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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 1期
白地霉脂肪酶在毕赤酵母表面展示
陶站华
张搏
(广西科学院生物物理实验室,南宁 530007 )


摘
要:
将白地霉脂肪酶基因 N端与酿酒酵母 FLO絮凝结构域序列融合, 构建成脂肪酶毕赤酵母表面展示载体并转化
毕赤酵母 GS115。免疫荧光检测证实脂肪酶已展示于毕赤酵母细胞表面。甲醇诱导 96 h后展示酶活性达到 81 U /g干细胞,
酶的热稳定性较游离酶有较大提高, 50
孵育 4 h后酶活仍保持初始酶活 70%以上。
关键词:
表面展示
毕赤酵母
脂肪酶
白地霉
全细胞催化剂
D isplay ofGeotrichum candidum Lipase on Cells Surface ofP ichia pastoris
Tao Zhanhua
Zhang Bo
(Lab of Biophy sics, Guangx iA cademy of Sciences, N anning 530007)


Abstrac:t
P. pastor is surface d isp lay vector o f lipase w as constructed by fusing the N term inus o fGeo trichum candidum lipase
genew ith FLO
floccu lation dom a in sequence from Saccharomyces cerevisiae. The recom binant vectorw as then transform ed intoP. pastor is
GS115. The fluorescence m icro scopy o f immuno labe led P. pastoris revea led the lipase w as d isp layed on the ce ll sur face. The hydro lysis
activ ity of lipase displayed on P. pastoris cell surface reached 81 U /g dry ce ll a fter 96 h o f induction. The therm a l stability of d isp layed
lipase w as im proved com pared w ith that o f free lipase, and the residua l activity was above 70 percent o f initial activ ity afte r incuba tion at
50
for 4 h.
Key words:
Sur face d isp lay
P ich ia pastoris
L ipase
G eotr ichum candidum
Who le ce ll catalyst
收稿日期: 2010
06
17
基金项目:广西自然科学基金项目 (桂科自 0991078,桂科攻 0895003
4
1) ,广西科学院基本业务费资助项目 ( 08YJ16WL02 )
作者简介:陶站华,男,副研究员,研究方向:蛋白质工程; E
m ai:l taozhanhua@ 163. com
脂肪酶 ( lipase, EC 3. 1. 1. 3)又名甘油酯水解酶,
可以催化三酰基甘油酯水解、酯化、转酯和氨解等反
应 [ 1] ,广泛应用于有机合成、油脂化工、洗涤剂以及食
品、医药等领域。白地霉脂肪酶对长链不饱和脂肪酸
具有高度的底物特异性,在选择性水解鱼油富集高营
养价值的多不饱和脂肪酸、选择性酯化分离功能性共
轭亚油酸异构体等领域具有巨大应用潜力 [ 2]。然而,
游离脂肪酶稳定性差, 无法回收利用,酶的固定化技
术虽然可以解决以上问题,但是传统的固定化方法也
会产生一些不利因素, 例如, 固定化过程可能造成酶
的活性收率损失;另外,由于固定化操作需用载体,因
而增加了载体成本费和固定化操作费用 [ 3] , 而微生物
细胞表面展示技术为酶的固定化提供了一种新的基
于基因重组技术的生物学方法。
微生物细胞表面展示是通过将靶蛋白基因序列
与特定的载体蛋白基因序列融合后导入微生物宿主
细胞,靶蛋白在载体蛋白的引导下表达并定位于微
生物细胞表面,保持相对独立的空间构象和原有的
生物学活性 [ 4]。酵母展示系统是比较理想的、应用
较广泛的展示系统,其优势在于遗传操作方便,能对
表达的外源蛋白进行折叠、糖基化等翻译后修饰,因
而适宜表达真核蛋白 [ 5]。酿酒酵母是目前常见的
用于酵母表面展示的宿主细胞, 而巴斯德毕赤酵母
与酿酒酵母相比具有更优越的发酵特性,如能够在
廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度。这些特
性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势,例如,
展示异源酶作为全细胞催化剂 [ 6]。另外,毕赤酵母
对外源蛋白的 O
糖基化程度更高,因而对展示的外
源酶具有更好的稳定效果。本研究利用酿酒酵母
FLO絮凝结构域作为载体蛋白将白地霉脂肪酶展示
2011年第 1期 陶站华等:白地霉脂肪酶在毕赤酵母表面展示
于毕赤酵母细胞表面,并检测酶的活性及热稳定性,
旨在为该酶的固定化提供一种新的选择。
1
材料与方法
1. 1
材料
1. 1. 1
菌株与质粒
大肠杆菌 DH 5
感受态细胞
购自北京全式金生物技术有限公司,含有 FLO基因
的絮凝酵母购自 American Type Culture Co llect ion
(编号: ATCC 60715) , 白地霉购自中国工业微生物
菌种保藏中心 (编号: C ICC 1364), 毕赤酵母 GS115
细胞株和表达载体 pPIC9K为 Inv itrogen公司产品。
1. 1. 2
工具酶和主要试剂
限制性核酸内切酶
Bma H
、E coR
、Sac
、SnaB
和 T4DNA连接酶购自
NEB公司, Taq DNA聚合酶和 PrimerSTAR DNA聚合
酶、dNTP m ix ture、pMD18
T载体克隆试剂盒购自宝生
物 (大连 )有限公司, DNA marker购自天根生化科技
(北京 )有限公司, 鼠源抗 H is标签单克隆抗体和
DyL ight
TM
488标记山羊抗小鼠 IgG (重链 +轻链 )抗
体均由北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装,质
粒提取试剂盒和胶回收试剂盒为 B ioF lux公司产品,
PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成,其他化学试剂均为国产或进口分析纯试剂。
1. 2
方法
1. 2. 1
白地霉脂肪酶表面展示载体的构建
为获
得 FLO絮凝结构域序列,提取絮凝酵母 ATCC 60715
的基因组 DNA,并以该基因组为模版,设计引物,上游
引物 FLO
fBam: CGAGGATCCATGACAATGCCTCAT

CGCTATATGTTTTTG (下划线部分为 BamH
酶切
位点 ) , 下游引物 FLO
rSnaB
: GTATGACCCGCCAC

CTCCAGAGCTGGTGATTTGTCCTGAAGATGATG(下划
线部分为 SnaB
酶切位点的一部分,斜体部分编码
柔性连接四肽 G ly
G ly
G ly
Ser) , PCR产物经 BamH

酶切后与经过 BamH
和 SnaB
双酶切的载体
pPIC9K连接,构建成的毕赤酵母表面展示载体命名
为 pPIC9K
FLO。
为扩增白地霉脂肪酶编码基因, 提取白地霉基
因组 DNA,并以该基因组为模版根据 GenBank上发
表的白地霉脂肪酶基因序列设计引物, 上游引物
GCL
:f CATCACCATCACCATCACATGGTTTCCAAAA

GCTTTTTTTTAG (斜体部分为编码 6
H is标签的序
列 ), 下游引物 GCL
rE co: CCGGAATTCTTAACCG

TAGAGATTAACGTCAGACTC (下划线部分为 E coR

酶切位点 )。PCR产物经 EcoR
酶切后与经过
SnaB
和 E coR
双酶切的载体 pPIC9K
FLO连
接, 构建成的白地霉脂肪酶酵母表面展示载体命名
为 pPIC9K
FLO
GCL。重组质粒经酶切验证后进行
序列测定以确保编码框的正确。
1. 2. 2
酵母转化及筛选
将上述构建成功的质粒
pPIC9Kk
FLO
GCL用 Sac
酶切线性化后转化毕赤
酵母 GS115, 转化采用电转化法, 转化子利用不含
H is的 RDB培养基进行筛选。阳性克隆再用含有
1. 0和 2. 0 mg /mL遗传霉素的 YEPD平板筛选含有
高拷贝数质粒整合的菌株,并用橄榄油
罗丹明 B平
板筛选有较高脂肪酶活性的菌株。
1. 2. 3
诱导表达
将重组毕赤酵母 GS115
pPIC9K

FLO
GCL接种于 20mL含有 0. 5%甘油的 BMGY培
养基中, 28
, 250 r /m in振荡培养 24 h, 然后每隔
24 h向培养基中加入终浓度 0. 5%的甲醇, 继续在
28
, 250 r/m in条件下振荡培养 120 h, 分别在 0、
24、48、72、96和 120 h取样测定酶活力。
1. 2. 4
表面展示脂肪酶的免疫荧光检测
取上述
诱导表达 96 h的细胞培养物离心收集菌体, 用 PBS
洗涤细胞 2次后,将细胞用 200
L含有 3% BSA的
PBS重悬,再加入 2
L浓度为 400
g /mL抗 6
H is
标签的鼠单克隆抗体,室温下振荡孵育 2 h,以 PBS
洗涤 2次后用 200
L含有 3% BSA的 PBS重悬,再
加入 2
L浓度为 1. 5 mg /mL的 DyL ightTM 488标记
山羊抗小鼠 IgG二抗, 于室温避光条件下振荡孵育
50m in, PBS洗涤 2次后再用 PBS稀释至适宜浓度,
在荧光显微镜 ( N ikon 2000U )下观察,激发光波长为
495 nm。
1. 2. 5
表面展示脂肪酶活性的定量测定
离心收集
发酵液中的重组毕赤酵母菌体, 用 PBS洗涤两次,然
后用 PBS稀释至适宜的浓度用于酶活性检测。脂肪
酶活性测定采用橄榄油乳化法。于具塞三角烧瓶中
加入 5mL 50mmo l/L pH7. 8 Tris
HC l和 4mL聚乙烯
橄榄油乳化液和 1mL重组酵母菌体混悬液, 37
孵
育 10m in,加入 10mL无水乙醇终止酶促反应,加入 3
滴酚酞, 以 50 mmol /L NaOH滴定至终点, 以每分钟
释放 1
mo l脂肪酶的酶量定义为一个酶活力单位,
表面展示脂肪酶的活性以 U /g干细胞表示。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
1. 2. 6
表面展示脂肪酶热稳定性的测定
离心收
集甲醇诱导 96 h的 GS115
pPIC9K
FLO
GCL, PBS
洗涤两次后重悬于 PBS中, 于振荡条件下 50
孵
育,每 30 m in取 1份细胞悬液, 按 1. 2. 5所述方法
测定酶活。以未经热处理的初始酶活作为 100% ,
热处理不同时间的酶活与初始酶活的比值作为相对
酶活, 并与游离的白地霉脂肪酶的热稳定性进行对
比,其中游离白地霉脂肪酶由本实验室构建的重组
毕赤酵母分泌表达。
2
结果与分析
2. 1
白地霉脂肪酶表面展示载体的构建
以絮凝酵母 ATCC 60715基因组 DNA为模版,
PCR扩增得到 3. 2 kb表面展示载体蛋白 FLO编码
基因, 将其克隆至毕赤酵母表达载体 pPIC9K AOX1
启动子下游构建成毕赤酵母表面展示载体 pPIC9K

FLO,如图 1
A。然后再以白地霉基因组 DNA为模
版,扩增得到 1. 7 kb的白地霉脂肪酶 GCL编码基
因,将其克隆到上面构建的表面展示载体 pPIC9K

FLO的 FLO基因的 3
端,并在 FLO序列和 GCL序
列之间添加了 6
H is标签编码序列以便于以后的
免疫荧光染色检测, 构建成功脂肪酶表面展示载体
pPIC9K
FLO
GCL,如图 1
B。对构建成的载体进行
酶切验证, 用 E coR
酶切后电泳,在 14 kb处可见
单一条带,用 BmaH
、EcoR
双酶切, 因为 GCL编
码基因在 192位处有一个 BmaH
酶切位点, 所以
酶切产物电泳后可见 3条带, 分子量大小分别为 9
kb、3. 5 kb和 1. 5 kb(图 2) ,酶切验证结果与预期一
致。酶切验证后的序列经过测序, 结果表明编码框
和设计一致。
图 1
表面展示载体 pP IC9k
FLO和
pPIC9k
FLO
GCL的结构
1. DNA mark er; 2. EcoR
单酶切; 3. BmaH
和 E coR
双酶切
图 2
pPIC9K
FLO
GCL载体的酶切鉴定
2. 2
表面展示脂肪酶的免疫荧光检测
重组酵母 GS115
pPIC9K
FLO
GCL在甲醇诱导
下表达载体蛋白 FLO、6
H is标签和白地霉脂肪酶
3个片段的融合蛋白, 以抗组氨酸标签的鼠单克隆
抗体结合展示于细胞表面的融合蛋白内部的组氨酸
标签。以 DyL ightTM 488标记山羊抗小鼠 IgG抗体将
信号放大, 荧光显微镜下可见整合 pPIC9K
FLO

GCL序列的重组毕赤酵母细胞周围有明显的绿色
荧光,但荧光在细胞表面分布不均匀,而且不同细胞
间荧光强度差异也较大; 而整合空质粒 pPIC9K的
对照细胞表面没有荧光 (图 3 ), 以上结果表明脂肪
酶已成功展示于毕赤酵母细胞表面。
a, c. GS115
pPIC9K
FLO
GCL细胞和对照细胞 GS115
pP IC9K
的明场照片; b, d. GS115
pPIC9K
FLO
GCL细胞和对照细胞
GS115
pPIC9K的免疫荧光染色照片
图 3
毕赤酵母表面展示白地霉脂肪酶的免疫荧光检测
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2011年第 1期 陶站华等:白地霉脂肪酶在毕赤酵母表面展示
2. 3
表面展示脂肪酶的活性检测
将转化 pPIC9K
FLO
GCL的菌株接种于橄榄油 -
罗丹明 B平板上, 筛选水解圈较大的细胞株, 平板
筛选结果见图 4,其中 A为空载体 pPIC9K转化对照
菌株, 菌落周围没有水解圈, B为重组酵母 GS115

pPIC9K
FLO
GCL,菌落周围已形成明显的水解圈,
说明脂肪酶已展示于细胞表面并具有催化活性。
图 4
表面展示脂肪酶活性的罗丹明平板检测
在液体培养发酵中检测毕赤酵母表面脂肪酶活
性随时间的变化情况,结果见图 5。当诱导时间为
0- 96 h时,酶活性随着诱导时间的延长而增加, 96
h酶活性达到最大值 81 U /g干细胞, 然后开始缓慢
降低, 酶活性的降低可能是由于展示在酵母细胞表
面的脂肪酶被发酵液中蛋白酶水解的结果。
图 5
诱导时间对表面展示脂肪酶活性的影响
2. 4
表面展示脂肪酶的热稳定性
展示在酵母表面的白地霉脂肪酶和游离脂肪酶
热稳定性的比较,见图 6。游离脂肪酶 50
处理 1 h
后,酶活降低到初始活性的 28%, 3 h后, 几乎检测
不到酶活性;而表面展示的脂肪酶在 50
处理 4 h
后,依然保持相当于初始值 70%以上的活性, 以上
结果表明表面展示大大提高了脂肪酶的热稳定性。
图 6
表面展示脂肪酶的热稳定性
3
讨论
白地霉脂肪酶专一作用于特定类型的三脂酰甘
油的酯键, 即只水解或合成 C9
C10之间有顺式双
键的甘油酯 [ 7] , 利用这种底物特异性可使油脂结构
重排合成特定脂肪酸组成和分布的产品,因而在工
业上有巨大的应用潜力。然而, 白地霉的热稳定性
不高,一般在 30- 40
,并且游离酶回收困难, 不利
于反复利用,这些问题都限制了其工业应用。固定
化酶虽然可以在一定程度解决上述问题,但也存在
载体与试剂较贵、成本高、工程投资大、酶活力回收
低等缺点和只适用于水溶性小分子底物等限制因
素。利用微生物细胞表面展示技术将酶分子展示于
细胞表面,微生物细胞既作为酶的生产者,又可以充
当固定化酶中的载体,免去了酶的纯化和固定等操
作, 简化了生产环节,降低了生产成本。
根据宿主细胞的不同, 微生物细胞表面展示系
统可分为噬菌体展示系统、细菌展示系统和酵母展
示系统。酵母细胞体积较大,能提供更大的展示量,
细胞表面有刚性的细胞壁,机械强度大,因此更适合
作为表面展示的宿主细胞。与酿酒酵母相比, 毕赤
酵母由于发酵密度高,并且能利用廉价的碳源,在工
业化生产中更具优势。絮凝素 Flo1p是酵母细胞表
面类似凝集素的细胞壁蛋白, 在细胞表面的絮凝反
应中起着主要作用。 Flo1p有两个细胞壁结合结构
域, 一个是 N端的絮凝功能结构域, 能识别细胞壁
中的
甘露聚糖组分并与之非共价结合; 另一个是
C端的 GPI锚定蛋白附着信号 [ 8]。本研究中表面展
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
示的载体蛋白利用的就是絮凝功能结构域。将白地
霉脂肪酶利用柔性连接序列 G ly
G ly
G ly
Ser与絮凝
功能结构域 FLO的 C端融合,融合蛋白 N端的 FLO
结构域锚定于酵母细胞壁, C端的脂肪酶可以与底
物充分接触完成催化反应。免疫荧光和罗丹明平板
检测结果表明脂肪酶已成功展示于细胞表面并保持
催化活性。
本研究中表面展示脂肪酶的酶活可达 81 U /g
干细胞,与相同发酵条件下表达游离脂肪酶的重组
毕赤酵母相比产量偏低, 但酶的热稳定性较之游离
酶大幅度提高,并且反应结束后可以方便地回收再
利用。如果尝试选用不同的表面展示载体蛋白,探
索载体蛋白和酶之间的连接序列对酶活的影响,优
化表达条件,表面展示酶的活性还可能进一步提高。
参 考 文 献
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(责任编辑
李楠 )
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