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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
抗菌肽是一类内源性的具有强抗菌作用的阳离
子短肽，其分子量一般为 1.5-10 kD，是生物先天免
疫功能的重要组成成分［1］，因其具有天然、无毒的
优势，有望作为绿色饲料添加剂部分替代抗生素。
收稿日期 ： 2013-08-08
基金项目 ：上海市教育委员会重点创新基金项目（11ZZ148）
作者简介 ：高北，女，硕士研究生，研究方向 ：水产生物分子生物学 ；E-mail ：wintergb@hotmail.com
通讯作者 ：陶妍，女，教授，硕士生导师，研究方向 ：水产生物分子生物学 ；E-mail ：ytao@shou.edu.cn
斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）LEAP2 成熟肽在
大肠杆菌中的融合表达
高北  陶妍
（上海海洋大学食品学院，上海 201306）
摘 要 ： 以斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肝脏为基因克隆的材料，通过 RT-PCR 对编码 LEAP2 成熟肽区域 41 个氨基酸
的 cDNA 片段（mLEAP2）进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及两栖动物等其他物种 LEAP2 成熟肽区域氨基酸序
列的比对结果，发现存在 14 个保守的氨基酸残基，其中 4 个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域，在空间上可形成
两对二硫键，推测与 LEAP2 的抗菌活性有关。进一步构建重组表达质粒 pET32a-mLEAP2，使 mLEAP2 基因与携带有 6 × His-tag
标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白 trxA 基因融合，转化至大肠杆菌 BL21（DE3）后，在 25℃下，经 0.7 mmol/L IPTG 诱导培养
16 h 后，成功表达了 trxA-mLEAP2 融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE 显示，细胞经超声破碎后，上清和沉淀中均含融合蛋白，采用固
化金属离子亲和层析（IMAC）对其进行纯化，得到了纯化的融合蛋白。
关键词 ： 斑点叉尾鮰 LEAP2 成熟肽 RT-PCR 融合表达
Fusion Expression of Channel Catfish（Ictalurus punctatus）LEAP2
Mature Peptide in Escherichia coli
Gao Bei Tao Yan
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract:  Antimicrobial peptides generally are some small molecule peptides with strong ability to fight against microbial organisms.
They play an important role in the host’s immune system and are considered to be good substitutes for traditional antibiotics. A cDNA
fragment（mLEAP2）encoding the LEAP2（liver-expressed antimicrobial peptide 2）mature peptide consisted of 41-amino-acid was cloned
from the liver of channel catfish（Ictalurus punctatus）by RT-PCR. When the amino acid sequence of channel catfish mLEAP2 was compared
with those of poikilothermal fish and other species, fourteen residues were observed at conserved positions, especially four highly conserved
cysteine residues occurred at C-terminal regions of these mLEAP2s, suggesting that two disulfide bridges resulted from these four cysteines
possibly related to antimicrobial activity of LEAP2. Subsequently, the mLEAP2 gene was fused with a trxA partner gene with a 6×His-tag and
an enterokinase site to construct the recombinant expression plasmid pET32a-mLEAP2. The fusion protein “trxA-mLEAP2” was successfully
expressed in E .coli BL21（DE3）at 25 ℃ after a 16 h induction with 0.7 mmol/L IPTG. Tricine-SDS-PAGE showed that the fusion protein
existed in both the supernatant and inclusion body after sonication and centrifugation. The purified fusion protein was successfully obtained by
immobilized metal affinity chromatography（IMAC）.
Key words:  Channel catfish LEAP2 mature peptide RT-PCR Fusion expression
此外，抗菌肽又被称为“第二防御体系”，对一般抗
生素不能起效的许多真菌、原虫、有包膜的病毒乃
至癌细胞等有抑制作用［2］。从人血液超滤产物中得
到含有 4 对和 2 对二硫键的肝脏表达的抗菌肽，分
2014年第2期 131高北等 ：斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）LEAP2 成熟肽在大肠杆菌中的融合表达
别被称为肝脏表达的抗菌肽-1（Hepcidin，LEAP1）
和抗菌肽-2（LEAP2）。关于 LEAP1 的研究已较为深
入，而关于 LEAP2 的研究报道则相对较少。鱼类中
的 LEAP2 基因首次发现于虹鳟鱼［3］（Oncorhynchus
mykiss）体内。近几年以来，其他一些鱼类的 LEAP2
基因被相继克隆，如斑点叉尾鮰（Ictalurus puncta-
tus）［4，5］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［6］、大黄鱼
（Larimichthys crocea）［7］、 草 鱼（Ctenopharyngodon
idella）［8］等。斑点叉尾鮰 LEAP2 基因含有 3 个外显
子和 2 个内含子，该基因编码的多肽由 94 个氨基酸
残基组成，自氨基端起 Pro-28 与 Ser-29 之间可产生
一个酶切位点，将 28 个氨基酸残基的信号肽与 66
个氨基酸残基组成的 LEAP2 原前体肽分开 ；原前体
肽由前体肽区域和成熟肽区域组成，经加工后释放
出具生物活性的含 41 个氨基酸残基的成熟肽［4，5］，
两对二硫键就位于该成熟肽区域内。传统的制备抗
菌肽的方法主要是从生物的组织器官中提取，但该
法存在许多问题，如提取量低、杂质种类复杂、易
失活等，严重制约了抗菌肽的开发和应用，而化学
合成法成本很高。因此，通过基因工程技术制备抗
菌肽无疑是一条良好的途径。张虹等［4］通过 RT-
PCR 对包括信号肽在内的 LEAP2 全长 cDNA 进行
了克隆并实现在 E.coli BL21（DE3）中的原核表达。
本研究以斑点叉尾鮰肝脏为材料，通过 RT-PCR 对
编码 LEAP2 成熟肽区域的 cDNA 进行克隆，并构建
重组融合表达载体对其进行原核表达，为进一步研
究 LEAP2 的抗菌活性奠定了重要基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 用于模板的斑点叉尾鮰肝脏
cDNA 为本实验室保存。用于质粒复制和 cDNA 克隆
的大肠杆菌菌株 DH5α 和用于目的蛋白表达的大肠
杆菌 BL21（DE3）购自北京天根生物科技公司 ；克
隆质粒 pSURE-T 购自北京艾得莱生物科技公司 ；表
达质粒 pET-32a（+）购自美国 Novagen 公司。
1.1.2 主要试剂及设备 RNA 提取试剂 Trizol 购自
美国 Invitrogen 公司 ；Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA
连接酶、EcoR I 和 Hind III 购自 TaKaRa 公司 ；质粒
提取试剂盒、DNA 回收试剂盒、DNA 分子量 marker
和蛋白质分子量 marker 购自北京天根生物科技公司；
IPTG 购自上海生物工程有限公司 ；LB 营养肉汤及
其他化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司，为
国产分析纯 ；引物合成及测序由上海生物工程有限
公司完成 ；蛋白纯化仪 Profinia 及其固化金属离子亲
和层析柱（IMAC）和脱盐柱购自美国 Bio-Rad 公司。
1.2 方法
1.2.1 LEAP2 成熟肽基因的 cDNA 克隆 以前期研
究中通过逆转录得到的斑点叉尾鮰肝脏 cDNA 为模
板［4］，参考 LEAP2 全长 cDNA 序列（GenBank ID ：
NM_001200205）设计含有 EcoR I 酶切位点的正向引
物 MLF（5-CGGAATTCATGACACCCCTTTGGAGAA-
TC-3）和含有 Hind Ⅲ酶切位点的反向引物 MLR（5-
CCCAAGCTTTTAGGAAATTATAGGTTGGCTAAAGG-
3），对编码斑点叉尾鮰 LEAP2 成熟肽区域的 cDNA
（mLEAP2）进行克隆（图 1）。PCR 反应体系如下 ：
2.5 μL 第一股 cDNA、各 4 μL 10 mol/L 的正向和反
向引物、1 μL Taq Plus DNA Polymerase（2.5 U/μL）、
10 μL10×Taq Plus Buffer、8 μL 2.5 mmol/L dNTP，用
无菌水将反应液调至 100 μL。PCR 反应条件如下 ：
94℃预变性 3 min，30 个循环 ：94℃变性 30 s、63℃
退火 30 s、72℃延伸 1 min，最终 72℃延伸 5 min。
PCR 产物经 DNA 纯化试剂盒纯化后获得的目的片段
“mLEAP”与 pSURE-T Simple 质粒载体按 3 ∶ 1 比例、
在 T4 DNA 连接酶作用下，16℃连接过夜 ；转化至
DH5α 感受态细胞，37℃培养过夜 ；挑选阳性克隆
进行 DNA 测序。
NH2
ؑਧ㛭 ৏ࡽփ㛭
ࡽփ㛭 ᡀ⟏㛭
MLF MLR
COOH
图 1 对 mLEAP2 基因进行 cDNA 克隆的策略图
1.2.2 LEAP2 成熟肽融合表达质粒的构建 将上
述经 DNA 测序确证的、含 pSURE-mLEAP2 重组质
粒的菌落经 37℃、220 r/min 液体培养过夜后，用
质粒小提试剂盒抽提质粒 ；对得到的重组质粒进行
EcoRI 和 Hind Ⅲ双酶切处理，反应体系和条件如下：
10 μL pSURE-mLEAP2 重组质粒、2 μL 10×M 缓冲
液、1 μL EcoRI（20 U/μL）、1 μL Hind Ⅲ（20 U/μL）、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期132
6 μL ddH2O ；37℃保温 3 h ；经 1% 琼脂糖凝胶电泳
后，切下目的片段进行 DNA 纯化。
同时，对 pET-32a（+）表达质粒进行双酶切，
反应体系如下：40 μL pET-32a（+）质粒、4 μL10×M
缓 冲 液、2 μL EcoR I（20 U/μL）、2 μL Hind Ⅲ（20
U/μL）、2 μL ddH2O ；37℃保温 4 h ；经 0.5% 琼脂糖
凝胶电泳后，切下线性质粒进行 DNA 纯化。
将上述含酶切位点的成熟肽片段 mLEAP2 与
线性 pET-32a（+）质粒按如下体系进行连接 ：1 μL
10×T4 DNA 连接酶缓冲液、1 μL 线性 pET-32a（+）
质粒、7 μL 目的片段、1 μL T4 DNA 连接酶 ；16℃
连接过夜 ；连接液转化 DH5α 感受态细胞，37℃培
养过夜 ；经 PCR 鉴定的阳性克隆进行 DNA 测序。
1.2.3 LEAP2 成熟肽在大肠杆菌中的表达及表达产
物的纯化 经测序确证的阳性菌落经液体培养后，
进行质粒提纯 ；取 1 μL pET32a-mLEAP2 重组质粒转
化 E.coli BL21（DE3），筛选阳性菌落接种于含 100
μg/mL 氨苄青霉素的 5 mL LB 培养液中，37℃、220
r/min 培养至 OD600 约为 0.8 ；以 1∶50 的比例接种
于含 100 μg/mL 氨苄青霉素的 1 000 mL LB 培养液
中，同上培养至 OD600 约为 0.6-0.8 ；然后，加入终
浓度为 0.7 mmol/L 的 IPTG，在 25℃，110 r/min 进一
步培养 16 h。培养液中均加入终浓度为 1% 的葡萄
糖以减少目的蛋白的本底表达水平。通过低温离心
（8 000 r/min、4℃、10 min）收集菌体，用预冷的
PBS（140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L
Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，pH7.3）重悬菌体，对
菌体进行超声破碎后，再低温离心（12 000 r/min、
4℃、10 min）收集上清和沉淀，分别进行 Tricine-
SDS-PAGE 电泳分析，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度
10%，含 0.1% SDS 和 0.1 mol/L Tricine。电泳结束后
用 0.1% 的考马斯亮蓝 R-250 对凝胶进行染色，用
25% 的甲醇和 7% 的醋酸混合液脱色。
先 使 用 Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges
对上清进行固化金属离子亲和层析（IMAC），然后
通过 Bio-Scale Mini Bio-Gel P-6 Desalting Cartridges 进
行脱盐，得到纯化的融合蛋白 trxA-mLEAP2，对其
进行 Tricine-SDS-PAGE 分析。
1.2.4 基于 LEAP2 氨基酸序列的分子系统树构建
分子系统树采用 MEGA5.05 邻位相联法（Neighbor-
Joinging）构建，各结点的置信度由自引导值估计，
重复次数为 1 000。用于构建分子系统树的 LEAP2
全长氨基酸序列来自于 NCBI 网站，它们的序列号
分别为 ：斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus，ID ：NM_
001200205）、 长 鳍 叉 尾鮰（Ictalurus furcatus，ID ：
AAX45792）、黄颡鱼（Tachysurus fulvidraco，ID：AC-
T33044）、虹鳟鱼同工型 A（Oncorhynchus mykiss A，
ID ：AAR11766）、 虹 鳟 鱼 同 工 型 B（Oncorhynchus
mykiss B，ID ：AAR11767）、牙鲆（Paralichthys oliv-
aceus，ID ：ACB97648）、人（Homo sapiens，ID ：NP_
443203）、 家 鼠（Mus musculus，ID ：NP_694709）、
东 非 狒 狒（Papio anubis，ID ：NM_001168764）、 热
带爪蟾（Xenopus laevis，ID ：NM_001112914）、挪威
大 鼠（Rattus norvegicus，ID ：NM_001126081）、 原
鸡（Gallus gallus，ID ：NM_001001606）。
2 结果
2.1 斑点叉尾鮰成熟肽基因的cDNA序列及推断的
氨基酸序列
以斑点叉尾鮰肝脏的第一股 cDNA 为模板、以
MLF 和 MLR 为引物，扩增得到一个 126 bp 的片段
（图 2）。测序结果（图 3）表明该片段的两端分别引
入了 EcoR I 和 Hind Ⅲ两个酶切位点 ；除去酶切位
点后，该片段编码了一段由 41 个氨基酸残基组成的
LEAP2 成熟肽部分，4 个保守的半胱氨酸残基位于
该区域内。
1500
bp
M 1
126
bp
500
300
200
100
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：PCR 产物
图 2 编码 mLEAP2 的 cDNA 片段的 PCR 扩增
1
1
71
22
70
21
38
1
* 表示终止密码子 ；下划线表示 EcoR I 和 Hind III 酶切位点 ；
▲表示半胱氨酸残基
图 3 mLEAP2 的核苷酸及推断的氨基酸序列
2014年第2期 133高北等 ：斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）LEAP2 成熟肽在大肠杆菌中的融合表达
2.2 斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽一级结构的氨基酸
序列分析及与其他生物的比较
采用 Clustal W 软件对斑点叉尾鮰 LEAP2 成熟
肽与其他鱼类、哺乳动物和两栖动物等的 LEAP2 成
熟肽一级结构进行分析和比对，结果（图 4）显示，
不同来源成熟肽的氨基酸序列显示了 14 个保守的
氨基酸残基（灰色阴影和黑色方框），其中包括与
LEAP2 抗菌活性有关的 4 个高度保守的半胱氨酸残
基（黑色方框）。斑点叉尾鮰 mLEAP2 与长鳍叉尾
鮰之间显示了最高的序列同源性，为 100% ；与黄
颡鱼之间的同源性略低，为 98% ；与斑马鱼、虹鳟
2 个同工型以及牙鲆之间的同源性为 63%-85%。斑
点叉尾鮰与哺乳动物之间显示了低的氨基酸序列同
源性。
Ictalurus punctatus
Ictalurus furcatus
Tachysurus fulvidraco
Danio rerio
Oncorhynchus mykiss A
Oncorhynchus mykiss B
Paralichthys olivaceus
Sus scrofa
Homo sapiens
Bos taurus
Rattus norvegicus
Papio anubis
Xenopus laevis
Gallus gallus
Oryctolagus cuniculus
41
41
41
41
41
41
46
40
40
40
40
40
40
40
40
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
黑色方框表示保守的 4 个半胱氨酸残基，灰色阴影表示其他保守的氨基酸残基
图 4 斑点叉尾鮰与其他生物之间 mLEAP 的氨基酸序列比对
2.3 基于LEAP2氨基酸序列的分子系统树分析
由图 5 可见，分子系统树分为两大组，一组是
鱼类，另一组是其他物种。鱼类组中斑点叉尾鮰与
长鳍叉尾鮰显示了最近的亲缘关系，它们一起形成
了由自引导值 91 支持的一个小分支。系统树分析结
果与 mLEAP2 氨基酸序列比对的结果是一致的。
Ictalurus punctatus
Ictalurus furcatus
Tachysurus fulvidraco
Oncorhynchus mykiss A
Paralichthys olivaceus
Oncorhynchus mykiss B
Xenopus laevis
Gallus gallus
Rattus norvegicus
Homo sapiens
Papio anubis100
97
93
100
79
83
100
91
0.1
图 5 基于 N-J 法构建的 mLEAP2 分子系统树
2.4 重组融合表达质粒的构建与鉴定
重组融合表达质粒 pET32a-mLEAP2 的构建如图
6 所示。通过菌落 PCR 鉴定，发现在近 800-900 bp
处有清晰条带（图 7），与理论相符，初步确定为阳
性菌落，经 DNA 测序证明目的片段 mLEAP2 已正确
连接到 pET-32a（+）表达载体上，并且核苷酸序列
未发生任何碱基突变。
2.5 mLEAP2在E.coli BL21（DE3）中的融合表达
及纯化
重 组 融 合 表 达 质 粒 pET32a-mLEAP2 转 化 至
E.coli BL21（DE3）后，经 IPTG 诱导培养 16 h 后，
对菌体总蛋白和经超声破碎后的细胞上清及沉淀进
行 Tricine-SDS-PAGE 分析。由图 8 可见，与各种对
照（泳道 1、3、4）相比，含 pET32a-mLEAP2 的诱
导菌的总蛋白（泳道 2）在近 26 kD 处有明显的条
带，与 trxA-mLEAP2 融合蛋白的理论分子量相符 ；
此外，该菌体细胞经超声破碎离心后得到的上清（泳
道 5）及沉淀（泳道 6）中都显示了目的条带，表明
trxA-mLEAP2 融合蛋白除了以可溶性的形式表达之
外，还存在于包涵体中。
对超声破碎后的上清先进行固化金属离子亲
和 层 析（IMAC）， 然 后 通 过 Bio-Scale Mini Bio-Gel
P-6 Desalting Cartridges 进行脱盐，得到纯化的 trxA-
mLEAP2 融合蛋白，其 Tricine-SDS-PAGE 分析结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期134
如图 9 所示，在近 26 kD 处有清晰的条带。
3 讨论
哺乳动物的 mLEAP2 第 29-32 位有一个碱性氨
基酸簇“-RKRR-”，第 19-22 位有一个酸性氨基酸
簇“-DDSE-”，这两段保守的氨基酸簇被推测有助
于 LEAP2 分子间的相互作用以及与细菌细胞膜的作
用［11］。而斑点叉尾鮰和一些其他鱼类在这两个相应
的位置所对应的序列是“-RKGH-”和“-NNYE-”，
关于鱼类 LEAP2 抑菌机理的研究报道甚少。虽然
来自不同生物的 LEAP2 氨基酸序列之间存在差异，
但在它们羧基端区域均存在 4 个高度保守的半胱氨
酸残基，证明在空间结构上由此形成的二硫键与
LEAP2 的抗菌活性有关［9］。
通常稀有密码子会影响目的基因在原核系统中
的表达。当同一种氨基酸可由多个密码子编码时，
大肠杆菌总是频繁使用某一个或几个密码子而几乎
不使用其他的密码子，后者对于大肠杆菌来说就是
稀有密码子。本文表达的 LEAP2 成熟肽氨基酸对
应的 41 个密码子中含有 10 个稀有密码子，并且第
25-27 位密码子为 3 个连续的稀有密码子“ACG、
GGA、AUA”，理论上可能会影响 LEAP2 的表达产量。
由于未作密码子优化的对比试验，具体结论还有待
验证。
本研究选择 pET-32a（+）作为原核表达载体，
该载体使目的基因的转录和翻译处于 T7 噬菌体信号
控制之下，只有加入 IPTG 诱导剂后才能产生大量
Hind III EcoR I
f1 origin
enterokinase
pET-32a+
5 900 bp
Amp
ori
lac 1
His-Tag
trxA
Amp
f1 origin
Hind III mL EAP2 EcoR I
His-Tag
trxA
enterokinase
pET32a-mLEAP2
6 013 bp
ori
lacI
图 6 pET32a-mLEAP2 重组融合表达质粒的构建示意图
1500
bp bp
M 1
868
500
300
200
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：菌落 PCR 扩增的产物
图 7 重组表达质粒的菌落 PCR 检验
94.0
1 2 3 4 M kD M 5 6
trxA-mLEAP2
66.2
45.0
33.0
26.0
20.0
14.4
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：含空质粒经诱导的细胞总蛋白 ；2 ：含重组质粒
经诱导的细胞总蛋白 ；3 ：含空质粒未经诱导的细胞总蛋白 ；4 ：含重组质
粒未经诱导的细胞总蛋白 ；5 ：含重组质粒经诱导的细胞经超声破碎后的上
清 ；6 ：含重组质粒经诱导的细胞经超声破碎后的沉淀
图 8 在 E.coli BL21（DE3）中表达的融合蛋白的 Tricine-
SDS-PAGE 分析
94.0
kD
M 1
55.2
45.0
33.0
25.0
20.0
14.4
trxA-mLEAP2
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：纯化的融合蛋白
图 9 纯化的融合蛋白的 Tricine-SDS-PAGE 分析
2014年第2期 135高北等 ：斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）LEAP2 成熟肽在大肠杆菌中的融合表达
T7RNA 聚合酶，从而使外源目的蛋白得以表达，因
此，在加入诱导剂之前可以保证工程菌生长良好，
有效防止了工程菌的自杀行为。pET-32a（+）携带
有助于提高溶解性的硫氧还蛋白“trxA”编码序列，
与目的蛋白基因形成融合基因，进而表达融合蛋白；
另一方面，为提高表达产物的可溶性，选择了较低
的表达温度 25℃，结果表明确实获得了一定量的可
溶性目的蛋白。但抑菌试验结果表明纯化的融合蛋
白未显示明显的抑菌活性，其原因可能与 trxA 融合
头的存在有关，因其影响了产物的折叠，进而影响
了生物学功能［9］。trxA 融合头的羧基端含有肠激酶
识别位点，可望通过融合头的切除，获得具生物学
活性的 LEAP2 成熟肽。该项工作目前正在进行中。
4 结论
从斑点叉尾鮰肝脏中克隆到编码 LEAP2 成熟肽
的基因 mleap2，该基因编码的成熟肽由 41 个氨基酸
残基组成 ；4 个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟
肽的羧基端区域。以 pET-32a（+）为表达质粒，成
功构建融合表达质粒 pET32a-mLEAP2，转化至工程
菌 E.coli BL21（DE3）后，在 25℃下，经 0.7 mmol/L
IPTG 诱导培养 16 h 后，成功表达了“trxA-mLEAP2”
融合蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）