全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-07-20
基金项目 : 福建省农业科学院博士科研启动基金项目（闽农科政 [2010]245 号）, 福建省农业科学院院管项目（A2010-1）
作者简介 : 赖呈纯 , 男 , 博士 , 助理研究员 , 研究方向 : 园艺植物生物技术与遗传资源 ;E-mail:lccisland@163.com
葡萄 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化
赖呈纯 范丽华 谢鸿根 余亚白 郑铭西 谢福鑫
（福建省农业科学院农业工程技术研究所，福州 350003）
摘 要 : 采用正交设计 L9（34）对影响葡萄 ISSR-PCR 反应体系的 4 个因素（dNTP、Taq DNA 聚合酶、引物、模板 DNA）
在 3 个浓度水平上进行试验，并通过直观分析初步确定其反应体系 ；在此基础上，通过单因素试验探讨了 dNTP、Taq DNA 聚合
酶、引物、模板 DNA、退火温度及循环次数等因素或条件对葡萄 ISSR-PCR 扩增结果的影响，确定最佳反应水平。最终建立了葡
萄 ISSR-PCR 扩增的最佳反应体系 ：在 25 μL 的反应体系中，dNTP 浓度 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶的用量 0.5 U，引物浓度 0.4
mmol/L，DNA 模板用量 40 ng。反应程序 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 1 min，52℃退火 1 min，72℃延伸 1 min 30 s，40 次循环 ；
最后 72℃延伸 10 min，10℃保存。
关键词 : 葡萄 ISSR-PCR 正交设计 单因素试验 反应体系
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for
Grape（Vitis vinifera L.）
Lai Chengchun Fan Lihua Xie Honggen Yu Yabai Zheng Mingxi Xie Fuxin
（Institute of Agricultural Engineering and Technology，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350003）
Abstract: The ISSR-PCR（Inter-simple sequence repeat-Polymerase chain reaction product） amplification system for grape in three
levels of four factors（dNTP, Taq DNA polymerase, primer, DNA template） were investigated by using orthogonal design and was determined
preliminarily through the result direct analysis. On this basis, the research discussed effect of components to the PCR amplification, including
dNTPs, Taq DNA polymerase, primer, DNA template, annealing temperature and cycle number through ladder experiments. The suitable
ISSR-PCR reaction system for grape was established ultimately, namely 25 μL reaction system containing 0.2 mmol/L dNTP, 0.25 U Taq DNA
polymerase, 0.4 mmol/L primer, 40 ng DNA template. Amplification conditions were performed as initial DNA denaturation at 94℃ for 5 min,
followed by 40 cycles of 1 min denaturation at 94℃ , 1 min annealing at 52℃ and 1 min 30 s of extension at 72℃ with a final extension time at
72℃ for 10 min, preserved under 10℃ .
Key words: Grape ISSR-PCR Orthogonal design Single factor experiment Reaction system
近年来我国葡萄从北方向南方迅速发展。福建
省属于亚热带气候，年平均气温在 15.2-22.2℃之
间，无霜期长，有效积温高，有利于葡萄生长发育
和提早成熟［1］。随着栽培措施的改进和抗性品种
的应用［2-6］，极大地缓解了福建葡萄生产上的问题，
促使了福建葡萄产业的规模化生产。然而，随着福
建省葡萄产业的发展，各区域的葡萄品种交流频
繁，加上葡萄主要采用无性繁殖，导致同名异物或
同物异名现象较为普遍，又因葡萄种间杂交容易产
生一些中间型和过渡型杂种，给葡萄的分类鉴定带
来困难［7］，这种葡萄品种多而混杂的局面，不利
于福建葡萄产业的可持续发展。前人采用 RFLP、
RAPD、AFLP、SSR 和 ISSR 等分子标记技术进行
了葡萄的遗传多样性分析，很好地解决了传统分
类方法不能解决的一些问题［8-15］。目前，对福建
葡萄品种资源还未进行较大规模的分类和品种鉴
定的研究，严重制约了其葡萄产业的可持续发展。
简单重复间序列（ISSR）能反映出比 RFLP、SSR
和 RAPD 更丰富的多态性 , 并具有稳定性强、操作
简单、成本低等优点，已被广泛应用于物种亲缘关
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期160
系和遗传多样性研究、DNA 指纹图谱的建立、遗
传图谱的构建、基因定位及分子标记辅助育种等
研究［16-18］。但是，对于葡萄 ISSR-PCR 反应体系
的建立和优化研究鲜见报道，由于该方法是基于
PCR 的一种标记，其反应条件同样易受到 PCR 反
应各因素的影响。为了确保葡萄 ISSR 分析结果的
可靠性和重复性，本研究通过反应参数正交试验设
计和单因素试验相结合的方式对葡萄 ISSR-PCR 反
应体系进行优化，以期为利用 ISSR 分子标记对福
建葡萄种质资源鉴定、遗传多样性分析等研究提供
技术平台。
1 材料与方法
1.1 材料
本 研 究 以 2011 年 4 月 取 自 福 建 省 建 阳 市 葡
萄 资 源 圃 的 葡 萄 为 试 验 材 料 用 于 DNA 提 取， 并
以‘维多利亚’葡萄来建立 ISSR-PCR 优化反应体
系。试验采用加拿大哥伦比亚大学（University of
BritishColumbia，UBC） 所 设 计 的 ISSR 引 物， 并
由上海生工合成，根据预试验结果，本研究选用
UBC815（（CT）8G）作为葡萄 ISSR-PCR 反应体系的
建立和优化的引物 ；试验所用 dNTP 和 Taq DNA 聚
合酶等购自于天根生化科技有限公司 ；其他药品为
国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法
提 取 葡 萄 基 因 组 DNA［19］， 采 用 Eppendorf 的 Bio
Photomenter plus 核酸蛋白质测定仪测定所提 DNA 的
浓度和纯度，用 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
的质量，并将其稀释至 40 ng/μL，置于 -70℃备用。
1.2.2 反应体系正交试验设计与 PCR 扩增 葡萄
ISSR-PCR 反应体系建立和优化采用正交设计 L9（34），
对参与 ISSR-PCR 反应的 dNTP、Taq DNA 聚合酶、
引物和模板 DNA 等 4 个因素在 3 个水平上进行试验，
共 9 个处理，每处理 3 次重复，按表 1 中的数据加
样，反应体系总体积为 25 μL。10×PCR Buffer（含
15 mmol/L MgCl2）采用说明书推荐的使用量。
PCR 反 应 在 Biometra 梯 度 PCR 仪 上 进 行， 扩
增程序采用参考文献［10,13,15］和预试验的结果进
行，其程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 1 min，
52℃退火 1 min，72℃延伸 1 min 30 s，40 个循环 ；
最后 72℃延伸 10 min，10℃保存。PCR 产物用 2.0%
琼脂糖凝胶于 4 V/cm 电场下电泳 60 min，电泳结束
后琼脂糖凝胶经胶 EB（0.5 μg/L）染色，于 UVP 的
GelDoc-It Ts Imaging System 凝胶成像系统进行拍照
分析。试验设 3 次重复。9 个处理的电泳结果采用
可识别条带数并结合条带亮度和背景清晰程度，进
行赋值 ；用 DPS 软件进行数据分析。
处理组合 因素dNTP（mmol/L） Taq DAN 聚合酶（U/25 μL） 引物（mmol/L） 模板 DNA（ng/25 μL）
1 0.05 0.25 0.1 10
2 0.05 0.75 0.4 40
3 0.05 1.5 1.0 60
4 0.2 0.25 0.4 60
5 0.2 0.75 1.0 10
6 0.2 1.5 0.1 40
7 0.5 0.25 1.0 40
8 0.5 0.75 0.1 60
9 0.5 1.5 0.4 10
表 1 ISSR-PCR 反应体系的正交试验设计
1.2.3 反应体系中单因素浓度的优化 在正交试验
结果确定的较佳反应体系组合的基础上，分别对
dNTP、Taq 酶、引物和模板 DNA 浓度等 4 个因素进
行梯度试验，筛选其合适的使用浓度。在 dNTP 浓
度试验中设 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L 6
个梯度处理；Taq 酶浓度梯度设 0.25、0.5、0.75、1.0、
1.25、1.5 U/25 μL 6 个处理；引物浓度设 0.1、0.2、0.4、
0.6、0.8、1.0 mmol/L 6 个梯度处理 ；模板 DNA 浓度
2012年第2期 161赖呈纯等 ：葡萄 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化
设 10、20、30、40、50、60 ng/25 μL 6 个梯度处理。
其反应程序与正交试验相同。
1.2.4 ISSR-PCR 运行中退火温度的优化 在前人
的研究中，ISSR-PCR 反应温度有一定差异［10,13,15］，
为 了 确 定 合 适 的 葡 萄 ISSR-PCR 运 行 温 度， 试 验
在 36.5-56℃之间进行了筛选，由 PCR 仪自动生成
了 11 个温度梯度，分别为 36.5、37.9、40.0、42.4、
44.8、47.2、49.6、51.9、54.1、55.5、56℃。其反应
体系和程序为上述试验后的最佳条件进行。
1.2.5 ISSR-PCR 运行中循环次数的优化 在诸多植
物 ISSR-PCR 运行中，循环次数也不尽相同，为了
确定合适本研究所建立的葡萄 ISSR-PCR 反应体系
运行循环次数，试验设 30、35、40、45 次 4 个处理
进行优化。其反应体系和程序为上述试验后的最佳
条件进行。
2 结果
2.1 ISSR-PCR反应体系正交试验设计的直观分析
葡萄 ISSR-PCR 反应体系正交试验电泳结果见
图 1-A。在正交试验结果分析中，把电泳结果的条
带数量最多、清晰度高和背景低的最佳产物记为 9
分，依此类推，最差的记为 1 分，9 个处理 3 次重
复的分数依次为 7、7、7，4、5、4，3、2、3，9、9、9，8、8、
8，6、6、6，2、3、2，1、1、1，5、4、5，将其用
DPS 软件进行极差和方差分析，结果见表 2 和表 3。
A. 正交试验 PCR 产物电泳结果，1-9. 不同处理组合，M. 标准分子量（GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder，下同）；B. 不
同 dNTP 浓度对葡萄 ISSR-PCR 扩增效果的影响，1-6. 从低到高的不同浓度水平（下同）；C. 不同 Taq DNA 聚合酶浓
度对葡萄 ISSR-PCR 扩增效果的影响 ；D. 不同引物浓度对葡萄 ISSR-PCR 扩增效果的影响
图 1 葡萄 ISSR-PCR 反应体系建立和优化的 PCR 扩增结果
表 2 正交设计试验极差分析
结果 因素dNTP Taq 酶 引物 模板 DNA
K1 42 55 42 59
K2 69 40 54 38
K3 24 40 39 38
k1 4.7 6.1 4.7 6.6
k2 7.7 4.4 6.0 4.2
k3 2.7 4.4 4.3 4.2
R 4.5 1.5 1.5 2.1
表 3 正交设计试验方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F 值
dNTP 114.0000 2.0000 57.0000 384.7500**
Taq 酶 16.6667 2.0000 8.3333 56.2500**
引物 14.0000 2.0000 7.0000 47.2500**
模板 DNA 32.6667 2.0000 16.3333 110.2500**
误差 2.6667 18.0000 0.1482
Ki 为每个因素同一水平下的试验值之和 ；ki 为每一因素水平下的数据平均
值 ；R 为同一因素不同水平间平均值的极差。
** 表示差异达到极显著水平
从表 2 的极差分析和表 3 的方差分析结果可以
看 出，dNTP、Taq DNA 聚 合 酶、 引 物 和 模 板 DNA
浓度对 ISSR-PCR 反应体系都存在极显著影响 ；同时
极差 R 反映了每个因素对 ISSR-PCR 反应的影响程
度，R 值越大，表明该因素对试验结果的影响越显
著，4 个因素对反应体系影响从大到小的顺序依次
为 dNTP、模板 DNA 浓度、Taq DNA 聚合酶、引物。
通过试验处理因素各水平间差异显著性 SSR
检验分析，得出的 ISSR-PCR 反应中 4 个因素最佳
理 论 反 应 水 平 组 合 为 dNTP 0.2 mmol/L、Taq DNA
聚 合 酶 0.25 U/25 μL、 引 物 0.4 mmol/L、 模 板 DNA
10 ng/25 μL，该组合没有在正交表中体现出来，但
最接近分值最高的第 4 个处理，只是模板 DNA 的浓
度不同。这个分析结果说明，在进行正交试验设计
时，可不经直观分析，而根据试验的电泳结果直接
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期162
对 ISSR-PCR 反应体系进行选择，也能获得合适的
反应体系。
2.2 ISSR-PCR反应体系的单因素试验分析
2.2.1 dNTP 浓 度 对 ISSR-PCR 的 影 响 不 同 dNTP
浓度下葡萄 ISSR-PCR 反应的电泳结果见图 1-B。当
dNTP 浓度为 0.05-0.1 mmol/L 时，条带数和亮度均
随浓度增加而上升；在 0.1-0.4 mmol/L 时条带数不变，
但亮度加强，其中以 0.2 mmol/L 时的效果最佳，0.4
mmol/L 时条带太亮并有拖尾，影响分辨，同时一些
条带变弱，趋于消失 ；当 dNTP 浓度继续增加至 0.5
mmol/L 时，没有扩增出带数。这说明葡萄 ISSR-PCR
反应体系的 dNTP 适合浓度在 0.1-0.4 mmol/L 之间，
dNTP 作为 Taq DNA 聚合酶底物，浓度过低会导致
PCR 产物产率的下降，过高不但造成浪费，而且会
降低 Mg2+ 的有效浓度和产生错误掺入而影响反应的
结果。因此，选取 0.2 mmol/L 作为葡萄 ISSR-PCR 反
应体系中 dNTP 的最适浓度。
2.2.2 Taq DNA 聚 合 酶 浓 度 对 ISSR-PCR 的 影
响 Taq DNA 聚合酶是影响 PCR 反应的一个关键因
素， 其 在 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 U/25 μL
浓度水平下的葡萄 ISSR-PCR 反应的电泳结果见图
1-C。从图 3 可以看出，Taq DNA 聚合酶在 6 个浓度
水平下反应的条带数差异不显著，但背景和亮度存
在较大的差异，在 0.25-0.5 U/25 μL 时，条带的亮度
急剧上升，0.5-1.5 U/25 μL 时，条带亮度逐渐下降，
其中以 0.5 U/25 μL 时的效果最佳，这比正交试验组
合中使用 0.25 U/25 μL 高，从图中可以看出条带更
清晰，背景更好。因此，在葡萄 ISSR-PCR 反应体系中，
以 0.5 U/25 μL 作为最佳的使用浓度。
2.2.3 引物浓度对 ISSR-PCR 的影响 不同引物浓度
下 PCR 扩增的结果见图 1-D。从图中可以看出，当
引物浓度为 0.1 mmol/L 时，会扩增出 3 000 bp 的条带，
而小于 1 500 bp 的条带变得很弱或消失，说明在该
引物浓度下，PCR 有效扩增大大降低，并出现错误
扩增 ；当引物浓度在 0.2-1.0 mmol/L 时，扩增出的
条带都为 7 条，虽然小片段的条带随引物浓度的升
高而逐渐变亮，但大片段条带的亮度却降低。考虑
条带数、背景亮度和避免浪费的问题，以 0.4 mmol/L
作为葡萄 ISSR-PCR 反应体系的最适引物浓度，这
与正交试验最优组合的引物浓度相同。
2.2.4 模 板 DNA 浓 度 对 ISSR-PCR 的 影 响 葡 萄
ISSR-PCR 反 应 体 系 在 10、20、30、40、50、60
ng/25 μL 的 6 个模板 DNA 浓度下 PCR 扩增结果见图
2-A。
A. 不同模板 DNA 浓度对葡萄 ISSR-PCR 扩增效果的影响；B. 不同退火温度对葡萄 ISSR-PCR 扩增效果的影响；C. 不
同循环数对葡萄 ISSR-PCR 扩增效果的影响
图 2 葡萄 ISSR-PCR 反应体系优化的 PCR 扩增结果
从 图 2-A 可 以 看 出， 模 板 DNA 浓 度 在 10-60
ng/25 μL 时，扩增出相同的条带，只是随浓度增加，
条带变得更亮，尤其是弱带变得更明显，而当浓度
50 ng/25 μL 以上时，条带拖尾明显加重。因此，本
试验以 40 ng/25 μL 作为葡萄 ISSR-PCR 反应体系中
最佳模板 DNA 浓度。
2.3 退火温度对ISSR-PCR的影响
11 个退火温度下 PCR 扩增的结果见图 2-B。从
图中可以看出，退火温度对葡萄 ISSR-PCR 反应的
影响很大。当退火温度小于 49.6℃时，扩增的效率低，
2012年第2期 163赖呈纯等 ：葡萄 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化
条带少且暗，并出现非特异性的杂带 ；当退火温度
在 49.6-54.1℃之间时，扩增出的条带为 7 条，其中
以 51.9℃扩增的结果最好 ；当温度大于 54.1℃时，
1 500 kD 的带消失，并随温度升高，有的条带亮度
加强，有的带亮度减少。这说明退火温度太高或太
低都不适合葡萄 ISSR-PCR 的扩增，退火温度太低
会出现杂带，特异性差，条带弱，背景深 ；退火温
度过高，会导致引物与模板结合差，电泳条带弱，
甚至没有扩增。就引物 UBC815 来说，适合的退火
温度在 49.6-54.1℃之间，这个温度范围与 Alizadeh
等［15］、Monte-Corvo 等［10］和吴子龙等［13］报道的相似。
因此，根据本试验 PCR 扩增的结果，确定 52℃为葡
萄 ISSR-PCR 的最佳退火温度。
2.4 循环次数对ISSR-PCR的影响
合适的循环次数是获得良好的 PCR 扩增结果的
保证。一般来说，在反应体系不变的情况下，PCR
扩增的产物会随循环次数的增加而增加。以选出的
葡萄 ISSR-PCR 反应体系最优组合和其他各项参数不
变的情况下，对 30、35、40、45 个循环下 PCR 扩
增结果进行分析 （图 2-C），发现随着循环次数的增
加，扩增产物的量也增多。相比之下，40 个循环得
到的条带强弱合适，清晰可辨，将其设为葡萄 ISSR-
PCR 反应最佳循环次数。
2.5 ISSR-PCR反应体系稳定性的检测
根据上述葡萄 ISSR-PCR 反应体系建立和优化
的试验结果，采用最佳反应体系，对 24 个不同的葡
萄品种（系）进行 PCR 扩增（图 3），可以看出均能
扩增出较清晰的条带且稳定性很好，表明通过优化
试验筛选出的反应体系稳定和重复性好，适合于葡
萄 ISSR-PCR 反应。
图 3 24 个葡萄品种（系）ISSR-PCR 扩增结果
3 讨论
ISSR 不但具备了 RAPD 的简便及易操作性，而
且更可靠，重复性高，每个引物能产生更高的多态
性 ；同时 ISSR 与 RFLP、AFLP 相比，具有更快捷、
稳定、成本较低、DNA 用量小、安全性较高的特点［18］。
因此，近年来在植物的种质鉴定、遗传多样性检测、
亲缘关系分析和遗传图谱构建等方面得到广泛应用。
但 ISSR-PCR 反应体系同样受到 dNTPs、Taq DNA 聚
合酶、引物、DNA 模板用量以及退火温度等因素的
影响，虽然前人已有利用 ISSR-PCR 对葡萄的多态
性进行研究，但其反应体系和反应条件存在较大差
异［10,13,15］，同时建立稳定的葡萄 ISSR-PCR 反应体系
的研究还鲜有报道。利用正交试验设计对葡萄 ISSR-
PCR 反应体系的 4 个因素（dNTPs、Taq DNA 聚合酶、
引物、模板 DNA）在 3 个水平上进行试验，同时结
合单因素试验进行优化，不仅克服了正交试验会遗
漏好的结果的缺点，也可以避免单因素试验顾此失
彼、试验规模巨大的缺点。这从本试验 Taq DNA 聚
合酶浓度优化的结果可以看出，在单因素试验中使
用的 Taq DNA 聚合酶浓度比正交试验高，获得了更
亮的条带和清晰的背景，这说明在正交试验的基础
上结合单因素的试验，可以获得更佳的葡萄 ISSR-
PCR 反应体系组合。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期164
4 结论
根据本试验的结果，最终筛选出了葡萄 ISSR-
PCR 的最佳的稳定的反应体系，即 25 μL 的反应体
系中，除 10×PCR Buffer（含 15 mmol/L MgCl2）采
用 说 明 书 推 荐 的 使 用 量 2.5 μL 外，dNTPs 浓 度 为
0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶的用量为 0.5 U，引物
浓度为 0.4 mmol/L，DNA 模板浓度为 40 ng。扩增程
序 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 1 min，52℃退火
1 min，72℃延伸 1 min 30 s，40 个循环 ；最后 72℃
延伸 10 min，10℃保存。不同的引物退火温度可能
有所差异，可根据需要适当调整。通过反应体系稳
定性检测表明，本试验建立的葡萄 ISSR-PCR 反应
体系稳定可靠，为进一步开展葡萄种质资源、遗传
多样性、品种鉴定和育种等各方面的研究奠定基础。
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（责任编辑 马鑫）