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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是在 1966 年被
发现的一类高度保守的细胞因子［1，2］。MIF 主要由
T 细胞产生，负责机体在环境协迫和炎症反应中进
行免疫应答反应［3，4］。最近 MIF 被证实在免疫刺激、
收稿日期 ： 2014-03-21
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（30972246）
作者简介 ：高磊，男，博士，助理研究员，研究方向 ：水产动物分子遗传学 ；E-mail ：seamas_gao@163.com
通讯作者 ：赫崇波，博士，研究员，研究方向 ：海洋动物分子遗传学 ；E-mail ：chongbohe@163.com
斑点叉尾鮰巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因多态性
及表达分析
高磊1  杜小溪2  李乐2  高祥刚1  鲍相渤1  赫崇波1
（1. 辽宁省海洋水产科学研究院 辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，大连 116023 ；
2. 辽宁师范大学生命科学学院，大连 116029）
摘 要 ： 巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一类主要由 T 细胞产生、负责机体在环境协迫和炎症反应中进行免疫应答的细
胞因子。根据斑点叉尾鮰 MIF 基因 EST 序列，应用 RACE 技术克隆了 MIF 3 UTR 和 5 UTR 序列，利用 Genome Walking 技术克隆
了 MIF 启动子序列，通过特异 PCR 克隆 MIF 内含子序列，并对多个体 MIF 基因组序列进行多态性分析，利用荧光定量 PCR 研究
MIF 的组织分布。结果显示，斑点叉尾鮰 MIF 基因组序列共 3 918 bp，其中编码区 348 bp，编码 115 个氨基酸，5UTR 为 70 bp，3UTR
为 434 bp，启动子为 1 382 bp，共有 2 个内含子，分别为 243 bp 和 1 441 bp。MIF 基因组序列中包含 4 个重复单元序列和 60 个多
态性位点，其中共有 6 个 SNP 位于转录因子结合位点上。斑点叉尾鮰 MIF mRNA 在肠中表达量最高，肌肉中表达量最低。
关键词 ： 斑点叉尾鮰 巨噬细胞移动抑制因子（MIF） 基因组序列 多态性 组织表达
Polymorphisms and Expression of Macrophage Migration Inhibitory
Factor Gene from Channel Catfish，Ictalurus punctatus
Gao Lei1 Du Xiaoxi2 Li Le2 Gao Xianggang1 Bao Xiangbo1 He Chongbo1
（1. Key Laboratory of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province，Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Dalian
116023 ；2. College of Life Sciences，Liaoning Normal University，Dalian 116029）
Abstract: Macrophage migration inhibitory factor（MIF）was considered as a unique cytokine produced by T-cell and involved in
immune response to inflammation and stress. In this study, the genomic sequence of MIF was identified, and the polymorphisms and expression
level were studied in channel catfish Ictalurus punctatus. The genomic sequence of MIF was identified to be 3 918 bp, consisting of a 70 bp
5-untranslated region（UTR）, a 160 bp 3-UTR, a 348 bp open reading frame（ORF）, two introns as 243 and 1 441 bp, and a 1382 bp
promoter. Four repetitive sequences were found in promoter and introns. Sixty sites of single nucleotide polymorphisms（SNPs）were identified
in MIF genomic sequence, among which 6 sites were found to locate in the binding sites for transcription factor. MIF was found to be most
abundantly expressed in intestine, and weaker in other tissues. These results could give more information and greater understanding of the degree
of MIF genetic variation.
Key words: Channel catfish Ictalurus punctatus macrophage migration inhibitory factor Genomic sequence Promoter polymorphism
Tissue expression
组织损伤以及细胞应激等过程中具有特异目的细胞
的多效性，同时在内皮细胞、脑垂体细胞和特殊上
皮细胞等非免疫细胞中分泌［5，6］。MIF 不仅在急性
和慢性炎症、自身免疫性疾病、细胞增殖和肿瘤血
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期216
管形成过程中具有重要的调节作用，同时在生命周
期调节、胚胎形成和发育以及神经发育等过程中发
挥重要功能［6-9］。
目前，关于 MIF 基因的研究主要集中在基因克
隆和多态性分析中。除人、鼠和斑马鱼等主要模式
生物外，MIF 已在多种鱼类中有序列报道，如大黄鱼、
鲈鱼、绿河鲀和红鳍东方鲀等［10-16］。MIF 的基因多
态性以及启动子多态与疾病抗性的关联在人类中已
有较多报道。王春平等［17］发现 MIF 基因启动子区
-794 CATT 微卫星多态性与广东汉族人群子宫内膜
异位症的遗传易感性相关，CATT（5/5）基因型及
CATT（5）等位基因型为其易感基因型。李艳林等［18］
认为 MIF -794 CATT 重复序列数为 7/7 和 7/8 可能与
结核易感性相关。然而，MIF 的基因多态性在鱼类
中还鲜有报道。
斑 点 叉 尾鮰（Ictalurus punctatus）， 亦 称 沟 鲶，
属于鲶形目，鮰科，是美国主要的淡水养殖种类之
一，1984 年引入我国进行驯化，于 1989 年繁育成功，
目前已在我国 30 个省（区、市）开展了规模养殖，
出口总量也不断增大［19］。本研究利用已报道的斑点
叉尾鮰外显子序列，对启动子、内含子和 3、5UTR
序列进行克隆、测序，并通过多个体序列对多态性
进行分析，利用荧光定量 PCR 研究 MIF 的组织分布，
旨在为进一步研究启动子多态性与疾病的关联提供
线索。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用斑点叉尾鮰采自湖北省嘉鱼某养殖场，
暂养 1 周后选取 30 尾活体解剖，将肠、头肾、脾、
肌、肝、鳃和脑组织用 RNA Locker 固定后带回实验
室于 -80℃保存。使用 RNAprep pure Tissue Kit（北
京天根）提取总 RNA，利用核酸分析仪检测 RNA
浓度与质量。取 30 尾斑点叉尾鮰肌肉组织 50-100
mg，按照常规酚 -氯仿方法抽提基因组 DNA。
1.2 方法
1.2.1 斑点叉尾鮰 MIF 基因克隆 根据斑点叉尾
鮰 MIF 基因已知的外显子序列（GenBank 登录号 ：
DQ639947）， 利 用 Primer Premier 5 软 件 设 计 引 物
3-OF、3-IF 和 5F（ 表 1）， 利 用 3-Full RACE Core
Set（TaKaRa）和 BD SMARTTM RACE cDNA Amplific-
ation Kit（Clontech）进行 3 和 5UTR 的扩增。设计
巢式 PCR 引物 GWR1、GWR2 和 GWR3，以基因组
DNA 为模板，按 Genome Walking Kit（TaKaRa）说
明步骤进行 PCR 扩增。为了获取斑点叉尾鮰的内含
子序列，参考近缘物种 MIF 外显子和内含子的结构
特征，研究设计了 2 对引物，PCR 反应条件 ：94℃
5 min ；94℃ 30 s，退火 30 s，72℃ 1 min，共 35 个
循环 ；72℃保温 10 min。所得 PCR 产物经纯化后
连 接 到 pMD19-T 载 体 上（TaKaRa）， 转 化 感 受 态
DH5α，PCR 检测阳性克隆后由 TaKaRa 公司进行双
向测序。
表 1 PCR 扩增引物序列
引物 序列（5-3） 用途
3-OF CAAACTGCTCATGGGTGTGCT 3RACE
3-IF CCTGGAACAACTCCACCTTT
5F TGGAGGGAGCAGAGGGCACA 5RACE
qMIFF GAAATTACCCAGGAGCTTGCTAAAG 荧光定量
IP-MIF
qMIFR AAATGCCCAGGTGTTTATGAAGC
q-18SF GAGAAACGGCTACCACATCC 荧光定量
18S rRNA
q-18SR GATACGCTCATTCCGATTACAG
IntronF1 CTGTCTGAAATTACCCAGGAG 内含子
IntronR1 ATGCCCAGGTGTTTATGAAGC
IntronF2 ATCGGAGGCTCGCAGAA
IntronR2 CCAAAGGTGGAGTTGTTCC
PolymF TTATGGTCCCCTTCTCAACTC 多态性分析
PolymR TTTGTAAATCAAGCCTTCG
GWR1 CCGTACAACTGAGAAAAACGGATGTG 基因组步移
GWR2 CCTGGGTAATTTCAGACAGTAATCCTGC
GWR3 CGAGCTCCAACTCACATTGGCT
1.2.2 斑点叉尾鮰 MIF 基因多态性分析 根据获
得 的 MIF 基 因 组 序 列 设 计 特 异 性 引 物 PolymF 和
PolymR（表 1），以 30 尾斑点叉尾鮰基因组 DNA 为
模板，扩增包括完整启动子、外显子和内含子的
DNA 片段，对 MIF 基因进行多态性分析。PCR 体系
为 25 μL，包括 2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL dNTP
（2.5 mmol/L），正反引物（10 μmol/L）各 1.0 μL，模
板 1 μL，0.4 μL Pfu DNA polymerase（2.5 U/μL， 北
京天根）和 17.1 μL 灭菌水。PCR 反应条件 ：94℃ 5
2014年第10期 217高磊等：斑点叉尾鮰巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因多态性及表达分析
min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 35 个循环；
72℃10 min。PCR 产物送 TaKaRa 公司直接进行双向
测序。
1.2.3 MIF 组织特异性表达 利用荧光定量 PCR 技
术分析 30 尾 1 龄斑点叉尾鮰中 MIF 在肠、头肾、脾、
肌、肝、鳃和脑 7 种组织中的分布。使用 PrimeScr-
iptTM RT reagent Kit（TaKaRa）合成 cDNA，以此为模
板使用 SYBR® Premix DimerEraserTM（TaKaRa）进行
Realtime PCR。PCR 体系为 20 μL，其中包括 2×SY-
BR® Premix DimerEraser 10 μL，ROX II 0.4 μL，引物
（表 1）各 0.6 μL，模板 2 μL 和灭菌水 6.4 μL。反应
程序为 ：第 1 步 95℃ 30 s ；第 2 步 95℃ 5 s，59℃
20 s，72℃ 20 s，共 40 个循环 ；反应结束后进行溶
解曲线分析。对于任意一个样品，目标基因（MIF）
和 内 参 基 因（18S rRNA，GenBank ID ：AF021880）
扩增时加入等量模板，计算△ CT 值后进行 2- △△ CT
计算［20］。
1.2.4 统 计 分 析 利 用 MEGA5.1 和 BioEdit7.0 软
件进行多态性位点的统计确认。通过 TFSEARCH
程 序（http ：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.
html） 进 行 转 录 因 子 结 合 位 点 的 预 测。 利 用
RepeatMasker 程序（http ：//www.repeatmasker.org/cgi-
bin/WEBRepeatMasker）进行重复序列的统计和分析。
采用 SPSS 13.0 软件对数据进行统计分析，统
计数据以平均数 ± 标准差表示。组间差异采用单
因素方差（one way ANOVA）分析，两组比较采用
Student t-test 进行分析，P<0.05 代表差异显著。
2 结果
2.1 斑点叉尾鮰MIF基因组序列特征
根据斑点叉尾鮰 MIF 基因外显子序列设计特异
性引物获得其基因组序列，共包含 3 918 bp，其中
编码区为 348 bp，编码 115 个氨基酸，5UTR 为 70
bp，3UTR 为 434 bp（图 1）。MIF 基因组序列共有
2 个内含子，分别为 243 bp 和 1 441 bp，所有外显子 -
内含子边界符合 GT-AG 规则（图 2）。试验扩增出
启动子为 1 382 bp，经过序列分析发现一个 CAAT-
box。
序列分析发现斑点叉尾鮰 MIF 基因组序列中包
含 4 个重复单元序列，其中一个位于启动子，3 个
位于内含子，具体情况见表 2。
1 441 bp
*
243 bp
173 bp 67 bp 434 bp108 bp70 bp
1 382 bp
ATG
GT AG GT AG
5＇UTR 3＇UTR
图 2 斑点叉尾鮰MIF 基因组结构示意图
表 2 斑点叉尾鮰MIF 基因组序列重复单元
得分 变化（%） 缺失（%） 插入（%） 开始 结束 重复单元 家族
15 20.6 0 2.4 -509 -465 （TTTA）n Simple_repeat
79 8.0 0 0 148 253 （GTGT）n Simple_repeat
14 9.1 0 0 529 552 （GCAC）n Simple_repeat
1005 15.5 0 8.7 555 766 DNA-1-11_DR DNA
2.2 斑点叉尾鮰MIF基因组多态性分析
斑点叉尾鮰 MIF 基因组序列共包含 60 个多态
性位点，其中 29 个位于启动子，1 个位于 5 UTR，
7 个位于 3 UTR，1 个位于外显子，22 个位于内含
子。60 个 SNP 中转换占 55%，包括 A/G 14 个，T/C
19 个 ；颠换占 45%，包括 A/T 9 个，A/C 6 个，T/G
4 个，C/G 8 个（表 3）。其中外显子上为 G-C 同义突
变（Val-Val）。
2.3 转录因子结合位点多态性分析
试验发现共 6 个 SNP 位于转录因子结合位点上
（score>90），具体情况见图 3。在 -761 和 -758 位点，
于 A-A 单体型中发现 Pbx-1 和 SRY 两个转录因子结
合位点，在 T-A 单体型中发现 SRY 转录因子结合
位点，在 A-T 单体型中发现 CdxA 转录因子结合位
点。在 -723 位点，于 T 等位基因上发现 HSF2 转录
因子结合位点。在 -278 位点，于 T 等位基因上发现
CdxA 转录因子结合位点。在 -249 和 -246 位点，于 A-T
单体型中发现 CdxA 转录因子结合位点。
2.4 斑点叉尾鮰MIF基因在不同组织中的表达分析
利用实时荧光定量 PCR 检测 MIF mRNA 在健康
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期218 145213921332127212121152109210329729128527927326726125524924323723122521921327212
49
109
169
229
289
349
409
469
529
589
649
709
769
829
889
949
1009
1069
1129
1189
1249
1309
1369
1429
1489
1549
1609
1669
1729
1789
1849
1969
2029
2089
2149
2209
2269
2329
2389
2449
大写字母表示基因编码区序列和 5UTR、3UTR，小写字母表示启动子和内含子序列 ；下划线表示起始密码子 ATG 和终止密码
子 TAA，方框内表示末端加尾信号 AATAAA 和 polyA 尾巴 ；阴影表示转录因子结合位点。
图 1 斑点叉尾鮰MIF 基因组序列
2014年第10期 219高磊等：斑点叉尾鮰巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因多态性及表达分析
表 3 斑点叉尾鮰MIF 基因组序列多态性
序号 位置 核苷酸 等位基因数（n=30） 序号 位置 核苷酸 等位基因数（n=30）
1 -1983
T 16
31 18
G 23
C 14 C 7
2 -1003
T 11
32 147
T 14
C 19 C 16
3 -965
T 5
33 170
G 11
C 25 C 19
4 -925
A 9
34 172
G 17
G 21 C 13
5 -885
A 22
35 275
A 6
C 8 T 24
6 -870
G 19
36 295
G 21
C 11 C 9
7 -761
A 6
37 298
A 18
T 24 G 12
8 -758
A 7
38 1095
T 10
T 23 C 20
9 -723
T 15
39 1388
T 13
C 15 C 17
10 -716
T 14
40 1416
T 7
C 16 C 23
11 -665
T 19
41 1417
A 16
C 11 G 14
12 -622
T 20
42 1472
A 18
C 10 G 12
13 -609
A 26
43 1497
G 23
G 4 T 7
14 -539
A 23
44 1519
A 9
C 7 G 21
15 -463
A 17
45 1582
G 25
C 13 T 5
16 -392
A 18
46 1600
T 22
C 12 C 8
17 -377
A 5
47 1611
A 17
T 25 G 13
18 -296
A 25
48 1671
A 15
C 5 G 15
19 -295
A 21
49 1786
A 18
T 9 G 12
20 -293
T 27
50 1826
G 9
C 3 C 21
21 -292
T 16
51 1843
A 23
C 14 G 7
22 -278
T 17
52 1879
G 14
C 13 C 16
23 -264
A 10
53 1921
A 18
G 20 G 12
24 -258
A 17
54 2191
G 21
G 13 T 9
25 -249
A 19
55 2209
G 8
C 11 T 22
26 -246
T 14
56 2241
A 3
C 16 T 27
27 -196
G 18
57 2257
A 26
C 12 T 4
28 -108
A 9
58 2274
T 15
G 21 C 15
29 -106
T 15
59 2277
A 12
C 15 T 18
30 -35 T 17 60 2324 A 11
C 13 T 19
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期220
斑点叉尾鮰肠、头肾、脾、肌、肝、鳃和脑 7 种正
常组织中的表达情况，结果显示 MIF mRNA 在 7 种
组织中均可见不同丰度的表达。以相应组织中 18S
rRNA 基因标准化后的表达量为内参，比较发现，
MIF 基因在肠中表达量最高，肌肉中表达量最低，脾、
鳃的表达量明显高于头肾、肝和脑（图 4）。
达量最低。
本 研 究 利 用 特 异 PCR 方 法 获 得 的 斑 点 叉 尾
鮰 MIF 基因组序列共包含 3 个外显子与 2 个内含
子，内含子的两侧都具有正确的 RNA 剪接识别位点
（GT/AG），符合外显子和内含子连接区域的 GT-AG
剪切原则。斑点叉尾鮰 MIF 基因结构与其它已报道
的硬骨鱼基本相同，但其内含子序列及长度变化较
大。MIF 内含子 2 的序列长度为 1 441 bp，明显长
于大黄鱼的 112 bp 和绿河鲀的 84 bp［13，15］。斑点叉
尾鮰的内含子序列长度变化较大是因为内含子承担
的进化压力小，故序列相似度较低，虽然在某些特
定情况下能够反应不同物种间的亲缘关系，但内含
子的长度和数量是可变的，同源性明显低于外显子。
研究还发现斑点叉尾鮰 MIF 缺少信号肽和 N-或O-糖
基化位点，这个发现与其它物种 MIF 序列相似，说
明鱼类与哺乳动物相似，MIF 分子在表达后先在细
胞内部进行储存，再通过非常规蛋白分泌途径由细
胞进行释放［23］。
在人类和其它高等动物中，MIF 基因组多态性
的研究已十分广泛。本研究通过 PCR 产物直接测序
的方法对斑点叉尾鮰基因组序列多态性进行了分析，
在发现的 60 个多态性位点中共有 6 个 SNP 位于转
录因子结合位点上，不仅证明了 MIF 基因的多态性
水平较高，同时预示着序列多态性对基因表达起到
重要的调节作用，这与前人的研究结果基本一致。
目前已发现的人类 MIF 基因 4 个主要多态性位点依
次是：-173 nt（G/C），+254 nt（T/C），+656 nt（C/G）
和 -794 nt（CATT 重复）［24］。Donn［25］于 2001 年首
次报道了 MIF-173 位点多态性与青少年先天性关节
-761 A
-758 A
-761 T
-758 A
-761 A
Pbx-1
SRY
SRY
CdxA
HSF2
CdxA
CdxA 90.0
score
score
92.1
score
91.0
score
92.3
score
score
90.9
95.1
90.9
-758 T
-723 T
-278 T
-249 A
-246 T
阴影表示多态性位点 ；箭头表示转录因子结合位点的位置和方向 ；右侧是对应的转录因子结合位点和得分
图 3 不同等位基因和单体型所形成的转录因子结合位点
0 㛐 ཤ㛮 㝮 㚼㓴㓷 㛍 勳 㝁cbccc b
a
0.2
0.4M
IF
⴨ሩ㺘䗮䟿 0.60.81.01.21.4
不同字母表示各组织间的表达量存在显著差异（P<0.05）
图 4 斑点叉尾鮰MIF 组织表达 Realtime PCR 分析
3 讨论
MIF 是一类在脊椎动物中广泛研究的用于调节
适应性免疫反应的先天性免疫催化剂类细胞因子［4］。
目前已在大黄鱼、鲈鱼、栉孔扇贝和中华绒螯蟹等
水产经济动物中实现了基因克隆，并对其在病菌感
染的免疫反应中所起的作用进行了研究［13，14，21，22］。
然而，MIF 在斑点叉尾鮰中却少有研究。本研究采
用 RACE、Genome Walking 等方法获得了斑点叉尾
鮰 MIF 基因组序列，共 3 918 bp ；通过对 MIF 多态
性分析发现 60 个多态性位点 ；利用荧光定量 PCR
检测发现 MIF mRNA 在肠中表达量最高，肌肉中表
2014年第10期 221高磊等：斑点叉尾鮰巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因多态性及表达分析
炎的关系，Barton 等也证实 MIF-173 位点为关节炎
易感性的相关位点［26］。此外研究显示，MIF 启动
子 -794 位点 CATT 重复序列的拷贝数量与启动子活
性有显著的相关性，启动子活性随 CATT 重复序列
拷贝数量的增加而增强，MIF mRNA 的表达水平也
相应提高［24］。
在 哺 乳 动 物 中，MIF 在 肺、 皮 肤、 胃 肠 道 和
内分泌系统中广泛表达，表达水平受 LPS、TNF 和
IFN 等病原物质诱导出现显著变化［27］。本研究发现，
在健康斑点叉尾鮰中，MIF 在肠中表达量最高，肌
肉中表达量最低，此外脾、鳃组织的表达量明显高
于头肾、肝和脑。MIF 基因的普遍性表达方式与已
报道的其它脊椎动物 MIF 表达方式一致［15，27，28］。
通常认为 MIF 会以既定的模式持续的以较低水平分
泌，并在诱导后通过非典型分泌途径以较高水平释
放［29］。斑点叉尾鮰 MIF 基因在不同组织中的表达方
式与已知硬骨鱼有所不同。大黄鱼 MIF 基因在脑中
表达量最高［13］，鲈鱼 MIF 基因在胸腺、外周血白
细胞和头肾中表达量较高［14］，绿河鲀 MIF 基因在
鳃和性腺中表达量较高［15］，条石鲷 MIF 基因在肝
中表达量最高［30］。不同硬骨鱼 MIF 基因在不同组
织中没有统一的表达模式，这可能与机体的生理水
平和免疫状况有关，对此现象还需要进一步深入的
研究。
4 结论
根 据 斑 点 叉 尾鮰 MIF 基 因 EST 序 列， 应 用
RACE 技术克隆了 MIF 3 UTR 和 5 UTR 序列，利
用 Genome Walking 技术克隆了 MIF 启动子序列，通
过特异 PCR 克隆 MIF 内含子序列，并对多个体 MIF
基因组序列进行多态性分析，利用荧光定量 PCR 研
究 MIF 的组织分布。 结果显示，斑点叉尾鮰 MIF 基
因组序列共 3 918 bp，其中编码区 348 bp，编码 115
个氨基酸，5 UTR 为 70 bp，3 UTR 为 434 bp，启
动子为 1 382 bp，共有 2 个内含子，分别为 243 bp
和 1 441 bp。MIF 基因组序列中包含 4 个重复单元序
列和 60 个多态性位点，其中共有 6 个 SNP 位于转
录因子结合位点上。斑点叉尾鮰 MIF mRNA 在肠中
表达量最高，肌肉中表达量最低。
参 考 文 献
［1］ Bloom BR, Bennett B. Mechanism of a reaction in vitro associated
with delayed-type hypersensitivity［J］. Science, 1966, 153（3731）：
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（责任编辑 李楠）