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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-09-05
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31101554）, 浙江省基金项目（Y3110340）, 浙江农林大学启动基金项目（2351001059, 2351000812）
作者简介 : 任莉 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 蔬菜学 ; E-mail: renli061107@163.com
通讯作者 : 王华森 , 男 , 副教授 , 研究方向 : 蔬菜生理与分子生物学 ; E-mail: whsych66@163.com
Myb28基因表达载体的构建及拟南芥转化
任莉1 刘慧英1 王华森2 朱祝军2
（1 石河子大学园艺系，石河子 832000 ；2 浙江农林大学农业与食品科学学院，杭州 311300）
摘 要： 利用通过 RT-PCR 扩增到的 Myb28（GenBank注册号：HQ270468）基因分别构建正义和反义植物表达载体，采用
冻融法转入农杆菌 LBA4404菌株，通过花序浸泡法对 Myb28基因缺失的拟南芥进行了遗传转化，经 RT-PCR和酶切鉴定，结果表
明 Myb28正义和反义真核表达载体构建成功，经基因组 PCR鉴定表明正义表达载体已成功整合到拟南芥基因组中。
关键词： 小白菜 Myb28 硫代葡萄糖苷 表达载体 拟南芥
Construction of Expression Vectors of Brassica chinensis Myb28
Gene and Transformation to Arabidopsis thaliana
Ren Li1 Liu Huiying1 Wang Huasen2 Zhu Zhujun2
（1Department of Horticulture，Shihezi University，Shihezi 832000；2Department of Horticulture，School of Agriculture and Food Science，
Zhejiang Agriculture & Forestry University，Hangzhou 311300）
Abstract: A full-length cDNA encoding Myb28 from Brassica chinensis was isolated using RT-PCR. The recombinant plasmids were
transferred into Agrobacterium tunefacien LBA4404 by freeze-thaw method, and then were used to infect mutant Arabidopsis thaliana. Using
PCR, we proved that the sense and antisense expression vector were constructed successfully and the genes were integrated into Arabidopsis
thaliana.
Key words: Brassica. campestris ssp. chinensis var. communis Myb28 Glucosinolates Expression vector Arabidopsis thaliana
小白菜（Brassica campestris ssp. chinensis var. co-
mmunis）别名青菜、油菜等，属于普通白菜或不结球
白菜，分布全国，在蔬菜供应中有重要的地位。小白
菜的大面积种植不仅因它生育期短、省工易种、优质
高产，而且它适应性强、抗病虫害、营养丰富。Hig-
don［1］发现十字花科蔬菜含有的硫代葡萄糖苷（gluc-
osinolates，GS）能够有效地降低癌症发生的风险。
硫代葡萄糖苷是广泛存在于十字花科植物中的
重要含硫次生代谢物［2］。其结构主要由硫葡萄糖
基、磺酸肟和来源于脂肪族或芳香族或色氨酸族氨
基酸的侧链 R 基 3 部分组成［3］，根据侧链 R 基团的
不同，可把硫代葡萄糖苷分为脂肪族硫代葡萄糖苷、
芳香族硫代葡萄糖苷和吲哚族硫代葡萄糖苷 3 个类
群。目前已发现的硫代葡萄糖苷有 120 多种，在重
要的经济作物芸薹属家族中，不同的种类大约产生
了 30-40 种不同的硫代葡萄糖苷，其中以来源于蛋
氨酸的脂肪族硫代葡萄糖苷最多。
脂肪族硫苷是小白菜中最主要的一类硫代葡萄
糖苷，它占总硫苷比例的 78.9%-89.9%，脂肪族硫
苷在抗病虫方面特别是在抑制十字花科植物专食性
昆虫的生存和发育方面有重要作用［4］。Myb28 基因
是脂肪族硫苷合成的一个正调控因子，也是关键因
子，是脂肪族硫苷合成时所必须的正向表达基因。
它的表达能够被机械刺激非常迅速地诱导，可引起
脂肪族硫苷水平的升高，从而可获得高脂肪族硫苷
含量的转基因品种。本试验拟通过 RT-PCR 扩增到
Myb28 全长序列并利用克隆到的基因分别构建正义
及反义植物表达载体，并利用构建好的正义表达载
2012年第3期 81任莉等 ：Myb28 基因表达载体的构建及拟南芥转化
体进行突变体拟南芥转化，旨在为进一步验证该基
因的功能打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 试验材料为购于杭州市良种引进
公司的“油冬儿”小白菜（Brassica campestris ssp.
chinensis var. communis）品种和从拟南芥生物资源
中心（Arabidopsis Biological Resource Center）购买的
Myb28 基因缺失的拟南芥（Arabidopsis thaliana ）突
变体（SALK-136312）。“油冬儿”小白菜生长至二
叶一心时取整株提取总 RNA 进行相关试验，拟南芥
生长至蕾期时对含苞待放的花蕾进行农杆菌侵染。
1.1.2 细菌菌株与质粒载体 本研究所用的大肠杆
菌菌株为 E.coli DH5α，农杆菌菌株为 LBA4404，克
隆载体为 PMD18-T simple Vector，表达载体为改造
过的 pBI121 Vector。
1.1.3 工具酶及生化试剂 限制性内切酶、Taq
DNA 聚合酶及胶回收试剂盒购自天为时代生物公
司。IPTG 、DNA Maker DL2000 和 T4 DNA 连接酶等
均为大连宝生物公司产品。PCR 引物由上海英俊公
司或上海生物工程公司合成。DNA 回收试剂盒质粒
DNA 提取试剂盒为北京博大泰克公司产品。
1.2 方法
1.2.1 表达载体引物设计 根据测序结果得到的
Myb28 基因序列上的酶切位点和载体上的酶切位点，
设计了带酶切位点（BamH I+Sac I）的正义扩增引
物和反义扩增引物，正义序列扩增的上游引物为 :5-
GGATCCATGTCAAGAAAGCCGTGTTG-3; 下游引物
为 :5-GAGCTCTCAGAGGGAAT CATAATCCA-3，
反义序列扩增的上游引物为:5-GGATCCTCAGAGGG-
AATCATAATCCA-3; 下游引物 :5-GAGCTCATGTCA-
AGAAAGCCGTGTTG-3，由上海英俊生物工程公
司合成。内切酶选用 BamH I（GGATCC）和 Sac I
（GAGCTC）。
1.2.2 目的基因全长 cDNA 的分离 以稀释 5 000 倍
的测序质粒为模板，采用 Taq DNA polymeras 分别以
正义和反义扩增引物进行 PCR 扩增。
质粒 PCR 25 μL 体系如下：ddH2O 17.4 μL，10×
buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物Ⅰ 1 μL，引物Ⅱ 1 μL，
质粒模板 1 μL，rTaq酶 0.1 μL。
反应程序 ：94℃预变性 5 min，94℃变性 50 s，
52℃退火 50 s，72℃延伸 1 min 30 s，72℃后延伸 10
min；4℃保存 35 个循环。取 10 μL PCR 产物进行 1％
琼脂糖凝胶电泳分析，以检测是否有适当大小的的
条带，然后在 4℃保存 PCR 产物。
1.2.3 表达载体的构建 经限制性内切酶 BamH I+
Sac I 消化后的正义和反义 PCR 回收产物，从胶中回
收目的片段 ; pBI121 质粒也均用 BamH I+Sac I 酶酶
图 1 正反义真核表达载体构建示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期82
切，电泳回收大片段，回收的目的片段进行定向连
接。连接产物转化到感受态大肠杆菌E. coli DH5α中，
在含有 100 μg/mL 卡那霉素的 LB 平板上筛选阳性菌
落，碱法提取质粒。采用BamH I+Sac I双酶切的方法，
判断插人正义和反义片段的正确性。
1.2.4 拟南芥的遗传转化与鉴定 采用农杆菌渗透
转化法对 Myb28 基因缺失的拟南芥突变体（SA-
LK-136312）进行侵染，将待转化的突变体拟南芥种
子播于育苗基质中，使其正常生长至花蕾期，将含
有目的基因的农杆菌悬浮在包括 5% 蔗糖和 0.05%
Silwet L 277 的渗透培养液中，利用花序侵染法侵染
3 次。农杆菌侵染拟南芥的方法参照文献 ［5］。收到
的种子在含有抗生素（Kan 30 mg /L）的培养基上筛
选转基因阳性植株并提取 T1 代拟南芥转基因株系进
行基因组 PCR 鉴定。
2 结果
2.1 PCR 扩增目的片段
以稀释 5 000 倍的 Myb28 测序质粒为模板，用
正义和反义序列的扩增引物分别扩增到约 1 074 bp
的片段 （图2），PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，
切下目的条带，用胶回收试剂盒回收。
为模板。正义序列的 PCR 纯化产物经 Bam H I+Sac I
双酶切后，插入到经 BamH I+Sac I 双酶切的 pBI121
载体上，构建成为正义植物表达载体，定名为 PBI-
Myb28（+）。反义序列的 PCR 纯化产物经 BamH I+
Sac I 双酶切后，插入到经 BamH I+Sac I 双酶切的改
造过的 pBI121 载体上，构建成为反义植物表达载体，
定名为 PBI-Myb28（-）。
对重组质粒正义和反义表达载体 PBI-Myb28（+）
和 PBI-Myb28（-）分别用 BamH I+Sac I 双酶切进行
酶切鉴定，重组质粒的酶切产物电泳谱带与预期大
小一致，表明正义表达载体 PBI-Myb28（+）（图 4-A）
和反义表达载体 PBI-Myb28（-）（图 4-B）构建的正
确性。
M.DNA marker DL2000 ；1. 正义目的基因 ；2. 反义目的基因
图 2 Myb28正反义目的基因的扩增
2.2 Myb28克隆载体的酶切鉴定
将扩增到的正反义目的基因连接至克隆载体PM
D18-T simple Vector 上，用 BamH I+Sac I 双酶切，均
能得到与预期大小一致的片段，分别为 PMD-Myb28
（+）（图 3-A）和 PMD-Myb28（-）（图 3-B），表明目
的基因已插入到 PMD18-T simple Vector 载体上。
2.3 植物表达载体的构建
以重组质粒 PMD-Myb28（+）和 PMD-Myb28（-）
M.DNA marker DL2000 ；1.PMD-Myb28（+）；2.PMD-Myb28（-）
图 3 Myb28基因重组质粒 PMD-Myb28（+）和
PMD-Myb28（-）的酶切鉴定
M.DNA marker DL2000 ；1.PBI-Myb28（+）；2.PBI-Myb28（-）
图 4 Myb28基因真核表达载体 PBI-Myb28（+）和
PBI-Myb28（-）的构建
2.4 转基因植株的筛选
本试验将转化得到的拟南芥种子种于含有抗生
素（Kan 30 mg /L）的培养基上，5 d 左右开始出芽（图
5-a），当生长至 3-5 片真叶时（图 5-b），将生长绿
色且健康的苗移植进育苗基质中，25 d 左右便获得
2012年第3期 83任莉等 ：Myb28 基因表达载体的构建及拟南芥转化
了多株生长正常的拟南芥植株（图 5-c），初步认为
Myb28 基因已经被转入到拟南芥突变体中。
取食者或者通过吸引取食者的天敌而起间接保护作
用［13］。
硫苷的生物合成和降解过程受到转录因子、合
成基因、侧链修饰基因和降解基因等一系列基因的
编码调控。最近的研究表明，Myb 类转录因子参与
了植物花色素形成过程的调控，对果皮、果肉，甚
至叶片的着色都起到了重要作用。Sønderby 等［15］
研究表明 Myb 转录因子对硫苷的合成降解有很大
的影响。Myb28、Myb29 和 Myb76 基因过量表达的
拟南芥植株中脂肪族硫苷含量显著增加，而吲哚族
硫苷没有明显变化。Sønderby 等［16］最新研究显示
Myb28、Myb29 和 Myb76 转录因子还显著影响了拟
南芥中长链脂肪族硫苷和短链脂肪族硫苷的比例，
以及在植株不同部位的分布情况。Myb28 转录因子
则对参与脂肪族硫苷合成途径的基因，如 MAM1、
MAM3、CYP79F1、CYP79F2 和 CYP83A1 等具有特
异的激活作用［17］。
尽管硫苷合成分解分子生物学机理的研究已经
取得了很大的进展，但是主要都集中在模式植物拟
南芥或者国外某些重要蔬菜品种上，有关小白菜硫
苷合成降解的分子机制还未见报道。本试验基于硫
苷调控相关的Myb转录因子在小白菜中的相对滞后，
开展脂肪族硫苷相关转录因子 Myb28 正反义真核表
达载体的构建，并将正义表达载体成功转入到突变
体植物中以验证其功能，为深入理解小白菜硫苷合
成降解的分子机理，开展小白菜硫苷含量和组分的
调控奠定基础，对获得高营养价值、抗病虫的十字
花科蔬菜品种具有十分重要的意义。
4 结论
本试验基于 Myb 转录因子在小白菜硫苷调控研
究中的相对滞后，利用克隆分离到的 Myb28 基因，
构建获得脂肪族硫苷相关转录因子 Myb28 正反义真
核表达载体，并将正义表达载体成功转入突变体拟
南芥中，获得了转基因植株，经 PCR 鉴定正义表达
载体已成功整合到拟南芥基因组中。为进一步验证
该基因在小白菜脂肪族硫苷合成代谢中的分子调控
机理提供了材料。
参 考 文 献
［1］ Agrawal AA, Kurashige NS. A role for isothiocyanates in plant
2.5 转基因植株的分子检测
将构建好的正义表达载体转化农杆菌，通过农
杆菌介导，花絮侵泡法转化突变体拟南芥，获得了
大量的转基因植株。为了检测转基因是否成功，提
取表现卡那霉素抗性的 3 个转基因拟南芥株系和
一个拟南芥突变体（SALK-136312）株系的基因组
DNA 作为模板，通过 PCR 反应进行检测。3 个转基
因拟南芥株系皆扩增出目的条带（图 6）。结果表明
Myb28 基因序列已成功转入拟南芥突变体。
图 5 转基因拟南芥的抗性筛选
3 讨论
硫苷是和小白菜中风味物质形成及生理相关的
重要次生代谢物质，对小白菜品质有直接的影响。
由于硫苷的水解产物具有抗癌、抗病虫等生物功能，
因此相关的研究在国内外受到了很大的关注［6-12］。
研究均表明硫苷的水解产物异硫氰酸酯具有抑制病
毒复制的功能，而硫苷含量较高的拟南芥株系，能
明显抑制昆虫幼虫的发育［4, 13］，它们主要通过减少
昆虫体内总氧气的吸入和 CO2 的呼出，抑制糖酵解 -
克雷布斯循环，从而改变昆虫的新陈代谢能力，导
致昆虫生长缓慢甚至死亡［2, 14］，还可以直接拒食
M.DNA marker DL20000 ；CK. 拟南芥突变体 ；1-3. 转基因拟南芥
图 6 转基因拟南芥的基因组 PCR验证
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期84
resistance against the specialist herbivore Pieris rapae. Journal of
Chemical Ecology, 2003, 29: 1403-1415.
［2］ Bones AM, Rossiter JT. The myrosinase-glucosinolate system, its
organisation and biochemistry. Physiologia Plantarum, 1996, 97:
194-208.
［3］ Brader G, Mikkelsen MD, Halkier BA, Palva ET. Altering glucosino-
late profiles modulates disease resistance in plants. The Plant Jour-
nal, 2006, 46: 758-767.
［4］ Gigolashvili T, Yatusevich R, Berger B, et al. The R2R3-MYB tran-
scription factor HAG1/MYB28 is a regulator of methionine-derived
glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal,
2007, 51: 247-261.
［5］ Hopkins RJ, van Dam NM, van Loon JJA. Role of glucosinolates
in insect-plant relationships and multitrophic interactions. Annual
Review of Entomology, 2009, 54: 57-83.
［6］ Higdon JV, Delage B, Williams DE, Dashwood RH. Cruciferous
vegetables and human cancer risk: epidemiologic evidence and
mechanistic basis.Pharmacological Research, 2007, 55（3）:224-236.
［7］ Kim JH, Jander G. Myzus persicae（green peach aphid）feeding on
Arabidopsis induces the formation of a deterrent indole glucosinolate.
The Plant Journal , 2007, 49（6）: 1008-1019.
［8］ Kliebenstein DJ. Secondary metabolites and plant/environment
interactions: a view through Arabidopsis thaliana tinged glasses.
Plant Cell and Environment, 2004, 27（6）: 675-684.
［9］ Müller C. 2009. Role of glucosinolates in plant invasiveness. Phyto-
chemistry Reviews, 2009, 8（1）: 227-242.
［10］ Pracros P, Moreau R, Gourdoux L. Metabolic alterations induced
by ingested glucosinolates in yellow mealworm larvae（Tenebrio
molitor L.）.Animal Biology, 1992, 1:77-83.
［11］ Rada B, Hanusovska T, Drobnica L, Nemec P. Inhibition of
virusmultip lication by selected isothiocyanates. Acta Virol, 1971,
15（4）: 329-332.
［12］ Sønderby IE, Hansen BG, Bjarnholt N, et al. A systems biology
approach identifies a R2R3 MYB gene subfamily withdistinct and
overlapping functions in regulation of aliphatic glucosinolates. PLoS
ONE, 2007, 2（12）: e1322.
［13］ Sønderby IE, Burow M, Rowe HC, et al. A complex interplay of
three R2R3 MYB transcription factors determines the profile of
aliphatic glucosinolates in Arabidopsis. Plant Physiology Preview,
2010, 153:348-363.
［14］ Spak J. The effect of the glucosinolate sinigrin and of ally
isothiocyanate on the infectivity of turnip mosaic virus. Biologia
Plantarum, 1988, 30（6）:465-470.
［15］ Tierens KF, Thomma BP, Brouwer M, et al. Study of the role of
antimicrobial glucosinolate-derived isothiocyanates in resistance
of Arabidopsis to microbial pathogens. Plant Physiol, 2001, 125:
1688-1699.
［16］ 陈亚州 , 阎秀峰 . 硫代葡萄糖苷在植物 - 生物环境关系中的作
用 . 生态学报 , 2007, 27（6）:2584-2593.
［17］ 许红梅 , 张立军 , 刘淳 . 农杆菌蘸花法侵染拟南芥的研究 . 北
方园艺 , 2010（14）:143-146.
（责任编辑 狄艳红）