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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
收稿日期 : 2012-05-29
基金项目 : 上海市教育委员会重点创新基金项目（11ZZ148）, 上海市科促会联盟计划项目（4319）, 上海市宝山区科学技术委员会科研基金
项目（CXY-2010-31）
作者简介 : 高北 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 水产生物分子生物学 ; E-mail: wintergb@hotmail.com
通讯作者 : 陶妍 , 女 , 教授 , 硕士生导师 , 研究方向 : 水产生物分子生物学 ; E-mail: ytao@shou.edu.cn
斑点叉尾鮰 BPI 抗菌肽的 cDNA 克隆及原核
表达载体的构建
高北  陶妍
（上海海洋大学食品学院，上海 201306）
摘 要 ： 杀菌 / 渗透增强蛋白（bactericidal /permeability increasing protein，BPI）是生物机体细胞中表达的一种能够特异性
杀灭革兰氏阴性菌的抗菌类蛋白，该蛋白包括氨基端和羧基端两个结构域，其中氨基端结构域主要承担杀菌和中和内毒素的功能。
参考已经报道的对人类 BPI 进行重组 DNA 表达的研究结果，首先通过 RT-PCR 和巢式 PCR 从斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）鳃
中克隆了编码 BPI 氨基端活性结构域的 cDNA 片段“BPINtd”，该片段由 175 个氨基酸残基组成，其中 63 个氨基酸残基在空间上形
成一个非极性的脂质结合袋，与革兰氏阴性菌外膜上脂多糖（LPS）结合，从而改变细菌膜的通透性，达到杀菌的效果。根据斑点
叉尾鮰与其他生物之间 BPI 氨基酸序列的比对结果，发现氨基端存在 40 个保守的氨基酸残基，其中 9 个高度保守的残基位于脂多
糖结合区域内。为了进一步建立原核表达系统，根据 pET-32a（+）和 pET-28a（+）两种质粒的不同特点，选择其作为原核表达质
粒，将“BPINtd”片段分别插入两种质粒，通过菌落 PCR、EcoR I 和 Hind III 双酶切反应以及 DNA 测序等方法，证明了重组表达质
粒“pET-32a-BPINtd”和“pET-28a-BPINtd”已被成功构建。
关键词 ： 斑点叉尾鮰 BPI 结构域 cDNA 克隆 原核表达
cDNA Cloning and Construction of Prokaryotic Expression Vectors for
Channel Catfish BPI Antibacterial Peptide
Gao Bei Tao Yan
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract:  Bactericidal/permeability increasing protein（BPI）, an antimicrobial protein expressed in organism cells, shows particular
antimicrobial activity against gram-negative bacteria. BPI contains two domains, N-terminal domain and C-terminal domain. The antibiotic and
endotoxin-neutralizing functions of BPI are attributed to the N-terminal domain. The present study was performed with reference to the report
for the recombinant DNA expression of human BPI. A cDNA fragment “BPINtd” encoding the N-terminal active domain of BPI was cloned
from the gill of channel catfish（Ictalurus punctatus）by RT-PCR and nested PCR. This fragment encodes a peptide consisting of 175 amino
acid residues, in which 63 residues can form a three-dimensional apolar lipid-binding pocket which is used to bind lipopolysaccharide（LPS）
located in outer membrane of gram-negative bacteria. The comparison of the channel catfish BPI with the BPIs from other organisms showed that
40 conserved amino acid residues appear at the N-terminal domain, and among them 9 highly conserved residues located in the LPS-binding
region. The pET-32a（+）and pET-28a（+）with different characteristics were chosen as the prokaryotic expression vectors to construct
the prokaryotic expression system. “BPINtd” fragment was inserted into these two plasmids respectively. The colony PCR, EcoR I and Hind III
restriction endonuclease digestion and DNA sequencing demonstrated that the “pET-32a-BPINtd” and “pET-28a-BPINtd” recombinant expression
plasmids were constructed successfully.
Key words:  Channel catfish BPI Domain cDNA cloning Prokaryotic expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期132
近年来由于水产养殖中滥用抗生素的问题越来
越突出，研制新型有效、无毒无残留的生物抗菌剂
用以替代抗生素已成为当前水产养殖中急待解决的
一个重要问题。抗菌肽是一类小分子多肽，对耐药
致病菌具有良好的杀灭作用，其抗菌活性强、功能
广泛［1］，因此近年来越来越多地受到关注，其中能
够特异性杀灭革兰氏阴性细菌并中和内毒素的抗菌
肽已成为研究的热点。杀菌/渗透增强蛋白（bacteri-
cidal/permeability increasing protein，BPI） 是 主 要 存
在于人、兔、牛等嗜中性粒细胞中的一种阳离子抗
菌肽［2］，具有杀灭革兰氏阴性菌、中和内毒素和
调理吞噬功能［3］。BPI 有两个结构域，即氨基端的
结构域和羧基端的结构域，而杀灭革兰氏阴性细菌
和中和内毒素的活性取决于氨基端的结构域［4］。大
西洋鳕鱼（Gadus morhua）［5］、虹鳟（Oncorhynchus
mykiss）［6］、 大 黄 鱼（Pseudosciaena crocea）［7］、 鲤
鱼（Cyprinus carpio）［8］ 和 牙 鲆（Paralichthys oliva-
ceus）［9］ 等 鱼 类 的 BPI 基 因 已 被 成 功 克 隆 ；2005
年，Peng 等［10］ 报道了编码斑点叉尾鮰（Ictalurus
punctatus）BPI 的全长 cDNA 序列，并通过实时荧光
定量 PCR 检测了 BPI 基因在不同组织中的表达情况。
然而，迄今为止，关于鱼类 BPI 原核表达方面的研
究报道甚少。本研究以斑点叉尾鮰鳃为材料，通过
RT-PCR 和巢式 PCR 对编码 BPI 氨基端的功能性结
构域进行 cDNA 克隆［10-12］，并构建两个原核重组表
达载体，旨在为进一步通过基因工程技术制备 BPI
抗菌肽奠定重要的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
斑点叉尾鮰（体重 1 200 g，体长 30 cm）购于
上海市浦东新区果园农贸市场。鲜活鱼运至实验室
后，立即用钝器击毙，取其鳃提取总 RNA。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取和第一股 cDNA 合成 采用 Trizol
试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），按照说明
书对斑点叉尾鮰的鳃组织进行总 RNA 的提取。第一
股 cDNA 的 合 成 按 M-MLVRTase cDNA Synthesis Kit
（TaKaRa，Otsu，Japan）说明书进行。2 μL 总 RNA、
5 μL AP（Adapter Primer）通用引物、2 μL ddH2O 混
匀，70℃保温 10 min，冰浴 2 min ；依次加入 4 μL
5×First strand buffer、4 μL dNTP mixture（2.5 mmol/
L）、2 μL DTT（0.1 mol/L），42℃保温 2 min，再加入
1 μL Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（200
U/L）保温 70 min ；70℃保温 15 min、冰上冷却后得
到第一股 cDNA。
1.2.2 BPI 氨基端活性结构域的 cDNA 克隆 以斑
点叉尾鮰鳃的第一股 cDNA 为模板，参考斑点叉尾
鮰 BPI 基因序列（序列号 ：AY816351） 设计引物
BPIsn-F 和 BPIsn-R，对编码 BPI 信号肽和氨基端结
构域的 cDNA 进行 PCR 扩增（表 1，图 1）。PCR 反
应体系和条件如下 ：10.0 μL 第一股 cDNA、各 4.0
μL 100 μmol/L 的 BPIsn-F 和 BPIsn-R、1.0 μL Ex Taq
DNA polymerase（5 U/μL）（TaKaRa，Otsu，Japan）、
50 μL 10×Ex Taq Buffer、8.0 μL dNTP Mixture， 用
无菌水将反应液调至 100 μL ；94℃预变性 5 min、
94℃变性 30 s、60℃退火 30 s、72℃延伸 90 s、最终
72℃终延伸 5 min，保温 10 min，反应共进行 30 个
循环。
采用 DNA 纯化试剂盒（天根生物科技公司，北
京）纯化上述片段 ；以此片段为模板，根据巢式
PCR 原理，使用分别添加 EcoR I 和 Hind III 酶切位
点的 BPIn-F 和 BPIn-R 引物，对编码 BPI 氨基端包
括脂多糖结合位点的活性结构域的 cDNA 进行扩增
（表 1，图 1）。PCR 反应体系和条件同上。纯化后的
目的片段“BPINtd”与 pSURE-T Simple 载体（艾德
莱生物科技有限公司，北京）按 5 ∶ 1 比例、在 T4
DNA 连接酶作用下、16℃连接 12 h，然后转化感受
态细胞 DH5α，37℃培养过夜 ；挑选阳性克隆由上
海生工生物工程有限公司进行 DNA 测序。
表 1 用于 PCR 扩增的引物核苷酸序列
引物 序列（5 → 3）
BPIsn-F ATGGTGTCTCTGTGGTGTGTG
BPIsn-R AGAACTCCCCCTTTAAACTGAGATC
BPIn-F CGGAATTCACTAACCCCGGAGTT
BPIn-R CCCAAGCTTAGAACAGATCTGTTTCTG
下划线部分为 EcoR I 和 Hind III 的酶切位点，CG 和 CCC 为保护碱基
1.2.3 基于 BPI 氨基酸序列的分子系统树构建 采
用 MAGA5.05 软件构建分子系统树。用于构建分子
2012年第12期 133高北等 ：斑点叉尾鮰 BPI 抗菌肽的 cDNA 克隆及原核表达载体的构建
系统树的各种 BPI 氨基酸序列来自 NCBI 网站 ：鲤鱼
（Common carp，ID：AU279378）、 斑点叉尾鮰（Channel
catfish，ID ：NM_001200200）、 虹 鳟 同 工 型 1
（Rainbow trout1，ID ：NM_001124198）、虹鳟同工型
2（Rainbow trout2，ID ：（NM_001124585）、 大 黄 鱼
（Large yellow croaker，ID ：DQ917778）、 大 西 洋 鳕
鱼（Atlantic salmon，ID ：NM_001141727）、 热 带 爪
蟾（Western clawed frog，ID ：NM_001092739）、 家
鼠（Mouse，ID ：NM_177850）、 家 兔（Rabbit，ID ：
NM_001195804）、人（Human，ID ：BC040955）、牛
（Bovine，ID ：BC102310）、 野 猪（Wild boar，ID ：
NM_001159307）、太平洋牡蛎（Pacific oyster，ID ：
HM992925）。
1.2.4 两 种 重 组 表 达 载 体 的 构 建 将 含 pSURE-
BPINtd 重组质粒的阳性菌落经液体培养后采用质
粒小提试剂盒（天根生物科技公司，北京）进行质
粒提纯，然后用 EcoR I 和 Hind III 对重组质粒进行
双酶切处理 ；酶切产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检验
后，切下目的片段进行 DNA 纯化。另一方面，将
pET-32a（+）和 pET-28a（+）表达载体（Novagen，
Darmstadt，Germany）转化 DH5α、液体培养过夜后
提纯质粒，亦用 EcoR I 和 Hind III 进行双酶切处理 ；
酶切产物经 0.5% 琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性
条带进行 DNA 纯化。
将上述含酶切位点的 BPINtd 片段分别与线性
pET-32a（+）和 pET-28a（+）质粒按 7 ∶ 1 比例混合，
图 1 BPI 氨基端活性结构域 cDNA 克隆的 PCR 策略图
BPln-RBPln-F
BPlsn-RBPlsn-F
Signal peptide
NH2
N-terminal domain C-terminal domain
LPS-binding domain
COOH
enterokinase
His-Tag
trxA
f1 origin
EcoR IHind III
Amp
ori
lac 1
enterokinase
His-Tag
trxA
f1 origin
EcoR I
Hind III
BPINtd
Amp
ori lac 1
pET-32a+5 900 bp
pET-32a-BPINtd6 412 bp
His-Tagf1 origin
EcoR IHind III
Amp
ori
lac 1
His-Tag
f1 origin EcoR I
Hind III
BPINtd
kan
ori
lac 1
pET-28a+5 369 bp pET-28a-BPINtd5 881 bp
A
B
图 2 重组表达质粒 pET-32a-BPINtd（A）和 pET-28a-BPINtd（B）构建图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期134
在 T4 DNA 连接酶作用下，45℃下保温 5 min 后，迅
速置于冰浴中冷却，16℃连接过夜（图 2）。连接液
转化感受态细胞 Top10，37℃培养过夜，次日进行
菌落 PCR、双酶切鉴定和测序验证。
2 结果
2.1 BPI中编码氨基端活性结构域的cDNA序列
以斑点叉尾鮰鳃第一股 cDNA 为模板、BPIsn-F
和 BPIsn-R 为引物扩增得到编码 BPI 氨基端包含信
号肽和功能性结构域在内的 739 bp 的 cDNA 片段
（图 3-A）；根据巢式 PCR 的原理，进一步以该片段
为模板，通过 BPIn-F 和 BPIn-R 引物扩增得到 525
bp 的目的片段 BPINtd（图 3-B）。经 DNA 测序，证明
该片段成功引入了 EcoR I 和 Hind III 两个酶切位点
（图 4）；除去两个酶切位点，该片段编码了斑点叉
尾鮰 BPI 氨基端由 175 个氨基酸残基组成的包括脂
多糖结合位点的活性结构域。
1500
bp M 2
1000
500
200
100
525
bp
1500
bp M 1
1000
500
200
100
739
A B
bp
M. DNA 分子量标准 ；1. 第一次 PCR 扩增产物 ；2. 第二次 PCR 扩增产物
图 3 斑点叉尾鮰 BPI 氨基端活性结构域的 PCR 扩增
图 4 斑点叉尾鮰 BPI 氨基端活性结构域的核苷酸及推断的氨基酸序列
下划线表示 EcoR I 和 Hind III 酶切位点 ；方框表示脂多糖结合区域
1
1
101
32
201
66
301
99
401
133
501
166
2.2 斑点叉尾鮰与其他鱼类之间BPI初级结构的比较
使用 BioEdit Version 7.0 软件对斑点叉尾鮰和其
他鱼类 BPI 的氨基酸序列进行比对，使用 Simple Mo-
dular Architecture Research Tool（SMART）version 4.0
（http ：//smart.emblheidelberg.de/）和 SignalP（http ：//
cbs.dtu.dk/services/SignalP）在线分析工具对序列进
行分析预测。如图 5 所示，不同鱼类 BPI 的氨基酸
序列中均包括信号肽部分、氨基端结构域和羧基端
结构域。氨基端结构域富含带正电荷的和亲水性的
氨基酸残基，其中与脂多糖结合的区域由 63 个氨
基酸残基组成，在 BPI 蛋白的三级结构中，该区域
位于脂质结合袋内，通过与脂多糖的脂质 A 酰基链
作用而结合脂多糖［13］；羧基端区域大多含疏水性
氨基酸残基 ；氨基端和羧基端两个结构域之间由富
含脯氨酸的肽链连接。由表 2 可见，斑点叉尾鮰与
鲤鱼之间显示了最高的核苷酸序列同源性（88%）、
与虹鳟鱼的两个同工型之间的核苷酸序列同源性均
为 86%、与大西洋鳕鱼之间的核苷酸序列同源性为
78%。另外，氨基端结构域中含 40 个高度保守的残
基位点，其中 9 个残基位于脂多糖结合区域内。
2.3 基于斑点叉尾鮰和其他生物BPI氨基酸序列的
分子系统树分析
采用“Neighbor-Joining”法构建的分子系统树
中，各结点的置信度由自引导值估计，重复次数为
1 000。由图 6 可见，根据不同生物的 BPI 蛋白氨基
酸序列构建的分子系统树分为 3 大组，分别为无脊
2012年第12期 135高北等 ：斑点叉尾鮰 BPI 抗菌肽的 cDNA 克隆及原核表达载体的构建
Channel catfish
Common carp
Atlantic cod
Large yellow crocker
Rai nbow 1
Rai nbow 2
Salmon
Channel catfish
Common carp
Atlantic cod
Large yellow crocker
Rai nbow 1
Rai nbow 2
Salmon
Channel catfish
Common carp
Atlantic cod
Large yellow crocker
Rai nbow 1
Rai nbow 2
Salmon
Channel catfish
Common carp
Atlantic cod
Large yellow crocker
Rai nbow 1
Rai nbow 2
Salmon
Channel catfish
Common carp
Atlantic cod
Large yellow crocker
Rai nbow 1
Rai nbow 2
Salmon
Channel catfish
Common carp
Atlantic cod
Large yellow crocker
Rai nbow 1
Rai nbow 2
Salmon
Channel catfish
Common carp
Atlantic cod
Large yellow crocker
Rai nbow 1
Rai nbow 2
Salmon
Channel catfish
Common carp
Atlantic cod
Large yellow crocker
Rai nbow 1
Rai nbow 2
Salmon
279
277
277
272
277
277
274
349
347
347
342
347
347
344
419
417
417
412
417
417
414
475
473
473
472
473
473
484
70
68
68
63
68
68
66
139
137
137
132
137
137
134
209
207
207
202
207
207
204
475
473
473
472
473
473
485
方框部分为保守氨基酸残基 ；↓之前为信号肽序列 ；浅灰色和深灰色阴影分别为氨基端和羧基端区域 ；上划线部分为脂多糖结合区域 ；
黑色阴影部分为本研究克隆的斑点叉尾鮰 BPI 氨基端活性结构域
图 5 斑点叉尾鮰与其他鱼类之间 BPI 氨基酸序列的比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期136
椎动物组（太平洋牡蛎，Pacific oyster）、鱼类组、哺
乳动物与两栖动物组。鱼类组中包括两个分支，大
分支由鲤鱼（Common carp）、斑点叉尾鮰（Channel
catfish）、虹鳟鱼同工型 1（Rainbow trout1）和虹鳟
鱼同工型 2（Rainbow trout2）组成 ；另一个小分支
由大黄鱼（Large yellow croaker）和三文鱼（Atlantic
salmon）组成，两个分支均由自引导值 100 支持。
可以发现，鱼类组中鲤鱼和斑点叉尾鮰之间显示了
更近的亲缘关系，与根据 BPI 氨基酸序列比对得到
的结果是一致的。
1 120 bp 和 830 bp 处有清晰条带，与理论相符，初
步确定为对应于两种表达载体的阳性克隆（图 7-A、
图 8-A）；进一步对阳性菌落中的重组质粒进行提纯、
用 EcoR I 和 Hind III 对两个重组质粒进行双酶切，经
1% 琼脂糖凝胶电泳后，分别在约 5 875 bp、525 bp
以 及 5 343 bp、525 bp 处 看 到 大 小 两 个 条 带（ 图
7-B、图 8-B），其中 525 bp 的小条带为目的片段。最
后，对两个阳性克隆进行 DNA 测序，结果证明目
的 片 段 BPINtd 已 正 确 连 接 到 pET-32a（+） 和 pET-
28a（+）表达载体上。
表 2 斑点叉尾鮰与其他鱼类之间 BPI 的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性
核苷酸和氨基酸序列同源性（%）
鲤鱼 虹鳟同工型 1 虹鳟同工型 2 大西洋鳕鱼
斑点叉尾鮰 88a（73）b 86a（69）b 86a（70）b 78a（59）b
鲤鱼 75a（74）b 74a（74）b 65a（61）b
虹鳟同工型 1 87a（87）b 69a（62）b
虹鳟同工型 2 70a（62）b
a. 核苷酸同源性 ；b. 氨基酸同源性
C
om
m
on
c
ar
p
Ch
an
ne
l c
atf
ish
89 Rai
nbo
w t
rou
t1
Rainbow trout
2
100
10
0
Large yellow croaker
Atlantic salmon
100
98
W
estern claw
ed frog
M
ou
se
Ra
bb
it
Hum
an
Bovine
Wild boar
100
35
71
10
0 10
0
Pacific oyster
0.1
图 6 基于斑点叉尾鮰和其他生物 BPI 氨基酸序列
的分子系统树
2.4 “pET-32a-BPINtd”和“pET-28a-BPINtd”重组
表达质粒的构建及鉴定
通过对 pSURE-BPINtd 重组质粒进行双酶切，将
获得的 BPINtd 片段分别与 pET-32a（+）和 pET-28a（+）
表达载体连接。由菌落 PCR 结果发现，分别在约
8000
bp
M 2
5000 5875
bp
525
1000
700
500
bp
M1
1120
1500
1000
500
A B
bp
M. DNA 分子量标准 ；1. 菌落 PCR 扩增产物 ；2. 双酶切产物
图 7 重组表达质粒“pET-32a-BPINtd”的菌落 PCR
检验（A）和双酶切鉴定（B）
M. DNA 分子量标准 ；1. 菌落 PCR 扩增产物 ；2. 双酶切产物
图 8 重组表达质粒“pET-28a-BPINtd”的菌落 PCR
检验（A）和双酶切鉴定（B）
8000
bp
M 2
5000 5343
bp
525
1000
700
500
B
1500
bp
M 1
830
bp
1000
500
300
A
2012年第12期 137高北等 ：斑点叉尾鮰 BPI 抗菌肽的 cDNA 克隆及原核表达载体的构建
3 讨论
BPI 一级结构中带电残基不对称分布，氨基端
结构域碱性氨基酸残基多于酸性氨基酸残基，而羧
基端则相反，两者由一亲水、富含脯氨酸的连接肽
连接。这种电荷的不对称分布有利于促进带正电荷
的氨基端结构域与革兰氏阴性细菌细胞膜上带负电
荷的脂多糖（LPS）之间的结合，进而阻碍了 LPS
与外膜 Mg2+ 的结合而干扰了其分子排列规律，最终
引起细菌膜通透性的改变，从而杀死细菌［14］。晶
体结构显示 BPI 氨基端区域包含一个由两个 α-螺
旋和高度扭曲反向平行的 β-片层组成的桶状结构以
及一个非极性的脂质结合袋，结合袋的疏水性侧链
可与 LPS 的脂质酰基链形成广泛的范德华作用［13］。
Gazzano-Santoro 等［12］对编码人类 BPI 氨基端结构域
的 1-199 个氨基酸的多肽进行 DNA 重组表达，证
明该重组多肽具有与 BPI 全长蛋白相同的杀灭 E.coli
J5 菌株的能力，并可以广泛地结合 LPS。本研究参
考上述 Gazzano-Santoro 等［12］的研究结果，对斑点
叉尾鮰 BPI 蛋白氨基端结构域中包括脂多糖结合
位点的由 175 个氨基酸残基组成的活性区域进行了
cDNA 克隆。鉴于迄今为止利用基因工程技术制备
鱼类 BPI 蛋白方面的研究报道甚少，本研究在上述
cDNA 克隆的基础上，选择原核表达质粒“pET-32a
（+）”和“pET-28a（+）”初步构建了重组表达质粒。
两种载体均有 His-Tag 标签，可用于 BPI 蛋白的检
测和纯化。pET-32a（+）质粒带有高溶解性的硫氧
还蛋白“TrxA”编码序列和肠激酶识别位点，可与
目的基因一起表达融合蛋白“TrxA-BPINtd”而增加
产物的溶解性，但 TrxA 融合头的存在一般会影响产
物的表达后折叠，进而影响其生物学功能［15］，必须
通过肠激酶将其切除以得到有活性的目的蛋白。而
pET-28a（+）质粒不含融合头， 无需后续的切除工作，
但表达的目的蛋白可能主要以包涵体形式存在而影
响其活性。鉴于上述两种原核表达质粒的不同特
点，本研究同时构建了两个重组表达质粒“pET-32a-
BPINtd”和“pET-28a-BPINtd”， 并成功转化至工程菌E.coli
BL21（DE3），DNA 测序结果证明无任何 DNA 变异
发生。进一步的试验将聚焦于在 E.coli BL21（DE3）
中的表达条件筛选，以期获得具有抗菌活性的目的
蛋白。
4 结论
本研究通过 RT-PCR 和巢式 PCR 从斑点叉尾鮰
鳃中克隆到编码 BPI 氨基端活性结构域的 cDNA 片
段“BPINtd”，该片段编码的多肽由 175 个氨基酸残
基组成，其中 63 个氨基酸残基组成的肽段在空间结
构上可形成一个非极性的脂质结合袋，与革兰氏阴
性菌外膜上脂多糖（LPS）结合。选择具有不同表达
特点的 pET-32a（+）和 pET-28a（+）作为原核表达
质粒，将“BPINtd”片段分别插入两种质粒，通过菌
落 PCR、EcoR I 和 Hind III 双酶切反应以及 DNA 测
序，证明重组表达质粒“pET-32a-BPINtd”和“pET-
28a-BPINtd” 已 被 成 功 构 建， 转 化 至 工 程 菌 E.coli
BL21（DE3）后无任何 DNA 变异。
参 考 文 献
［1］ Bulet P, Stocklin R, Menin L. Anti-microbial peptides ：from
invertebrates to vertebrates. Immunological Reviews, 2004, 198（1）：
169-184.
［2］ Levy O, Sisson RB, Kenyon J, et al. Enhancement of neonatal innate
defense ：effects of adding an N-terminal recombinant fragment of
bactericidal/permeability-increasing protein on growth and tumor
necrosis factor-inducing activity of gram-negative bacteria tested in
neonatal cord blood ex vivo. Infection and Immunity, 2000, 68（9）：
5120-5125.
［3］ Weiss J, Elsbach P, Olsson I, et al. Purification and characterization of
a potent bactericidal and membrane active protein from the granules
of human polymorphonuclear leukocytes. The Journal of Biological
Chemistry, 1978, 253（8）：2664-2672.
［4］ Schultz H, Weiss JP. The bactericidal/permeability-increasing protein
（BPI）in infection and inflammatory disease. Clinica Chimica Acta；
International Journal of Clinical Chemistry, 2007, 384（1-2）：12-
23.
［5］ Stenvik J, Solstad T, Strand C, et al. Cloning and analyses of a BPI/
LBP cDNA of the Atlantic cod（Gadus morhua L.）. Developmental
& Comparative Immunology, 2004, 28（4）：307-323.
［6］ Inagawa H, Honda T, Kohchi C, et al. Cloning and characterization
of the homolog of mammalian lipopolysaccharide-binding protein
and bactericidal permeability-increasing protein in rainbow trout
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期138
Oncorhynchus mykiss. The Journal of Immunology, 2002, 168（11）：
5638-5644.
［7］ Huang Y, Lou H, Wu X, et al. Characterization of the BPI-like gene
from a subtracted cDNA library of large yellow croaker（Pseudoscia-
ena crocea）and induced expression by formalin-inactivated Vibrio
alginolyticus and Nocardia seriolae vaccine challenges. Fish &
Shellfish Immunology, 2008, 25（6）：740-750.
［8］ Kono T. Molecular cloning of a novel bactericidal permeability-inc-
reasing protein/lipopolysaccharide-binding protein（BPI/LBP）from
common carp Cyprinus carpio L. and its expression. Molecular Immu-
nology, 2003, 40（5）：269-278.
［9］ Nam BH, Ahn KJ, Kim YO, et al. Molecular cloning and characteriza-
tion of LPS-binding protein/bactericidal permeability-increasing pro-
tein（LBP/BPI）from olive flounder, Paralichthys olivaceus. Veter-
inary Immunology and Immunopathology, 2010, 133（2-4）：256-
263.
［10］ Xu P, Bao B, He Q, et al. Characterization and expression analysis
of bactericidal permeability-increasing protein（BPI）antimicrobial
peptide gene from channel catfish Ictalurus punctatus. Developme-
ntal and Comparative Immunology, 2005, 29（10）：865-878.
［11］ Ooi CE, Weiss J, Doerfler ME, et al. Endotoxin-neutralizing
properties of the 25 kD N-terminal fragment and a newly isolated 30
kD C-terminal fragment of the 55-60 kD bactericidal/permeability-
increasing protein of human neutrophils. Journal of Experimental
Medicine, 1991, 174（3）：649-655.
［12］ Gazzano-Santoro H, Parent JB, Grinna L, et al. High-affinity binding
of the bactericidal/permeability-increasing protein and a recombi-
nant amino-terminal fragment to the lipid A region of lipopolysa-
ccharide. Infection and Immunity, 1992, 60（11）：4754-4761.
［13］ Beamer LJ, Carroll SF, Eisenberg D. The three-dimensional stru-
cture of human bactericidal/permeability-increasing protein ：imp-
lications for understanding protein-lipopolysaccharide interactions.
Biochemical Pharmacology, 1999, 57（3）：225-229.
［14］ Bulow E, Gullberg U, Olsson I. Structural requirements for intrace-
llular processing and sorting of bactericidal/permeability-increasing
protein（BPI）：comparison with lipopolysaccharide-binding
protein. Journal of Leukocyte Biology, 2000, 68（5）：669-678.
［15］ Xu Z, Zhong Z, Huang L, et al. High-level production of bioactive
human beta-defensin-4 in Escherichia coli by soluble fusion expres-
sion. Applied Mcrobiology and Biotechnology, 2006, 72（3）：471-
479.
（责任编辑 李楠）