全 文 ：·综述与专论· 2015, 31(12):63-69
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）为
复制缺陷型病毒，属细小病毒家族，至今还没有发
现与人类的任何疾病相关，其能定点整合到人类基
因组 19 号染色体上［1］。另外，AAV 还有免疫原性弱、
宿主范围广、理化性质稳定、长期表达外源基因等
优点［2-4］，因此 AAV 被认为是介导基因治疗的理想
载体之一。重组腺相关病毒载体（rAAV）源于非致
病的野生型 AAV，在医学研究中，rAAV 被用于多
种疾病的基因治疗的研究（包括体内、体外）；同时
作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因
功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
目前有关以 rAAV 为载体的基因治疗临床研究报道
已经超过 90 多项［4］。
作为基因载体，rAAV 进一步从实验室走向临床
应用的一个关键性问题是如何规模化制备经济、安
全、质量可控的 rAAV 载体，文章旨在介绍几种新
型规模化生产 rAAV 的方法，探讨基因治疗中 rAAV
载体规模化制备的发展趋势。
收稿日期 ：2015-02-10
基金项目 ：中央高校基本科研业务费资助项目（JB-ZR1142）
作者简介 ：占申标，男，硕士研究生，研究方向 ：基因治疗 ；E-mail ：1200416004@hqu.edu.cn
通讯作者 ：李招发，男，博士，副研究员，研究方向 ：基因治疗 ；E-mail ：lizhaofa@hqu.edu.cn
rAAV 规模化包装系统的研究进展
占申标  唐明青  甘娜  曹苑青  李招发
（华侨大学生物医学学院，泉州 362021）
摘 要 ： 重组腺相关病毒（rAAV）作为唯一一种通过欧盟 FDA 认证的基因治疗载体，具有宿主范围广、转染效率高、非致
病性、免疫原性低、能够长期表达外源基因的优点。随着以 rAAV 基因治疗临床试验的深入与扩大，传统 rAAV 包装系统产能不足
的缺点逐渐凸显出来，急需可放大、易规模化的 rAAV 包装系统来解决现有的供需矛盾。鉴于此，在介绍传统 rAAV 包装系统的基
础之上，着重阐述了杆状病毒昆虫细胞系法、酵母法以及痘苗病毒 - 腺病毒法，尤其对后者寄予厚望。旨在介绍几种较好的 rAAV
规模化包装方案，探讨其规模化制备的发展趋势。
关键词 ： 重组腺相关病毒 ；基因治疗 ；载体 ；包装系统
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.009
Research Progress Regarding to Large-scale Packaging
System of rAAV
Zhan Shenbiao Tang Mingqing Gan Na Cao Yuanqing Li Zhaofa
（School of Biomedical Sciences，Huaqiao University，Quanzhou 362021）
Abstract: As the only gene therapy vector certificated by EU FDA, recombinant adeno-associated virus（rAAV）has advantages of
wide host range, high transfection efficiency, non-pathogenic, low immunogenicity and long-term expression of transgenosis. With the expansion
of applying rAAV for gene therapy clinical trials, the shortage of capacity of packing system in traditional rAAV has emerged, thus the rAAV
packaging system that can be easily enlarged and scaled up to solve the existing problem of supply and demand is in urgent need. Therefore, on
the basis of describing traditional rAAV packaging system, the focus of this review is to emphatically expound the baculovirus insect cell lines,
yeast, and vaccinia virus-adenovirus method, especially with more expectation to the last one. The aim of this article is to introduce several
preferable systems for scale packaging of rAAV, and discuss the trend of development.
Key words: rAAV ；gene therapy ；vector ；packaging system
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1264
1 rAAV 制备的两个重要过程
1.1 rAAV衣壳蛋白的装配
1.1.1 rAAV 的包装原件 AAV 基因组为约 4.7 kb
的单链 DNA，两个末端是倒转重复序列（ITR），是
AAV 整合、复制、拯救和包装所必须的顺式作用元
件，并具转录启动子活性。ITR 序列之间包含两个
开放阅读框，称为 Rep 和 Cap，分别编码 4 个 Rep
蛋白（Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40）和 3 个 Cap
蛋白（VP1、VP2 和 VP3）以及 1 个最近几年才发现
的装配激活蛋白（AAP）（图 1）［5，6］，这几种蛋白
均在 rAAV 的包装过程中扮演极其重要的角色。其
中 Rep78 和 Rep68 的转录由 p5 启动子控制，Rep52
和 Rep40 由 p19 启动子起始转录，p40 启动子调节
Cap 蛋白 VP1、VP2 和 VP3 的转录［7］。
VP3 单独能否组装出 rAAV 病毒样粒子。
最初 Ruffing 等［10］在 HeLa 细胞中利用质粒单
独表达 VP3 并不能形成 rAAV 病毒样粒子，但如果
将 VP3 与 VP1 或 VP2 共表达，则可见 rAAV 病毒样
粒子形成 ；利用杆状病毒载体在昆虫细胞系 sf9 表
达 VPs 的研究表明，VP3 单独表达也不能形成 rAAV
病毒样粒子。然而 Warrington 等［11］发现，在 293 细
胞中单独表达 VP3 能产生 rAAV 病毒样粒子。针对
这一貌似矛盾的结论，Sonntag 等［5］展开研究，发
现 Cap 基因还编码另外一种蛋白 AAP，其编码框介
于 VP2 和 VP3 之间。该研究显示，VP3 单独不能形
成 rAAV 病毒样粒子，但是如果与表达 AAP 的质粒
共转染，则能形成 rAAV 病毒样粒子［11］。在 Ruffing
的研究中，VP3 表达质粒只包含 VP3 序列本身，不
能表达 AAP，正是这一质粒构建上的差别导致其与
Warrington 实验结果不一致。AAP 主要定位于细胞
核内，协助 VPs 蛋白从细胞质进入细胞核，起到病
毒装配的支架作用，还可能协助 VPs 进行正确折叠。
1.1.3 其 他 因 素 在 rAAV 病 毒 样 粒 子 装 配 中 的 作
用 除了 AAP 之外，在细胞核内，可能还有其他因
子协助完成 rAAV 衣壳的装配，包括 Rep 蛋白、核
仁磷蛋白等。
rAAV 病毒样粒子在细胞核内装配时，衣壳蛋白
分子并非独立存在，而是与 Rep 蛋白发生交联。在
rAAV 制备过程中，这一交联比较容易受到破坏，故
在目前制备的 rAAV 中检测不到 Rep 蛋白，但是这
并不能否认 Rep 蛋白在 rAAV 病毒样粒子形成中的
作用［12］。
rAAV 感染后完整衣壳最初呈现于核仁中，随后
遍及整个细胞核，表明核仁的某些成分在衣壳蛋白
装配过程中起到重要作用。研究发现，利用 siRNA
干扰核仁磷蛋白，rAAV 载体的基因表达效率可以提
高 5-15 倍，表明核仁磷蛋白确实与 rAAV 在核内的
行为存在联系［13］。另有研究表明，核仁磷蛋白可与
衣壳之间存在直接的连接，而且核仁磷蛋白还具有
与 Rep 结合的能力［14］。
除了某些蛋白成分可能影响衣壳装配外，细胞
本身的环境因素也可能对 rAAV 病毒样粒子的装配
起到至关重要的作用，如 ATP、温度等。
Rep78
Rep
AAVสഐ㓴 p5 p19 p40
Rep68
Rep52
Rep40
VP1
VP2
VP3
AAP
AAP
Cap
5 I˃TR3 I˃TR
图 1 AAV 基因组结构
1.1.2 rAAV 病 毒 样 粒 子 的 装 配 研 究 称 在 细 胞
内，rAAV 病毒样粒子的装配只需 Cap 基因表达即
可完成，且装配在细胞核内进行［8］。传统观点认
为，Cap 基 因 只 编 码 VP1、VP2 和 VP3 三 种 蛋 白，
但是病毒样粒子的形成究竟是需要三种蛋白、两种
蛋白还是一种蛋白，一直存在争论。VP1 和 VP2 主
要定位于细胞核内，而单体的 VP3 在核内和细胞
质内均有分布，表明 VP1、VP2 和 VP3 在装配过程
中具有不同的行为。VP1 和 VP2 上都具有核定位信
号（166PARKRLNF173）， 可 能 起 到 运 送 VP3 进 入 细
胞核的作用［9］。因为衣壳表面全部由 VP3 序列（包
括 VP3、VP1 和 VP2 的 C 末端）组成，VP1 和 VP2
的 N 末端位于衣壳的内部，因此争论的焦点主要是
2015,31(12) 65占申标等：rAAV 规模化包装系统的研究进展
1.2 DNA的衣壳化
rAAV 衣 壳 蛋 白 的 装 配 和 DNA 的 衣 壳 化 是
rAAV 包装过程中两个最为重要的过程。这两个过程
目前有了总体上的认识，虽然许多细节还无法知晓，
尤其是基因组进入衣壳的过程还知之甚少。现有的
rAAV 包装机制模型达成了以下基本共识 ：先是 Rep
蛋 白 连 接 单 链 DNA（ssDNA） 的 ITR 以 及 Cap 蛋
白，将 ssDNA 定位于衣壳表面，接下来 ssDNA 借助
于 Rep 蛋白的螺旋酶活性和 ATPase 活性，以 3-5
为方向，在衣壳五倍轴的顶端小孔进入衣壳。其中，
ssDNA 导入已经形成的病毒衣壳的具体机制还未研
究清楚［15］（图 2）。
质粒、一个提供腺病毒辅助功能的质粒共转染宿主
HEK293 细胞。三质粒转染法最大的优点是不用加
辅助病毒，排除了辅助病毒对 rAAV 的污染，方便
制备各种血清型的 rAAV，使制备和纯化步骤大为简
化，制备的 rAAV 基本可以满足实验室研究所用。
3 rAAV 的新型包装系统
3.1 利用杆状病毒昆虫细胞系sf9来表达rAAV
近些年来，杆状病毒昆虫表达系统在蛋白质表
达和病毒制备等方面发挥重要的作用，特别是 Bac-
to-Bac 系统大大简化了杆状病毒的制备过程。陈
雅宁等［17］ 设想利用杆状病毒昆虫表达系统制备
rAAV，克服传统方法中的诸多限制因素，满足临
床级别 rAAV 的要求。将 rAAV 的 ITR 及目的基因
表达框从 pAAV-MCS 剪切引入杆状病毒载体中构
建顺式载体，rAAV 的衣壳和复制蛋白基因在反式
pFastBacDual 中利用真核基因遗漏扫描原理表达，
两者分别制备成杆状病毒，共感染昆虫细胞 sf9 来
完成 rAAV 拯救、复制和包装过程。病毒滴度可达
1×108-3×108 VG/mL。增强绿色荧光蛋白（EGFP）
作为报告基因验证其可行性，将生产的 rAAV-EGFP
感染 293T 细胞测试得知其具有良好的生物学活性，
该系统具有高效、安全、简便等特点，为临床级
rAAV 制备和基因治疗奠定了基础。
另外，Urabe 等［18］建立的昆虫杆状病毒系统，
避免了质粒转染人类细胞效率低的问题，这种方法
需要 3 种杆状病毒，rBac-Rep、rBac-Cap、rBac-ITR-
GFP-ITR 分别提供 Rep、Cap、ITR 和目的基因，先
在 sf9 细胞中扩增 3 种杆状病毒，然后将纯化的杆
状病毒共感染悬浮培养的 sf9 细胞，就可以大规模
制备 rAAV。病毒感染法无需瞬时转染，也不需要建
立稳定转染的细胞系，所有元件都由病毒提供。此
法优点主要有 ：杆状病毒感染细胞后产生的子代病
毒可以继续感染细胞，大大提高了制备效率 ；可以
在制备过程中对各种参数进行监测和控制 ；避免了
瞬时转染贴壁细胞这一限制性步骤 ；容易大规模培
养 ；制备成本低［19］。但杆状病毒缺乏遗传学和物理
学稳定性是此系统目前面临的最大挑战。
3.2 利用痘苗病毒规模化和安全化制备rAAV载体
尽管最近几年以 rAAV 为载体基因治疗的临床
A B
C D
Inter
surface
Out
surface
Fivefold axis
Twofold
axis
Threefold
axis
HI
loop
A ：衣壳表面形态，处于 5 边型中心的是五倍轴，轴的顶端就是 DNA 进入
衣壳的小孔；处于三角形中心的是三倍轴，而每条棱的中心位置是二倍轴；B：
5 个衣壳蛋白分子构成的衣壳五聚体亚单位及小孔结构；C 和 D，小孔的结构：
从外面往里看（C）和侧面看（D）［16］
图 2 AAV 衣壳以及五倍轴小孔的结构
2 rAAV 的经典包装系统
从 rAAV 被 用 作 基 因 载 体 开 始， 研 究 者 就 在
尝试各种高效制备 rAAV 的方法，以达到方便、灵
活、规模化制备能满足科研研究和临床所需 rAAV
的目的。目前应用最广的是三质粒共转染 HEK293
细胞法获得 rAAV。三质粒转染法即将一个提供外
源基因和 ITR 的质粒、一个提供 rAAV 辅助功能的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1266
研究比较成功，但是大规模化和高效的生产高质量
的 rAAV 依然面临不少难题。Dong 等［20］采用能在
细胞质完成生命周期的痘苗病毒（VV）作为 rAAV
辅助元件 Rep-Cap 的表达载体，以腺病毒 - 腺相关
病毒（Ad-AAV）杂合载体作为 rAAV 载体基因组和
辅助病毒基因组的提供者。这样就使 rAAV 辅助基
因位于细胞质内，而 rAAV DNA 能够整合到宿主的
细胞核中，它们便处于两个不同的亚细胞部位，从
空间上避免了普遍存在的非同源重组的发生，使得
野生型有复制能力 AAV（rcAAV）的污染得以首次
彻底消除（图 3）。在悬浮的 HeLa 细胞中，每个细
胞获得的 rAAV 载体产量接近于传统的三质粒共转
染所得。由于当今分析条件的限制，很难有效发现
rcAAV 的污染，这种新的方法有效的解决了这一难
题，无疑为 rAAV 载体介导的基因治疗带来了福音。
新的 rAAV 载体制备系统不但可以应用于 rAAV 的
生产，同样也适用于其它 DNA 载体的生产，至此使
得大规模和有效地 rAAV 生产得以实现［20］。
因为 AAV 是缺陷型的单链 DNA 病毒，AAV 的
DNA 的复制和包装发生于宿主细胞的核中，故现行
的 rAAV 生产方法都需要 rAAV 辅助基因在宿主核中
转录［5］。鉴于 rAAV 载体基因组在宿主细胞核大量
的扩增，而且与辅助基因组邻近，rAAV 的 Rep 和
Cap 基因以及 ITRs 不可避免地发生非同源重组，从
而导致 rcAAV 的形成。在以 rAAV 为载体的基因治
疗中，rcAAV 有可能阻止转基因的高效表达，对病
人造成伤害［21，22］。
研究和临床试验中最主要的生产 rAAV 载体的
方法就是三质粒共转染法［23］，但是该法的成本和实
验条件要求都比较高，在临床中很难得以广泛的应
用。这一新的生产 rAAV 的方法，利用 VV 的 200 kb
基因组复制可在宿主的细胞质中进行，不需要进入
核中［24］，得以使此病毒携带生产 rAAV 所需的所有
辅助基因。这个方法不但提高了 rAAV 的产量，也
避免了非同源重组的发生，这样也就阻止了 rcAAV
的干扰。
由于避免了 rcAAV 的干扰，这个新的重组方法
没有潜在的病毒蛋白的生成，就不会使基因治疗中
的转基因治疗过程复杂化，也不会对人体有害。没
有 rcAAV 形式的 DNA 干扰，也有可能对人类的基
因治疗造成新的威胁［25］，但是此问题现在还没有研
究清楚。隔离辅助基因于细胞质，可以阻止其与核
内的复制的载体基因组共定位，同样也会减少干扰，
这又是此新方法的一个潜在优势。而且组装 rAAV
载体所需元件全由病毒提供，不但可以感染悬浮细
胞，也可以模拟野生型 AAV 的复制和包装机制，从
而高效、高质量的制备 rAAV 载体，为解决 rAAV 的
规模化生产和低免疫毒性提供了可能。
vv-Rep& Cap 䶎਼Ⓚ䟽㓴 䍘㋂व㻵व㻵н᧕䀖Rep&Cap DNA Rep&Cap Rep&Cap Rep&CapDNA
rAAV DNA
ITR㓶㜎ṨᯠⲴ㓶㜎䍘VV䖵ࣙ Ր㔏ⲴṨ޵䖵ࣙ㓶㜎Ṩ
ਁ⭏䶎਼Ⓚ䟽㓴㓶㜎䍘 wt AAVrAAV DNA ITR ITR
图 3 VV 辅助生产 rAAV［20］
2015,31(12) 67占申标等：rAAV 规模化包装系统的研究进展
新制备系统的每个细胞的载体产量相当于传统
的转染方法的最佳产量，表明细胞质中 VV 的帮助
不会影响 rAAV 的复制和包装。利用 GFP 作为报告
基因可知 ：此法生产的载体与传统方法相比，在体
内效率一样高效。独特的排除 rcAAV 干扰和能大规
模生产使得这一新方案将替代传统的三质粒共转染
法，成为 rAAV 载体高效生产的首选。此外，此法
灵活性很强：当需要生产其他血清型的 rAAV 亚型时，
仅仅只需要替换确定亚型的 vv-VP1 和 vv-VP2 序列，
这样就可形成所需 rAAV 亚型的衣壳蛋白。VV 也不
是 rAAV 生产中最有效的辅助病毒，将腺病毒辅助
基因整合到 VV 基因组中，能使生产更高效。腺病
毒 - 痘苗病毒杂交体既有生长周期短，感染高效以
及精准起始基因复制，同时也能使 rAAV 载体生长
在许多哺乳细胞的悬浮液中，不仅仅是 HEK293。
总之，VV 辅助的这一新方法加以有效利用，能够保
证人类临床试验所需的 rAAV 基因载体的质量和产
量，对基因治疗临床事业的发展将有巨大的贡献［20］。
3.3 利用酵母系统包装AAV衣壳，为生产重组腺
相关病毒提供了新思路
酿酒酵母的发育过程中支持许多不同的 RNA
或 DNA 病毒的复制，为病毒样粒子的形成提供了
一种大规模、节约成本和提高时效的方法，例如，
Human Parvovirus B19。Backovic 等［7］近期研究表明
单链的 AAV2 基因组能在酿酒酵母 RSY12 中从环状
质粒起始 AAV 的包装。此研究报道也证实了酵母系
统中包装 AAV 衣壳的可行性。
在酿酒酵母中进行 AAV 病毒样粒子的包装，
至 少 需 要 AAV 三 个 结 构 蛋 白 中 的 VP1 和 VP3 参
与。 通 过 共 转 染 两 个 质 粒 到 酵 母 细 胞 而 实 施 ：
YEplacRepCap 质粒由 p40 启动子来起始 VP3 的表达，
另外由诱导酵母启动子 Gal1 起始修饰的 AAV2 Cap
基因 pYESVP1KM 质粒来表达 VP1 蛋白。最好的方
案是在含 0.5% 葡萄糖和 5% 半乳糖的培养基诱导后
4.5 h 得到最佳的 VP1∶VP3 的比例。通过两步超速
离心，就能从酵母中分离出 AAV 病毒样粒子。在
CsCl 密度梯度离心后，衣壳样粒子位于 f8-f11 部分，
密度为 1.386-1.394 g/cm3，有与野生型 AAV2 衣壳
相似的衣壳蛋白。透射电子显微镜分析可知 ：由酵
母获得的 AAV 病毒样粒子与人类细胞产生的空衣壳
形态上相似。Backovic［7］的研究第一次表明酵母系
统也能用来包装 AAV 衣壳，为 rAAV 的生产提供了
新的思路，对以 rAAV 为载体的基因治疗临床试验
意义重大。
4 展望
虽然在过去的十几年中，提出了一些比较好的
大规模生产 rAAV 载体的方法［26-28］，但由于各种各
样的不足始终无法得以推广。例如 ：杆状病毒生产
系统解决了转染问题，但在昆虫细胞中生产 rAAV
会使得感染力下降［16，29，30］。细胞法生产 rAAV 不
稳定［31］，同时需要大量筛选实现最高效。所有的载
体生产系统都必须考虑辅助病毒的稳定性和安全性，
现今发现的新方案，VV 辅助病毒稳定且生产效率
高，不会被 AAV Rep 和 Cap 基因产物所抑制，这点
腺病毒无法做到。本课题组之前也设计构建了一种
新型的、细胞特异性的、内含多个组织特异如肝特
异和造血特异序列拷贝的 microRNA 结合序列的基
因片段，通过控制包装蛋白基因片段表达，进而清
除腺相关病毒包装蛋白污染诱发的 rAAV 载体介导
的免疫反应，从而保证基因治疗取得成功［32］。
随着 rAAV 在基因治疗中存在的问题被逐渐解
决，如使用杂合的 rAAV 载体、对 rAAV 的外壳进行
修饰等方法降低其免疫原性和提高转导效率［33，34］；
使用双链 rAAV 基因组提高转导效率［35］等，rAAV
作为一种高效、安全性的转基因载体在人类基因治
疗中的优势会越发明显。随着 rAAV 规模化生产工
艺不断成熟，rAAV 在基因治疗上的诸多优点都表明
rAAV 在临床上的广泛应用将成为基因治疗领域不可
阻挡的趋势［3］。在现今的研究基础之上，还需要去
解决面临的新问题，从而有助于 rAAV 载体介导的
基因治疗临床事业的迅速发展。
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（责任编辑 狄艳红）