全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-20
基金项目 : 上海市教育委员会重点创新基金项目（11ZZ148）, 上海市科促会联盟计划项目（4319）, 上海市宝山区科学技术委员会科研基金
（CXY-2010-31）
作者简介 : 张卓娜 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 水产生物分子生物学 ; E-mail: pure_2005@126.com
通讯作者 : 陶妍 , 女 , 教授 , 硕士生导师 , 研究方向 : 水产生物分子生物学 ; E-mail: ytao@shou.edu.cn
抗菌肽是生物体受到病原微生物入侵时产生
的一类具有抗菌活性的小分子肽，广泛存在于各种
生物体内，是机体天然免疫防御系统的重要组成部
分［1］。抗菌肽除具有抑制病原微生物、抗肿瘤作用
外，还以其活性稳定、不易产生耐药性、不会污染
环境等优点成为抗生素的最佳替代品［2］。最初，瑞
典科学家 Boman 等［3］从惜古比天蚕（Hyalophora
cecropia）蛹中分离到一种具有抗菌活性的碱性肽类
物质，将其命名为天蚕素（cecropin），这是首次真
正意义上发现的抗菌肽［4］。迄今为止，已经在多种
斑点叉尾鮰 NK-lysin基因的 cDNA克隆及
融合表达质粒构建
张卓娜 陶妍
（上海海洋大学食品学院，上海 201306）
摘 要： 以斑点叉尾 （Ictalurus punctatus）NK-lysin-type1的成熟肽为研究目标，首先通过 RT-PCR和巢式 PCR从斑点叉尾
的鳃中克隆到编码 NK-lysin成熟肽的基因，该基因编码由 92个氨基酸残基组成的成熟肽；6个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟
肽内，它们被推测与 NK-lysin的抗菌活性有关。为了进一步构建原核表达系统用于成熟肽的表达，pET-32a（+）被选择作为融合
表达质粒，该质粒含有 1个 trxA融合头基因，与目的片段 mNK-lysin连接后形成融合基因 trxA-mNK-lysin，进而有助于在工程菌
E. coli BL21（DE3）中的可溶性融合表达。通过 PCR、EcoR I和 Hind Ⅲ双酶切处理以及 DNA测序鉴定，证明 pET-32a-mNK-lysin
重组融合表达质粒已经被成功构建；将其转化至工程菌 E. coli BL21（DE3）后的测序结果表明该重组质粒未发生任何 DNA变异。
关键词： 斑点叉尾 抗菌肽 NK-lysin cDNA克隆 融合表达质粒
cDNA Cloning and Construction of Fusion Expression Plasmid for
NK-lysin Gene from Channel Catfish （Ictalurus punctatus）
Zhang Zhuona Tao Yan
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract: In this work，NK-lysin-type1 mature peptide from channel catfish （Ictalurus punctatus） was used as an object of the study.
First，a cDNA fragment encoding NK-lysin-type1 mature peptide was cloned from the gill of channel catfish by RT-PCR and nested PCR，and
it encoded an 92-amino acid mature peptide. Six highly conserved cysteine residues occurred in the mature peptide，which was speculated to
be related to the antimicrobial activity of NK-lysin. In order to construct a prokaryotic expression system to express the target peptide，pET-32a
（+） was selected as the fusion expression plasmid，and it contained a trxA fusion partner which can link with the target fragment mNK-lysin.
The fusion gene trxA-mNK-lysin will benefit expression of the soluble fusion protein in E. coli BL21（DE3）. pET-32a-mNK-lysin recombinant
expression plasmid was successfully constructed，which was confirmed by PCR，digestion of restriction endonucleases and sequencing.
Finally，the recombinant expression plasmid was transformed into E. coli BL21（DE3），and sequencing result for the positive clone indicated
that no DNA mutation occurred.
Key words: Channel catfish Antimicrobial peptide NK-lysin cDNA cloning Fusion expression plasmid
2012年第9期 167张卓娜等 ：斑点叉尾鮰 NK-lysin 基因的 cDNA 克隆及融合表达质粒构建
生物体内发现了抗菌肽，按其来源分为微生物抗菌
肽、植物抗菌肽、昆虫抗菌肽、两栖类抗菌肽、水
生生物抗菌肽和哺乳动物抗菌肽等［5］。在众多来源
的抗菌肽中，水生生物的抗菌肽以其杀菌作用更强、
溶血效应小、种类更多样化而显示了更具优势的应
用前景［6］。
NK-lysin 是机体自然杀伤细胞（NK）和毒性 T
细胞（CTL）中存在的一种被称之为“颗粒溶素”
的抗菌肽，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥了
重要作用。至今，关于鱼类 NK-lysin 的研究报道甚
少。研究表明，自然杀伤细胞（NK）和毒性 T 细胞
（CTL）在机体免疫防御系统中与中性粒细胞、巨
噬细胞一起发挥着至关重要的作用。在病原物的刺
激下，这些细胞会释放一些溶细胞颗粒作用于靶细
胞，而溶细胞颗粒包含了多种蛋白，它们通过干扰
靶细胞膜而导致细胞凋亡，以达到抵御病原菌的作
用［7］。1987 年，Jongstra 等［8］从人的 T 淋巴细胞中
确定一种基因 ；2000 年，Krensky［9］根据该基因位
于 NK 和 CTL，将其命名为 granulysin（GNLY，颗
粒溶素），该基因编码的多肽对细菌、真菌、原生动
物、寄生虫等具有广泛的抗性［10-12］。随后，从猪的
肠道组织中分离到与人的 GNLY 具有相似结构和抗
菌特性的抗菌肽，并命名为 NK-lysin（NKL）［13，14］。
此后，也有从牛及其他生物中分离到类似基因的报
道。但是，迄今为止，几乎无关于 NK-lysin 原核表
达方面的研究报道。至于对鱼类 NK-lysin 的研究则
更少。
Wang 等［15，16］对斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）
NK-lysin 三个同工型（type1、type2、type3）的全长
cDNA 序列进行了报道。本研究在此基础上，进一
步对 type1 的蛋白质一级结构进行相关分析，以其功
能性区域成熟肽部分为研究目标，通过 RT-PCR 和
巢式 PCR 获得其编码基因，成功构建了用于成熟肽
表达的融合表达质粒 pET-32a-mNK-lysin，并将其转
化至工程菌 E. coli BL21（DE3）中，旨在为抗菌肽
NK-lysin 成熟肽的原核表达奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
斑点叉尾鮰来自上海市浦东汇仑特种水产养殖
场，鲜活鱼运至实验室后击毙取其鳃，立即用于总
RNA 的提取。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取和第一股cDNA合成 采用RNA-
isoTM Plus 试剂（TaKaRa，Otsu，日本），按照使用
说明书对斑点叉尾鮰的鳃进行总 RNA 的提取。第一
股 cDNA 的合成按照 M-MLV RTase cDNA Synthesis
Kit（TaKaRa，Otsu，日本）进行。反应体系为 ：2
L 总 RNA、5 L AP 通 用 引 物（Adapter Primer）、2
L ddH2O ；70℃保温 10 min 后迅速在冰上冷却 1-2
min ；再依次加入 4 L 5×First Strand Buffer、2 L DTT
（0.1 mol/L）、4 μL dNTP（2.5 mmol/L），42℃保温 2
min 后加入 1 L Reverse Transcriptase M-MLV（RNase
H-）（200 U/L）继续保温 70 min ；最后 70℃保温
15 min，冰上冷却后得到第一股 cDNA［17］。
1.2.2 NK-lysin 前体肽基因的克隆 参考斑点叉尾
鮰 NK-lysin-type1 基因的 cDNA 序列（GenBank 登录
号 AY934592.1）设计正向引物（5-ATGCACATGGA-
ATACCTGAGAG-3）和反向引物（5-GATCTGCTTG-
TGGTGTTGTG-3），以第一股 cDNA 为模板，PCR 反
应体系如下 ：2.5 L 第一股 cDNA、各 4 L 10 μmol/L
的正向和反向引物、1 L Taq Plus DNA Polymerase（2.5
U/L）（天根生物科技公司，北京）、10 L 10×Taq Plus
Buffer、8 μL 2.5 mmol/L dNTP、无菌水将反应液调至
100 μL。PCR 扩增程序 ：94℃预变性 3 min ；94℃变
性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 30 个循环；
72℃延伸 5 min。经 DNA 纯化试剂盒（天根生物
科技公司，北京）纯化后的目的片段与 pSURE-T
Simple 质粒载体（北京艾德莱生物科技有限公司，
北京） 按 3 1 比例、在 T4 DNA 连接酶作用下、16℃
连接过夜 ；转化至 DH5α 感受态细胞，37℃培养过
夜 ；3 个阳性克隆由上海生工生物工程有限公司进
行 DNA 测序。
1.2.3 NK-lysin 成熟肽基因酶切位点的添加和克
隆 根据巢式 PCR 原理，以上述前体肽的 cDNA 为
模板，设计添加 EcoR I 酶切位点的正向引物（5-GG-
AATTCTGTTGGGCGTGTCAGTGG-3）和添加 Hind Ⅲ
酶切位点的反向引物（5-CCCAAGCTTTCAGATCTG-
CTTGTGGTGTTG-3），扩增得到编码 NK-lysin-type1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期168
成熟肽的 cDNA 片段 mNK-lysin。PCR 反应体系和条
件以及测序过程同上。
1.2.4 NK-lysin 成熟肽融合表达质粒的构建及转化
至 E. coli BL21（DE3） 将上述经 DNA 测序验证的、
含 pSURE-mNK-lysin 重组质粒的菌落经 37℃、220
r/min 液体培养过夜后，用质粒小提试剂盒（天根生
物科技公司，北京）抽提质粒 ；对得到的重组质粒
进行 EcoR I 和 Hind Ⅲ双酶切处理，反应体系和条
件如下 ：10 L pSURE-mNK-lysin 重组质粒、2 L 1×M
buffer、1 L EcoR I（20 U/L）、1 L Hind Ⅲ（20 U/L）、
6 L ddH2O ；37℃保温 3 h 后加入 10×Loading Buffer
终止反应 ；经 1% 琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片
段进行 DNA 纯化。
同时，对 pET-32a（+）表达质粒进行双酶切，
反应体系如下 ：40 L pET-32a 质粒、4 L 1×M buffer、
2 μL EcoR I（20 U/μL）、2 μL Hind Ⅲ（20 U/μL）、2
μL ddH2O ；37℃保温 4 h 后加入 10×Loading Buffer
终止反应，经 0.5% 琼脂糖凝胶电泳后，切下线性质
粒进行 DNA 纯化。
将上述含酶切位点的成熟肽片段 mNK-lysin 与
线性 pET-32a（+）质粒按如下体系进行连接 ：1 μL
10×T4 DNA 连接酶缓冲液、2 μL 线性 pET-32a 质
粒、6 μL 目的片段、1 μL T4 DNA 连接酶 ；16℃连接
过夜 ；连接液转化 DH5α 感受态细胞，37℃培养过
夜；经PCR和双酶切鉴定的阳性克隆进行DNA测序；
经测序确证的阳性菌落经液体培养后，进行质粒提
纯 ；取 1 μL pET-32a-mNK-lysin 重组质粒转化 E. coli
BL21（DE3），筛选阳性克隆，再进行 DNA 测序鉴定，
以备后续表达之用。
1.2.5 基于 NK-lysin 氨基酸序列的分子系统树
构建 分子系统树采用 MEGA5.05 临位相联法
（Neighbor-Joinging）构建，各结点的置信度由自引
导值估计，重复次数为 1 000。用于构建分子系统树
的 NK-lysin 氨基酸序列来自于 NCBI 网站，它们的
序列号分别为 ：Catfish NK1（AAY16122.1）、Catfish
NK2（ABC17994.1）、Catfish NK3（ABC17995.1）、
Zebrafish（AAN77873.1）、Salmon（ACI68092.1）、
Human（NP_006424.2）、Bovine（AAP20032.1）、
Horse（NP_001075398.2）、Pig（CAA59720.1）、Dog
（XP_850517.1）、Sheep（ABR67873.1）、Chicken
（ABA60870.1）、Fluke（AAB02579.1）、Nematode
（NP_509236.2）。
2 结果
2.1 斑点叉尾鮰NK-lysin前体肽和成熟肽基因的
cDNA克隆
在第一次 PCR 扩增时，以斑点叉尾鮰鳃的第一
股 cDNA 为模板、采用一对自行设计的引物，扩增
得到 393 bp 的一个片段（图 1），经纯化后连接到
pSURE-T-Simple 载体，测序结果（图 2）表明，所
扩增的片段编码 NK-lysin-type1 的 131 个氨基酸残基
组成的前体肽部分。
图 1 NK-lysin前体肽的 PCR扩增
M. DNA Marker ；1. PCR 产物
根据巢式 PCR 原理，进一步以上述前体肽的
cDNA 片段为模板，通过设计一对添加 EcoR I 和
Hind Ⅲ酶切位点的引物，扩增得到一个 295 bp 的
片段（图 3），经测序表明该片段的两端分别引入了
EcoR I 和 Hind Ⅲ两个酶切位点（数据未显示）；除
去酶切位点后，该片段编码了一段由 92 个氨基酸残
基组成的 NK-lysin-type1 成熟肽部分，6 个保守的半
胱氨酸残基位于该区域内（图 2）。
2.2 斑点叉尾鮰NK-lysin成熟肽一级结构的氨基酸
序列分析及与其他生物的比较
应用 Clustal W 软件对斑点叉尾鮰 NK-lysin-
type1 与另外两个同工型及其他生物的 NK-lysin 成
熟肽一级结构进行分析和比对，结果（图 4）显示，
不同来源 NK-lysin 成熟肽的氨基酸序列显示了多个
保守的氨基酸残基（灰色阴影），尤其值得注意的是
用于比对的鱼类、绝大多数哺乳动物和非脊椎动物
2012年第9期 169张卓娜等 ：斑点叉尾鮰 NK-lysin 基因的 cDNA 克隆及融合表达质粒构建
的 NK-lysin 成熟肽中存在 6 个高度保守的半胱氨酸
残基（黑色阴影），它们可能与 NK-lysin 的抗菌活性
有关。由表 1 可见，斑点叉尾鮰 NK-lysin-type1 与其
他两种同工型之间的核苷酸同源性分别为 73.1% 和
73.8%，与斑马鱼、大西洋鲑之间的核苷酸同源性分
别为 53.4% 和 47.7%，而与无脊椎动物（线虫和吸虫）
和脊椎动物（鸡和哺乳类）之间的核苷酸同源性则
较低。氨基酸序列比对的结果与上述结果的趋势是
一致的。
2.3 基于NK-lysin氨基酸序列的分子系统树分析
由图 5 可见，分子系统树分为两大组，第一组
包括鱼类和无脊椎动物（吸虫和线虫），第二组主要
是哺乳类动物。第一组中由鱼类组成的大分支中斑
点叉尾鮰 type1和 type2与斑马鱼和鲑鱼的关系很近，
它们一起形成了一个较大的分支，区别于一个由斑
点叉尾鮰 type3 形成的小分支。由此看出，基于 NK-
lysin 全长氨基酸序列所作的分子系统树分析显示了
斑点叉尾鮰 type3 与 type1 和 type2 之间在亲缘关系
上具有一定距离 ；但是，上文中由成熟肽比对结果
显示了斑点叉尾鮰 NK-lysin 三种同工型之间具有较
* 表示终止密码子 ；方框表示成熟肽区域 ；▲表示半胱氨酸残基
图 2 NK-lysin前体肽的核苷酸及推断的氨基酸序列
图 3 NK-lysin成熟肽的 PCR扩增
M. DNA Marker ；1. PCR 产物
·表示相同的氨基酸残基 ；-表示空位 ；黑色阴影表示保守的 6 个半胱氨酸残基 ；灰色阴影表示其他保守的氨基酸残基
图 4 斑点叉尾鮰与其他生物之间 NK-lysin成熟肽的氨基酸序列比对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期170
高的同源性，由此证明了 NK-lysin 的活性主要由较
为保守的成熟肽区域承担。
2.4 重组融合表达质粒的构建与鉴定
将含酶切位点的编码成熟肽的 DNA 片段 mNK-
lysin 与 pET-32a（+）表达质粒连接（图 6），通过
菌落 PCR 鉴定，发现在近 900 bp 处有清晰条带（图
7-A），与理论相符，初步确定为阳性菌落 ；进一步
对阳性菌落中的质粒进行提纯，通过 EcoR I 和 Hind
III 对质粒进行双酶切处理，经 1% 琼脂糖凝胶电泳
后，发现存在大、小分子量的两条谱带，其中一条
约 291 bp 的小分子量谱带属于目的片段（图 7-B）。
最终通过对阳性克隆的测序，证明目的片段 mNK-
lysin 已正确连接到 pET-32a（+）表达载体上，并且
核苷酸序列未发生任何碱基突变。至此，重组融合
表达质粒 pET-32a-mNK-lysin 被成功构建。取 1 L 重
组表达质粒转化 E. coli BL21（DE3）后，筛选阳性
克隆作进一步测序，结果表明，pET-32a-mNK-lysin
表 1 斑点叉尾鮰与其他生物之间 NK-lysin成熟肽的
核苷酸及推断的氨基酸序列同源性（%）
物种 Catfish NK1 物种 Catfish NK1
Catfish NK2 73.1a（65.2）b Pig 40.7a（25.0）b
Catfish NK3 73.8（52.2） Dog 35.7（17.3）
Zebrafish 53.4（45.7） Sheep 40.1（22.8）
Salmon 47.7（39.1） Chicken 40.1（30.4）
Human 37.2（18.3） Fluke 38.7（21.7）
Bovine 42.3（23.9） Nematode 35.4（22.3）
Horse 40.5（23.9）
a. 核苷酸同源性 ；b. 氨基酸同源性
图 5 基于 N-J法构建的 NK-lysin分子系统树
图 6 pET-32a-mNK-lysin重组融合表达质粒的构建示意图
重组表达质粒转化至工程菌 E. coli BL21（DE3）后，
未发生任何变异。
3 讨论
近几年来，由于水产养殖中抗生素的过量使用，
导致细菌耐药性的问题越来越严重，而生物机体中
存在的一些与其自身免疫功能相关的抗菌肽是传统
抗生素的理想替代品。据报道，大部分生物机体中
存在的一些小分子的碱性抗菌肽在它们的成熟肽区
域含有数个半胱氨酸残基，且这些残基通常位于高
度保守的位点，由此证明它们与抗菌活性有关。例
如，斑点叉尾鮰 3 种 NK-lysin 同工型的成熟肽区域
中均存在 6 个半胱氨酸残基［15， 16］。在不同生物的肝
脏中表达的抗菌肽 -1（Leap-1，hepcidin）和抗菌肽
-2（Leap-2）分别含 8 个和 4 个半胱氨酸残基［17， 18］。
Andersson 等［19， 20］对猪肠道中分离的 NK-lysin 抗
2012年第9期 171张卓娜等 ：斑点叉尾鮰 NK-lysin 基因的 cDNA 克隆及融合表达质粒构建
菌肽作了较深入的研究，证明 NK-lysin 含 3 对链内
二硫键，对于大肠杆菌和巨大芽孢杆菌（Bacillus
megaterium）具有强的抗菌能力，而对于乙酸钙不
动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）和化脓链球菌
（Streptococcus pyogenes）显示中等的抗菌能力。NK-
lysin 能够与大肠杆菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas
aeruginosa）和沙门氏菌（Salmonella enterica）等革
兰氏阴性菌细胞膜上的脂多糖（LPS）结合而破坏
细菌的细胞膜结构，由此表明 NK-lysin 是作为一种
天然的脂多糖结合蛋白而参与了机体的内源性免疫
系统。
虽然迄今为止有不少哺乳类动物及少数鱼类
NK-lysin 抗菌肽基因的研究报道，但未见对其进行
DNA 重组表达。据此，本研究以已经报道的斑点
叉尾鮰 3 种 NK-lysin 同工型基因中的 type1 为基础，
首先对其编码成熟肽的 cDNA 片段进行克隆，进而
推断其一级结构。根据不同生物之间 NK-lysin 成熟
肽氨基酸序列的比对结果，发现斑点叉尾鮰与猪之
间有 40.7% 的同源性，并且两者在成熟肽区域均存
在 6 个保守的半胱氨酸残基，预示了来自斑点叉尾
鮰的 NK-lysin-type1 的成熟肽亦可能具有抗菌活性。
这样，进一步的研究即聚焦于原核表达系统的构建，
以期用于 NK-lysin 成熟肽的重组 DNA 表达。本研
究选择 pET-32a（+）作为原核表达质粒，该质粒含
有 1 个 trxA 融合头基因，在其 3端连接有编码 6 个
组氨酸和肠激酶识别位点的基因，它们与目的片段
mNK-lysin 连接后形成融合基因 trxA-mNK-lysin，从
而有利于目的蛋白的可溶性融合表达 ；6 个组氨酸
标记将有利于表达产物的亲和层析，而肠激酶识别
位点将用于融合蛋白的酶切以除去 trxA 融合头。菌
落 PCR、双酶切鉴定和 DNA 测序的结果证明了融合
表达质粒 pET-32a-mNK-lysin 已经成功构建，进一步
的工作将聚焦于原核表达条件的筛选和确定。
4 结论
通过 RT-PCR 和巢式 PCR 从斑点叉尾鮰鳃中克
隆到编码 NK-lysin 抗菌肽的成熟肽基因，该基因编
码的成熟肽由 92 个氨基酸残基组成 ；6 个高度保守
的半胱氨酸残基位于成熟肽内。以 pET-32a（+）为
表达质粒、E. coli BL21（DE3）为工程菌构建的原
核表达系统经菌落 PCR、EcoR I 和 Hind Ⅲ双酶切以
及 DNA 测序鉴定，证明重组融合表达质粒 pET-32a-
mNK-lysin 已被成功构建，转化至工程菌 E. coli BL21
（DE3）后无任何 DNA 变异。
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（责任编辑 马鑫）