛋白降解，
细胞分裂和物质运输，以及自由基清除等途径。以
上结果为后续深入的氨氮毒性机理研究奠定了基础。
4 结论
本实验通过比较两种微藻细胞破碎方法和两种
微藻细胞蛋白纯化方法，确定了通过液氮研磨破碎
细胞和 TCA-丙酮沉淀提纯蛋白质的双向电泳蛋白
样品提取方法，用此方法不仅细胞破碎完全，且提
取的蛋白溶解性好、纯度高、丰度高。运用这种提
取工艺初步探究了氨氮毒害作用下栅藻 Scenedesmus
180
kD 4
pH
7
135
100
75
63
48
35
25
17
11
180
kD 4
pH
7
135
100
75
63
48
35
25
17
11
180
kD 4
pH
7
135
100
75
63
48
35
25
17
11
180
kD
A B
C D
4
pH
7
135
100
75
63
48
35
25
17
11
氨氮毒害作用下表达含量降低的 85 个蛋白点以绿色箭头标注（C），表达含量增高的蛋白以红色箭头标注（D）
图 3 硝态氮（A 和 C）与氨态氮（B 和 D）培养的微藻 Scenedesmus sp. 蛋白表达差异
A06
NO3--N NH4+-N NO3--N NH4+-N NO3--N NH4+-N
A07
A15
A23
A28
A42
A50
A65
A76
A83
B04
B17
A10
A18
A24
A39
A43
A61
A70
A78
B05
A14
A21
A27
A40
A44
A62
A75
A82
B03
B15
图 4 检测的 26 个表达量降低的蛋白和 5 个表达量升高的
蛋白局部放大图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11130
sp. 蛋白表达差异，检测到的差异单白涉及光合作用，
二氧化碳固定、糖酵解、蛋白质合成及非正常折叠
蛋白降解、细胞分裂和物质运输，以及自由基清除
等途径等代谢通路。
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表 2 MALDI-TOF-MS/MS 检测到的栅藻 Scenedesmus sp. 在氨态氮与硝态氮作用下差异表达的蛋白
Spot Accession number Protein name Function class MW/pI Expression
A24 G3PC_SCEVA Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Glycolytic pathway 33456/5.61 ↓1.86
A28 Q946Z4_9CHLO Enolase Glycolytic pathway 14277/8.12 ↓4.67
A50 E3SC86_ACUOB Actin
Cell division and material
transport
27725/5.12 ↓100
A70 Q8HD99_SCEQU Ribulose bisphosphate carboxylase CO2 fixation 42468/6.97 ↓2.85
A82 A1E8W9_ACUOB Ribulose bisphosphate carboxylase CO2 fixation 42230/8.03 ↓100
A83 Q1KVX9_ACUOB Cell division protein Cell division 434846/9.90 ↓100
B05 RK23_ACUOB 50S ribosomal protein L23 Protein synthesis 10496/10.21 ↑ 2.63
B15 Q9AR66_ACUOB Fe-hydrogenase SOS 49023/5.94 ↑1.93
B17 RR19_ACUOB 30S ribosomal protein S19 Protein synthesis 10578/10.71 ↑ 4.29
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（责任编辑 马鑫）