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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):201-206
近 50 年来，核苷类似物被广泛用于治疗病毒
感染及肿瘤类疾病，其中已有超过 9 种抗代谢核苷
类抗肿瘤药物和 25 种核苷类抗病毒药物经 FDA 批
准上市［1］。核苷类似物是由人工改造天然核苷的糖
基或碱基而合成的核苷类衍生物，由于和天然核苷
结构相似，在生物体内会和天然核苷竞争，通过抑
制相关聚合酶与核酸结合等方式干扰核酸的复制合
成［2］，达到治疗肿瘤类疾病或抑制病毒增殖的目的。
目前核苷类似物的工业合成方法主要是传统的
化学合成法和生物转化法。化学合成反应步骤多，
反应条件苛刻，产物纯度低［3］；而生物转化法条件
温和，成本低，应用较广泛。早期的生物转化法只
能用来生产少数天然核苷 ；近年采用较多的生物转
化法是酶法合成，通过将参与核苷代谢通路的酶重
收稿日期 ：2015-03-31
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21176138，21476124）
作者简介 ：王洁，女，硕士，研究方向 ：生物转化及生物催化 ；E-mail ：wangjie08beijing@163.com
通讯作者 ：王洪钟，男，博士，副教授，研究方向 ：生物转化及生物催化 ；E-mail ：hzwang@mail.tsinghua.edu.cn
基于酵母表面展示技术的胸苷磷酸化酶全细胞催化剂的
构建
王洁  余磊  杨东  李婕  王洪钟
（清华大学生命科学学院，北京 100084）
摘 要 ： 胸苷磷酸化酶（TP）在核苷类代谢通路中发挥重要作用，可催化生成多种核苷类似物。构建了 TP 的酵母表面展示
系统作为全细胞催化剂。从大肠杆菌 K12 菌株中克隆编码 TP 的 deoA 基因，利用酵母表达质粒 pKFS 构建重组质粒，电击转化毕
赤酵母 GS115 菌株。高拷贝阳性转化子经甲醇诱导 96 h 后，免疫荧光结果显示 TP 在酵母细胞表面成功展示。利用 β- 胸苷为底物，
重组酵母细胞作为全细胞催化剂，经 HPLC 检测，结果表明展示在酵母表面的 TP 有催化活性，可以催化 β- 胸苷生成产物胸腺嘧啶。
关键词 ： 胸苷磷酸化酶 ；全细胞催化 ；毕赤酵母 ；表面展示
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.032
Construction of Pichia pastoris Surface Display Technology as Whole-
cell Biocatalyst for Thymidine Phosphorylase
WANG Jie YU Lei YANG Dong LI Jie WANG Hong-zhong
（School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084）
Abstract: Thymidine phosphorylase（TP）extensively involves in nucleoside metabolism and catalyzes the formation of many
nucleoside analogs（NA）. A yeast cell surface display system for TP was firstly constructed in this study as whole-cell biocatalyst. A deoA
gene encoding TP was cloned from Escherichia coli K12 strain and inserted into the yeast expression vector pKFS. Recombinant vector was
linearized and electro-transformed into Pichia pastoris GS115 cells. High copy transformant was induced by methanol for 96 h, and the results of
immunofluorescence indicated that TP successfully displayed on the surface of P. pastoris. β-thymidine was used as substrate and recombinant
GS115 cells as whole-cell biocatalyst, HPLC analysis demonstrated that TP on the surface of P. pastoris had catalytic activity, and catalyzed the
production from β-thymidine to thymine.
Key words: thymidine phosphorylase ；whole-cell catalysis ；Pichia pastoris ；surface display
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1202
组转化到大肠杆菌中进行诱导表达，经过酶的纯化
固定等方式来催化核苷类似物的合成［4］。本课题首
次采用了一种新型生物转化方法，即开发于 20 世纪
90 年代的酵母表面展示法［5］，来研究核苷类似物的
生物酶催化。酵母表面展示法无需酶的纯化固定，
便于遗传改造。它通过表达不同的锚定蛋白，可以
将多种外源蛋白定位在酵母细胞壁上，利用全细胞
作为催化剂进行生物催化过程，有可以反复多次利
用、成本低的优点，已有报道成功利用酵母表面展
示技术来展示 a-半乳糖苷酶［5］、糖基转移酶［6］和
脂肪酶［7］等酶，该方法也被广泛应用于生物催化剂、
活疫苗、蛋白质文库筛选和癌症诊断等领域。
核苷类似物的生物催化法常用的酶包括 N-脱氧
核糖转移酶和核苷磷酸化酶。核苷磷酸化酶包括胸
苷磷酸化酶（TP）、尿苷磷酸化酶（UP）和嘌呤核
苷磷酸化酶（PNP），通过两步反应可逆地催化核苷
（或脱氧核苷）生成核糖 -1- 磷酸和碱基。本实验所
研究的 TP（EC 2.4.2.4）最先由 Schwartz 于 1978 年
在 E. coli K12 中克隆纯化［8］。哺乳动物来源的 TP
同时可作为血管生成因子，在肿瘤组织中有过表达
现象［9］。本研究旨在通过构建 TP 的毕赤酵母表面
展示系统，并作为全细胞催化剂，催化 β-胸苷转化
为胸腺嘧啶的反应。
1 材料与方法
1.1 材料
pKFS 质粒和毕赤酵母 GS115 菌株由华南理工
大学的林影教授赠送，E. coli K12 菌株由本实验保存，
E. coli DH5α 和 pMD19-T 质粒购自 TaKaRa 公司。
限制性内切酶、T4 连接酶和 4× 蛋白质 SDS
PAGE 上 样 缓 冲 液（40 mmol/L Tris-HCl pH8.0，
200 mmol/L DTT，4% SDS，40% Glycerol，0.032%
Bromophenol Blue）均购自 TaKaRa 公司，PCR 产物
回收试剂盒、质粒小提试剂盒和 DNA trans2K Plus
Marker 购自 TransGen 公司，酵母基因组 DNA 提取
试剂盒购自康为世纪，鼠源抗 flag 单抗、HRP 标记
的羊抗鼠二抗和 Alexa Fluor 488 标记的羊抗鼠二抗
均购自中杉金桥公司，胸腺嘧啶、β-胸苷（HPLC 级）
购自大连美仑公司，基因测序和引物合成由睿博兴
科公司完成。
1.2 方法
1.2.1 重 组 质 粒 的 构 建 实 验 所 用 引 物 见 表 1。
pKFS 质粒由林影教授改造 pPIC9K 质粒得到，pKFS
带有絮凝素 Flo1 蛋白的 N 端絮凝功能结构域（874
aa，Flo1p short chain，缩写为 FS）锚定系统［10］。为
构建灵活度更高的 FS-TP 融合蛋白，本研究设计了
一段（G4S）3 蛋白 linker
［7，11］，加到正向克隆引物
deoA-pKFS-F 上，随后是 deoA 基因的 5 端序列，为
保证融合蛋白的完整表达，序列的起始密码子被移
除。为便于检测外源蛋白，在 deoA 基因下游加入了
编码 flag 标签（氨基酸序列为 DYKDDDDK）的核苷
酸序列，在设计下游引物时去掉了 deoA 基因的 3
端序列的终止密码子。
deoA 基因 PCR 产物连到 pMD19-T 质粒上进行
测序。利用 Mlu I 和 Not I 内切酶双酶切 pMD19-T-
deoA 和 pKFS 质粒，将 deoA 基因插入 Flo1 基因的
下游，所得重组质粒为 pKFS-LA，重组质粒转化到 E.
coli DH5α 中，在氨苄抗性的 LB 板上涂布培养，利
用 deoA-pKFS-F1、deoA-pKFS-R1 引物进行菌落 PCR
来筛选阳性克隆。
表 1 实验所用引物
引物 序列（5-3） 酶切位点
deoA-pKFS-F CCGACGCGTGGTGGAGGAGGTTCTG-
GTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGTGG-
ATCTTTTCTCGCACAAGAAATTATT
Mlu I
deoA-pKFS-R ATTGCGGCCGTTACTTACTTATCGTC-
GTCATCCTTGTAATCTTCGCTGATAC-
GGCGATAGA
Not I
deoA-pKFS-F1 CGACGCGTGGTGGAGGAGGTTCTGGT Mlu I
deoA-pKFS-R1 ATTGCGGCCGCTTACTTATCGTCGTC Not I
5AOX1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC /
3AOX1 GCAAATGGCATTCTGACATCC /
FS-F CACAGAGGCGTGCTTACCAG /
FS-R TCCACCCCATGGCTTGATAC /
波浪线部分 ：编码 linker 的核苷酸序列 ；虚线部分 ：编码 flag 标签的核苷
酸序列 ；下划线部分是酶切位点
1.2.2 重 组 质 粒 转 化 GS115 和 重 组 转 化 子 的 筛
选 制备 GS115 酵母细胞的感受态，重组质粒经
Sal I 线性化后，利用电击仪（Bio-Rad）进行电击，
转化到 GS115 酵母细胞。电转参数为 1.5 kV，2 ms。
2016,32(1) 203王洁等：基于酵母表面展示技术的胸苷磷酸化酶全细胞催化剂的构建
转化子涂布到 MD 板培养 6-7 d 后，用 MD 液体培养
基冲洗培养皿，洗脱下来的酵母悬液分别涂布到含
1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL G418 抗 生 素 的 MD
平板上，培养 5-6 d。挑取不同 MD 板的阳性单克隆
扩大培养后提取基因组，进行基因组 PCR 鉴定。
1.2.3 胸 苷 磷 酸 化 酶 的 诱 导 表 达 及 免 疫 荧 光 检
测 采用两步法诱导 GS115 表达外源蛋白。GS115
野生菌株和经过验证的酵母转化子 GS115-LA 接种
到 BMGY 培养基培养至 OD 为 2-6，离心后分别用
BMMY 培养基重悬至 OD 为 1 左右，取 2 mL 细胞作
为诱导 0 点 4℃保存，之后加入 1% 的甲醇于 20℃、
200 r/min 进行诱导，培养 7 d，每隔 24 h 取样。
取 培 养 96 h 的 1 mL GS115、GS115-LA 细 胞
离心后，用 1×PBS（pH7.0）洗 3 次，然后用含 1
mg/mL BSA、2 mL 鼠源抗 flag 单抗的 1×PBS 在室温
下低速振荡孵育 2 h，孵育结束后用 1×PBS 洗 3 次，
用含 1 mg/mL BSA、1 mL Alexa-Fluor 488 标记的羊抗
鼠二抗的 1×PBS 在黑暗环境下振荡孵育 1 h。1×PBS
洗涤 3 次后，用 GE 的 DeltaVision 高分辨率成像系
统分别检测 GS115 和 GS115-LA 细胞的荧光。
1.2.4 Western blot 检 测 胸 苷 磷 酸 化 酶 的 诱 导 表
达 准 备 1 mL 样 品， 用 破 壁 缓 冲 液 室 温 处 理 30
min， 离 心 后 加 入 20 mL 4× 蛋 白 SDS-PAGE 上 样
buffer 和 60 mL 去离子水重悬，煮沸 10 min 后离心，
取 20 mL 上清上样，进行 SDS-PAGE 电泳。电泳结
束后，用 Bio-Rad 转膜仪将蛋白转移到 PVDF 膜上。
转膜结束后，PVDF 膜用 5% 奶粉的 TBST 封闭 2 h，
随后加入 1 mL 单抗（1∶500）室温孵育 2 h，TBST
洗 3 次 ；膜 放 入 5 mL 封 闭 液， 加 入 1 mL HRP 标
记的羊抗鼠二抗室温振荡孵育 1 h，结束后用 TBST
洗 涤 3 次。 用 增 强 型 HRP-DAB 底 物 显 色 试 剂 盒
（TIANGEN）对 PVDF 膜进行显色。
1.2.5 HPLC 检测胸苷磷酸化酶的催化活性 配制
不同浓度 β-胸苷和胸腺嘧啶的标准品，分别制定标
准曲线，以 0.5 mL 诱导 96 h 的 GS115-LA 细胞作为
全细胞催化剂，GS115 细胞作为对照，用 50 mmol/L
PBS（pH7.5） 缓 冲 液 配 制 含 30 mmol/L 胸 苷 的 10
mL 反应体系，50℃振荡 2 h，进行催化反应。反应
样品 20 倍稀释后用 Waters 600E 高效液相色谱仪检
测反应结果。检测条件为 ：紫外检测波长 254 nm，
柱 温 25℃， 色 谱 柱 PLATISILTM ODS C18（5 mm，
250×0.46 mm），流动相乙腈∶水 =10∶90，进样量
10 mL，流速 1 mL/min。
2 结果
2.1 deoA基因重组质粒的构建及高拷贝转化子的
筛选
编码 TP 的 deoA 基因（EU275208.1）开放阅读
框为 1 323 bp，编码 439 个氨基酸，微生物来源的
TP 大小约 47 kD。本实验利用了 touch down PCR 技术，
设置退火温度由 70℃梯度降落至 60℃，将 linker 和
flag 序列分别加到 deoA 基因的上下游。
图 1-A 显示了约 1 392 bp 的降落 PCR 产物条带，
测序结果证实重组质粒上 E. coli K12 来源的 deoA 基
因序列和 NCBI 数据库已有序列一致，deoA 基因上
下游分别有 linker 和 flag 的核苷酸序列。
图 1-B 为不同浓度 G418-MD 板上的酵母转化子
基 因 组 以 deoA-pKFS-F1、deoA-pKFS-R1 为 引 物 的
PCR 结果。为降低假阳性的影响，根据 FS 部分片段
设计了 FS-F、FS-R 引物。以图 1-B 中的阳性克隆对
应的基因组为模板，用 pPIC9K 通用引物 5 AOX1、
3AOX1 引物和 FS-F、FS-R 引物分别进行 PCR，鉴
定 结 果 如 图 1-C、D。FS 片 段 对 应 的 基 因 序 列 为
2 622 bp，FS-deoA 基因序列约 4 024 bp。PCR 产物
经测序，未出现移码突变。根据 PCR 结果，选出了
拷贝数较高的 5 mg/mL G418-MD 板上的酵母转化子，
进行后续诱导表达融合蛋白的实验。
2.2 免疫荧光检测酵母
取诱导 96 h 的酵母转化子和野生酵母做免疫荧
光检测（FITC，激发波长 488 nm），图 2-A 显示酵
母转化子在 AlexaFluor 488 荧光下被标记为绿色，部
分野生酵母细胞有微弱的自荧光。结果表明 Flo1 蛋
白 N 端亚基可以作为表面展示的锚定蛋白，带有
flag 标签的 TP 被成功锚定在细胞壁上，呈不均匀的
分布状态。
2.3 Western blot检测融合蛋白的诱导表达
将不同诱导时间点的酵母转化子破壁，提取细
胞壁蛋白做 Western blot。Western blot 结果（图 3）
证实毕赤酵母在甲醇诱导的第 3、4 天是外源蛋白表
达关键期，表达量相对较高。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1204
E. coli 来源的 TP 为 47 kD，FS-TP 融合蛋白共
有 1 338 aa，理论分子量大小约为 141 kD，而图 3
所检测到的蛋白条带约 70 kD，与理论预测不太相符。
这种情况在其它文献中也有报道［12，13］，酵母细胞在
翻译表达外源蛋白时，若出现连续两个或两个以上
的碱性氨基酸相邻的结构，这一结构很容易被一些
酵母本身表达的蛋白酶如 Kex2 切断，导致外源蛋白
不完整。经过序列分析，融合蛋白存在一处“RKKR”
结构，若经 Kex2 蛋白酶切割会得到大小为 65 kD 左
右的融合蛋白，经过酵母的翻译后修饰如糖基化等
过程，可能导致表观分子量呈现为 70 kD 左右 ；另
一方面，毕赤酵母表达分泌蛋白的机制比较复杂，
酵母自身分泌的胞外酶以及细胞裂解后释放的胞内
酶，或破壁过程中的一些处理如超声等也许会导致
外源蛋白降解。融合蛋白表观分子量变低的原因还
需要进一步研究。
1B
A 1 M C M 1 2 3 4 D 1 2 M bp
5000
3000
2000
1000
750
500
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M
（A）1 ：降落 PCR 产物条带，约 1 392 bp ；（B）1-6 ：5 mg/mL G418-MD 板上的阳性克隆基因组 PCR ；7-11 ：1 mg/mL G418-MD
板上的阳性克隆基因组 PCR ；12-17 ：2.5 mg/mL G418-MD 板上的阳性克隆基因组 PCR ；（C）1、2、3、4 ：分别是以 B 图中 2、3、
12、15 对应的基因组为模板，5 AOX，3 AOX 引物 PCR 的结果 ；（D）1、2 ：分别是以 C 图中 1、3 泳道对应的基因组为模板，
以 FS-F，R 引物 PCR 的结果 ；M ：trans2K plus DNA marker
图 1 deoA 序列的 PCR 扩增和阳性酵母转化子鉴定
A B
C D
13 μm 13 μm
13 μm 13 μm
A、B ：GS115-LA 转化子的荧光和明场照片 ；C、D ：GS115 野生菌株的荧光
和明场照片
图 2 酵母的免疫荧光检测结果
1 2 3 4 5 6 7 8 M kD
100
70
55
1、2、3 ：分别诱导 96 h、120 h、144 h 的酵母转化子 GS115-LA 样品 ；4 ：
诱导 96 h 的野生 GS115 的细胞壁蛋白对照；5、6、7、8：分别诱导 12 h、24 h、
48 h、72 h 的酵母转化子 GS115-LA 样品
图 3 融合蛋白的表达分析
2016,32(1) 205王洁等：基于酵母表面展示技术的胸苷磷酸化酶全细胞催化剂的构建
2.4 TP的催化活性检测
图 4 为反应体系稀释 20 倍后的 HPLC 检测结果，
出现了产物胸腺嘧啶的色谱峰，以 GS115 原始菌株
做对照的反应体系则未检测到产物峰的出现。计算
得 β-胸苷的转化率为 7.5%。胸腺嘧啶和胸苷标准品
的保留时间分别是 7.079 min 和 9.692 min。分别在
波长为 264.1 nm 和 266.5 nm 处有最大吸收峰，图 4
中的两个峰对应的波长分别与胸腺嘧啶和胸苷的标
准品相一致，保留时间分别是 7.761 min 和 10.444
min。
端，使 TP 蛋白 C 端游离。微生物来源的 TP 为同源
二聚体，每个亚基有一个磷酸根结合位点和一个脱
氧核苷结合位点。当 TP 被锚定在细胞壁表面时，锚
定蛋白可能影响到 TP 的空间构象和 TP 亚基之间的
相互作用，继而阻碍 TP 对核苷类底物的催化，导致
底物转化率较低。本实验室正在尝试利用另外的锚
定蛋白和酵母展示系统来展示 TP。
酵母表面展示 TP 还有待更深入的研究，需要
选用更适合的锚定蛋白和展示系统，以进一步提高
TP 的活性和表达量。此外，利用毕赤酵母密码子偏
好性［15］，对 deoA 基因序列进行优化，并将毕赤酵
母表面展示技术作为筛选手段进行定向进化［16］，或
许可以提高 TP 在酵母细胞内的表达量，进而筛选出
催化能力更高的 TP 和稳定性高的展示系统，为开发
高稳定性、高活性的表面展示 TP 全细胞催化剂奠定
了基础。
本研究还尝试以 5- 氮杂胞苷为底物，但未能
成功催化生成 5- 氮杂胞嘧啶，说明 TP 有一定的底
物选择特异性，无法单独催化胞嘧啶核苷类衍生物
的生成。有文献报道 TP 可以催化嘧啶类脱氧核苷
酸或 5- 位取代的尿嘧啶类化合物，但脱氧胞苷类和
6-C 被甲基或酮基取代的核苷类化合物除外，另外
TP 也不能以尿嘧啶和胸腺嘧啶的氮杂类衍生物为底
物［17，18］。
在催化合成核苷类衍生物的过程中，可尝试利
用酵母表面展示系统同时展示两种核苷磷酸化酶，
进行双酶反应［19］，提高全细胞催化剂对核苷类化合
物的底物适应性，来催化合成更多的非天然核苷类
似物。
4 结论
本研究利用酵母表达质粒 pKFS，首次构建了胸
苷磷酸化酶的毕赤酵母表面展示系统。通过两步法
的发酵方法，诱导酵母表达外源蛋白 TP，确定了甲
醇诱导的第 3、4 天是酵母表达外源蛋白 TP 的高峰
期。并将展示 TP 的酵母细胞作为全细胞催化剂，以
胸苷为底物催化合成了胸腺嘧啶。
参 考 文 献
［1］ Jordheim LP, Durantel D, Zoulim F, et al. Advances in the
0.6
0.4
0.2
0.0
A
U
5.0 10.0 15.0 20.0
min
㜨㤧㜨㞪౗஦
图中的特征峰分别是胸腺嘧啶产物峰和 β-胸苷底物峰
图 4 HPLC 检测图
3 讨论
本研究利用表面展示 TP 的酵母细胞作为全细
胞催化剂，分别在 30℃、40℃、50℃、60℃的反应
温度下，以 50 mmol/L pH7.5 的磷酸盐缓冲液配制
反应体系，以胸苷为底物进行催化反应，结果表明
50℃是最优反应温度，在此温度下胸苷的转化率最
高为 7.5%。为探索不同 pH 值对反应的影响，制备
了 pH 值为 6.5、7.0、7.5、8.0 的磷酸盐缓冲液，在
50℃条件下进行了催化反应，结果表明 pH7.5 是最
优反应 pH 值。但相比于表达 TP 的重组 E. coli 工
程菌［14］，毕赤酵母转化子的催化效率仍相对较低，
文献利用 E. coli BL21 菌株共表达了 TP 和尿苷磷酸
化 酶（UP）， 在 50℃ 时， 将 E. coli 重 组 菌 株 与 30
mmol/L 尿嘧啶和 60 mmol/L β-胸苷混合反应 1 h，TP
和 UP 共同催化生成了 2- 脱氧尿苷，反应的转化率
可以达到 61.6%。
Flo1 蛋白的 N 端亚基可以非共价锚定 TP 的 N
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1206
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（责任编辑 李楠）