全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
基因治疗导入载体的研究进展
王巍杰 杨永强 徐长波
(河北理工大学化工与生物技术学院,唐山 063009 )
摘 要: 基因治疗在恶性肿瘤、癌症、遗传性疾病和心脑血管等疾病的治疗中开始应用, 临床治疗效果明显。基因治疗
中的关键技术是选用合适的载体将外源基因高效导入受体靶细胞,综述了基因治疗中病毒和非病毒载体的研究进展。
关键词: 基因治疗 导入载体 病毒载体 非病毒载体
Research Progress of Gene Therapy Delivery Carrier
W angW eijie Yang Yongqiang Xu Changbo
(Co llege of ChemicalEngineering and Biotechnology T echno logy, H ebei Poly technic University, Tangshan 063009)
Abstrac:t Gene the rapy can cure m a lignan t tum our, cance r, gene tic d iseases and card iovascu lar d iseases. The key techno logy of
gene therapy is to choose a su itab le and effic ient carrier to put the fore ign genes into targe t ce ll recepto r. The v ira l and nonvira l vectors
w ere rev iew ed in the paper.
Key words: Gene the rapy De livery carrier V ira l vec to r Nonv ira l vec to r
收稿日期: 20091020
作者简介:王巍杰,女,副教授,硕士生导师,主要研究方向为药物分析和蛋白分离纯化; Em ai:l w e ijiew ang@ yahoo. com. cn
基因治疗是指通过基因转移技术将外源正常
基因直接导入患者病变部位的靶细胞, 通过控制
目的基因的表达, 抑制、校正、替代或补偿缺陷或
异常基因, 探索治疗基因缺陷所致的遗传病、免疫
缺陷或抑癌基因的失活所致的肿瘤等疾病的一种
新型医疗方法 [ 1]。在基因治疗中, 外源基因的导入
效率直接影响基因在体内的表达水平。目前, 基因
治疗载体主要分为病毒载体和非病毒载体。病毒载
体转染效率高,靶向性强,但其包装能力小, 易引起
免疫反应。非病毒载体毒性低,具有低免疫原性,但
转染效率低 [ 2]。
1 病毒载体
11 腺病毒载体 ( adenov irus vectors)
腺病毒作为基因表达载体的研究起源于 20
世纪 60年代初, 当时病毒学家观察到腺病毒基因
组可与猴类病毒 40基因组杂交, 实质上是腺病毒
基因组可以承载异源性基因。腺病毒是一种双股
DNA病毒,病毒颗粒直径约 60- 90 nm, 呈 20面
体立体对称。腺病毒的转录可分为早期和晚期两
个阶段,早期基因转录之后, 产生 4个早期基因的
表达盒, 分别为 E1、E2、E3和 E4。后期基因由 5
组 mRNA s( L1 - L5)组成, 编码大部分的结构蛋
白,这些 mRNA s均有共同的 3个外显子, 编译 23
个前导肽, 增强结构蛋白的翻译。腺病毒在体内
具有很高的转染率, 超过 300例临床试验证明了
腺病毒的基因转导效率, 目前已有多个癌症试验
进入临床 期阶段 [ 4]。
E to等 [ 5]将精氨酸八聚体 ( R8)、穿膜肽 ( Tat)和
富脯氨酸肽 ( pro linerich pept ides)分别与腺病毒构
成复合载体。试验证明, 腺病毒肽复合载体在无
CAR细胞中仍有较高的转染效率,巨胞饮作用使载
体得以顺利进入宿主细胞。进一步研究发现, Tat
Advs的导入高度依赖于宿主细胞表面的硫酸类肝素
含量,而 R8Advs却依赖于硫酸软骨素含量。D irice
等 [ 6]通过注射链脲佐菌素 ( STZ)构建大鼠糖尿病模
型,利用腺病毒载体介导 TRA IL基因进入老鼠肾
脏。试验结果表明, 只有用腺病毒载体导入 TRA IL
基因的模型鼠能长时间维持正常的血糖浓度。Lan
等 [ 7]利用腺病毒载体介导 CTLA4 Ig基因进入正常
老鼠肝脏的内皮祖细胞。一个月后这种人胚胎来源
2010年第 2期 王巍杰等:基因治疗导入载体的研究进展
的 EPC大量增殖, 且大部分分化为肝细胞, 反映出
腺病毒载体较高的导入效率。
12 重组腺病毒载体 ( recomb inant adenov iral vec
tors)
重组腺病毒载体通常具有较低的免疫原性并能
产生持久的转基因表达, 在近几年被广泛地应用 [ 8]。
按生活周期不同, 可分为复制缺陷型 ( replicationde
fective)和复制增殖型 ( replicat ioncompetent)两类。
辅助依赖型腺病毒 (HDAd)缺乏所有腺病毒编
码序列, 具有免疫原性低、安全、转移容量大等特
点 [ 9]。其介导的基因表达水平取决于载体上充当
填充者的非编码 DNA种类, 携带有真核非编码 DNA
的转基因表达效率要比携带原核非编码 DNA的高数
10倍。Ross等 [ 10 ]探究了该现象的机理, 在转基因
和细菌 DNA之间加一隔离物以解除对 HDAd重组
原核 DNA ( HDAdprok)载体的阻遏作用。发现非
编码真核 DNA可抑制宿主染色质向转基因蔓延,
从而提高转基因表达效率, 并且 Sp100B /HMG和
Daxx会影响这种抑制作用。 Jiang等 [ 11]构建了携
带有全长抗 HER 2单链抗体基因序列的重组质粒
HDTA b,载体为辅助依赖型腺病毒。用高效的重
组酶 FLP在宿主细胞内切除辅助病毒的包装信
号, 酶联免疫吸附试验 ( ELISA )和免疫印迹法
(W estern blo t)检测到 HDA d介导的全序列抗体基
因可长时间表达。
条件增殖腺病毒 ( CRA d)是一类仅在分裂细胞
内特异增殖的新型重组腺病毒 [ 12] ,通过对腺病毒的
基因改造使其复制后具有肿瘤特异性, 可裂解肿瘤
细胞, 并释放出子代病毒感染周围肿瘤细胞。 Liu
等 [ 13]将其应用到靶向性较高的抗毒素治疗中, 检测
不同方法对免疫毒素融合基因 e23 ( scFv) PE40的
导入效率。在含致癌基因 Her2 /neu的宿主细胞中
发现, 低剂量 CRAd载体的介导提高了靶基因的表
达水平,单独作用或结合依托泊苷药物的化学疗法
都显著提高了对肿瘤细胞的杀死作用。但因 CRAd
仅能在某些路径中复制, 其单独使用便存在肿瘤的
遗传异质性问题, H ab ib等 [ 14 ]将复制缺陷型和增殖
型病毒联合使靶病毒得以顺利复制。利用其原理,
Lee等 [ 15 ]用缺失 E1区的普通复制缺陷型腺病毒与
条件增殖腺病毒 ! 24RGD联合, 显著提高了对肺癌
的治疗效果。
13 慢病毒载体 ( lentiviral vectors)
慢病毒是以 H IV1为基础发展而来的 RNA病
毒, 为逆转录病毒的一个亚类,基因组中存在核定位
信号序列,能有效感染靶细胞,使外源基因稳定地表
达。由于慢病毒载体可以感染非分裂细胞和分裂细
胞, 转移较大的基因片段,经过修饰的载体能诱导调
控, 宿主范围广泛并降低了重组的机会,而且具有高
效整合、高效表达的特点,因此成为广为关注的真核
生物基因转移载体 [ 16]。
为了提高载体的靶向性, Le i等 [ 17]让有结合缺
陷的辛德毕斯病毒 ( S indbis v irus)糖蛋白发生特异
性突变, 得到突变融合分子 ( FM )。抗 CD20抗体
( alphaCD20)和 FM共同结合到慢病毒载体上,导入
到 CD20表达细胞。发现特异性突变后的融合分子
靶向转移效率要比未突变的糖蛋白分子高 8- 17
倍, 表明突变方法与慢病毒载体的结合可以提高靶
基因的导入效率。移植物对宿主的免疫反应一直制
约着转基因移植的发展, Sca ife等 [ 18]将特异性的自
杀基因 /前药系统结合到慢病毒载体上,可明显抑制
移植物抗宿主症 ( GVHD )的发生, 提高转基因移植
的安全性。
研究显示,骨髓间质干细胞 (M SC )可以迁移到
受伤组织,因其免疫性可使靶基因持久特异地植入
到靶向组织,慢病毒载体也可作为干细胞的导入载
体。X iang等 [ 19]静脉注射 MSC到带有辐射诱发纤
维素肉瘤 ( R if1 fibrosarcoma)的老鼠体内, M SC被携
带有荧光素酶报告基因的慢病毒载体感染。用体内
成像系统 ( IV IS 200)和免疫印迹法 (W estern b lo t)检
测外源基因在老鼠体内的分布,检测到 MSC有选择
性地转移到肿瘤部位,外源基因在皮下的纤维素肉
瘤移植体迅速表达, 在肝脏、脾脏、结肠和肾脏等正
常器官中没有 MSC的分布。进一步研究发现, FGF2 /
FGFR传递路径在 MSC定向转移到纤维肉瘤组织中
扮演着关键角色, 通过体外联合培养和体内的肿瘤
细胞生长分析显示,在慢病毒载体介导的外源基因
表达中, M SC能诱导一氧化氮合酶的转移, 进而抑
制 R if1f ibrosarcoma细胞的生长,证明慢病毒载体可
与 MSC联合用于纤维素肉瘤或其他肿瘤疾病的
治疗。
39
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
2 非病毒载体
与病毒载体相比, 非病毒载体较少产生免疫反
应,更加稳定、安全, 更易大规模应用。非病毒载体
可以根据不同的导入特点选取适宜的复合物, 丰富
的原材料供应使得载体具有广泛的应用范围。聚乙
二胺和纳米微粒等材料已经用于多种非病毒载体的
构建。
21 基于聚乙二胺 ( PE I)的非病毒载体
聚乙二胺 ( PE I)由单体乙二胺聚合而成, 单体
数目的变化导致出现不同分子量的 PE I。聚合物间
的孔隙可包装外源基因或抗癌药物, 作为导入载体
应用于基因治疗。
为提高转染效率, Kang等 [ 20]建立了由 piggyBac
( PB)转座子和聚乙二胺 ( PE I)组成的混合非病毒
运载系统,构建出在 PB转座子条件下能编码单纯
疱疹胸苷激酶 (HSV tk)和红色荧光蛋白单体 ( mR
FP1)的重组质粒后,将更昔洛韦 ( GCV )注射到老鼠
腹腔,观察 HSV tk /GCV(人类单纯疱疹病毒胸苷激
酶联合更昔洛韦 )自杀基因治疗系统的抗癌作用。
3周后荧光显微法检测发现, 8196%的肿瘤细胞被
杀死, 瘤细胞也有明显的凋亡现象。 Sun等 [ 21]构建
透明质酸、聚乙二胺和 DNA的三重复合体 ( HA /
PE I /DNA),将其转移到 MDAMB435, MDAMB231
和 MCF7三种人乳腺癌细胞株中,当 HA和 PE I配
料比为 75%时,载体表现出最高的转染活性, 为恶
性乳腺癌的治疗提供理论基础。Bo lhassani等 [ 22]将
分子量为 600的聚乙二胺 ( PE I600)和穿膜肽 ( Tat)
组成的杂交肽聚合物 ( PE I600Tat)作为基因导入载
体,人类乳头状瘤病毒 16 E7作为模型抗原,利用老
鼠模型检测对模型抗原的免疫应答。 PE ITat对 E7
DNA重量比为 10∀50时, 体液和细胞免疫应答都显
著提高。
22 基于纳米微粒的非病毒载体
阳离子壳聚糖纳米微粒具有低毒性、较强生物
适应性和生物降解能力,是极具潜力的基因、抗体或
药物导入载体。Malho tra等 [ 23 ]将三聚磷酸钠作为
交联剂,用离子凝胶法得到直径为 20 nm的壳聚糖
纳米微粒, 用作小干扰 RNA ( siRNA )的导入载体。
用壳聚糖的重量比率评定外源基因的装载效率,检
测到纳米复合物在小鼠脑神经瘤细胞 ( Neuro2a)有
效地诱导转基因的表达。此外, M orille等 [ 24]将外源
DNA装入直径为 109 # 6 nm的油脂胶囊 ( LNCs)中,
加入聚乙二醇 ( PEG)增加 LNCs的稳定性, 并将半
乳糖共价结合到 PEG链以提高肝细胞唾液酸糖蛋
白受体的靶向活性,包有半乳糖 F108的 DNALNCs
的荧光素酶表达效率比未包 F108的高 18倍, 显示
出较高的转染效率。
23 其他非病毒载体
优选不同复合物可以构建出新型非病毒载体。
Ta等 [ 25]用壳聚糖水凝胶介导抗癌基因到骨肉瘤的
靶向位点。同时,结合化学治疗, 结果显示肿瘤细胞
的生长被抑制,且未发现明显副作用,这种生物可降
解的水凝胶技术能应用于抗癌基因非病毒载体的构
建。临床试验表明, 经 SB转座子改造后的 T细胞
可用于 B细胞淋巴瘤的治疗, 但非病毒载体介导的
低转染效率限制了该研究的发展。Vandendriessche
等 [ 26]将非病毒载体与最新一代的 ∃睡美人 ( SB ) %转
座系统和 P iggyB ac( PB)转座子联合作为导入工具,
克服了非病毒载体在宿主细胞转染效率不高的缺
点。在老鼠模型中检测到大量且稳定的遗传标记,
并证明该复合载体可诱导多功能干细胞 ( iPS ce lls)
的生成,恢复正常造血功能, 暗示载体的转染效率有
所提高。
RNA干扰 (RNA i)可对多种生物进行转录后基
因沉默 [ 27] , 为基因疗法开辟了新的途径, 但 RNA的
导入仍存在技术上的困难。Mori等 [ 28]设计出新型
沉默基因非病毒载体用于小干扰 RNA( siRNA )或短
发夹 RNA ( shRNA )的导入。载体是具有 4个分枝
的星形镶嵌共聚物,为水溶性体系,通过该星形载体
( SV )的介导, s iRNA几乎成功进入到所有人肝癌细
胞中,且 siRNA和 shRNA均能在癌细胞中产生有效
的基因沉默, 表明该新型载体能提供较高的导入
效率。
3 展望
病毒对宿主细胞的免疫反应制约着病毒载体的
发展,需要构建出更合适的重组病毒载体,在低免疫
原性的条件下仍有较高的基因介导效率。而对于非
病毒载体,载体材料的选取是影响靶基因导入效率
的关键,随着研究的深入,聚乙二胺和纳米微粒有望
得到更广泛的应用。除了利用载体介导靶基因的表
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2010年第 2期 王巍杰等:基因治疗导入载体的研究进展
达,也应考虑不依赖载体的外源基因导入途径。随
着导入效率和耐受性研究的开展, 电穿孔和基因枪
等直接导入方法将应用于基因治疗中 [ 29, 30]。相信
随着载体和转移系统的不断改进, 基因治疗的发展
将会越来越快,在恶性肿瘤、癌症、心血管疾病和遗
传性疾病的治疗中扮演更为重要的角色。
参 考 文 献
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