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酿酒酵母组成型表达甜叶菊糖基转移酶
UGT76G1 及相关性质研究
王 钰，陈量量，杜 婷，李 艳* ，严 明，郝 宁，许 琳
(南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 211816)
收稿日期:2014－11－05
作者简介:王钰(1988－) ，女，硕士研究生，研究方向:生物催化。
* 通讯作者:李艳(1975－) ，女，博士，副研究员，研究方向:工业生物催化。
基金项目:国家自然科学基金项目(21106068) ;江苏省自然科学基金项目(BK2011801) ;高等学校博士学科点专项科研基金(20113221120002)和
江苏省普通高校自然科学研究项目(10KJB530004)。
摘 要:本研究将酿酒酵母穿梭质粒 pESC－Leu 的诱导型启动子 GAL1 和 GAL10 分别替换为 PGK1 和 TEF1 启动子，
构建了组成型双启动子表达载体 pESCD，再将甜叶菊糖基转移酶 UGT76G1 的编码基因亚克隆到 pESCD 的 Sal I 和
Xho I酶切位点之间，构建了组成型表达 UGT76G1 的重组质粒 pESCD－ UGT。将 pESCD－ UGT 转化到酿酒酵母
YPH499中进行表达，结果确定该重组酵母在 SD－L液体培养基培养 24h 达到稳定期，菌体培养 8h 蛋白表达量高，选
用 1%的甲苯作为重组菌全细胞催化的通透剂时，催化 15h产生 288mg /L的莱鲍迪甙 A，其产量是对照组的 5 倍。
关键词:酿酒酵母，组成型启动子，糖基转移酶 UGT76G1，全细胞催化，莱鲍迪甙 A
Constitutive expression and characteristics of
glycosyltransferase UGT76G1 in Saccharomyces cerevisiae
WANG Yu，CHEN Liang－ liang，DU Ting，LI Yan* ，YAN Ming，HAO Ning，XU Lin
(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，China)
Abstract:In this study，a new expression vector pESCD which contains the two constitutive promoters，pPGK1 and
pTEF1 that replaced the original induced promoter GAL1 /GAL10 in pESC－Leu，was designed and constructed.The
synthetic glycosyltransferase UGT76G1 coding gene was inserted into the restriction sites，Sal I and Xho I of
pESCD to construct the recombinant plasmid pESCD－UGT，which was then transformed into the Saccharomyces
cerevisiae strain YPH499.The results confirmed that the recombinant cells grew into the stable phase when cultured
for 24h and the highest expression of the recombinant protein was observed when cultured for 8h in SD－L.In case
of 1% methylbenzence as the cell permeating agent，288mg /L ＲA was produced after reaction for 15h using the
whole－cell catalyst，which was 5 times higher than that of thecontrol group.
Key words:Saccharomyces cerevisiae;constitutive promoter;glycosyltransferase UGT76G1;whole cell
transformation;rebaudioside A
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2015)13－0162－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 13． 025
植物来源的 UDP－葡萄糖基转移酶(UGTs)是糖
基转移酶家族中的一个重要分支。通过该酶的转糖
基作用，有利于改变受体分子的稳定性、可溶性，提
高解毒功能等。每种植物中都有多种 UGTs，它们对
底物的作用位点具有高度的特异性［1］。其中，糖基转
移酶 UGT76G1 能将甜菊糖中具有后苦味的甜菊甙
(Stevioside，St甙)通过一步糖基化反应生成莱鲍迪
甙 A(Ｒebaudioside A，ＲA甙)［2］。ＲA甙是一种无毒、
安全、高甜度的天然甜昧剂，口味纯正［3－4］，得到欧美
国家的接受和推崇。市售甜菊糖一般以 St甙为主要
组分，但其略带甘苦味影响了甜菊糖的口感。因此，
提高 ＲA甙在甜菊糖总甙中的相对含量有助于改善
甜菊糖味质。
在 UGT76G1 所催化的糖基转移反应中需要以
昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)作为糖基供体，必
然影响 ＲA甙酶促合成应用的经济性。全细胞催化
技术利用受细胞壁保护的胞内酶系，稳定性更好，同
时避免向反应体系中额外添加 UDPG，降低了生产成
本，在生物催化领域中具有很大的优势。在本实验
室前期进行的全细胞催化合成 ＲA的工作中［5］，由于
采用 pESC－ Leu 作为表达载体，该载体的 GAL1 和
GAL10 启动子受半乳糖诱导，受葡萄糖阻遏［6－8］，因
163
此重组酵母的培养和重组酶的表达一般分阶段进
行，并且需要加入半乳糖作为诱导剂，从而实验周期
过长，操作繁琐，不利于扩大生产［9－10］。本研究中用
组成型启动子 PGK1 和 TEF1 分别替换 pESC－Leu 的
GAL1 和 GAL10 启动子［11］，构建了新的表达载体
pESCD。再将甜叶菊糖基转移酶 UGT76G1 的编码基
因克隆到 pESCD 载体，用其转化酿酒酵母 YPH499
获得组成型表达 UGT76G1 的重组酵母，并考察了该
重组考察重组菌的生长与产酶性质，初步验证其全
细胞催化甜菊甙合成莱鲍迪甙 A的能力。这一工作
缩短了重组菌培养及重组酶表达的周期，无需诱导
剂，有利于降低生产成本。
1 材料与方法
1.1 试剂
实验所用基因和引物 由南京金斯瑞公司合
成;CloneEZ PCＲ Cloning Kit 购自南京金斯瑞公司;
限制性内切酶 购于 NEB公司;Taq DNA聚合酶、T4
DNA 连接酶、限制性内切酶和 2000、15000DNA
Marker 购自 Takara公司;质粒抽提试剂盒、DNA 片
段纯化与胶回收试剂盒 购于上海申能博彩有限公
司;St甙和 ＲA甙购自曲阜海根甜菊制品有限公司。
1.2 菌株和质粒
大肠杆菌菌株 E.coli DH5α 和酿酒酵母菌株
saccharomyces cerevisiae YPH499 为本实验室保藏，
pMDTM－18T 载体购自 TaKaＲa 公司;pYES2－ UGT 为
本实验之前构建的带 UGT76G1 糖基转移基因的重
组质粒。
1.3 培养基
大肠杆菌 LB培养基:蛋白胨 10g /L，酵母提取物
5g /L，氯化钠 10g /L;酿酒酵母完全培养基 YPD:酵母
提取物 10g，蛋白胨 20g /L，葡萄糖 20g /L;酿酒酵母
选择培养基 SD－L(SD 基本培养基［12］缺乏亮氨酸) ，
其中碳源为 20g /L葡萄糖。
1.4 实验方法
1.4.1 组成型表达载体的构建 在数据库 National
Center for Biotechnology Information(NCBI)上检索到
TEF1 和 PGK1 的基因序列，并参考文献［11］设计引物
如下:
P1:5 － CCATTCTTTGAAGGTACTTCCGGCCGG
CCGCACACACCATAGCTTCAAA－3;
P2:5 － GTTGTTGCGGCCGCTTGTAATTAAAAC
TTAGATTAGATTGC－3;
P3:5－GGAAGTACCTTCAAAGAATGG－3;
P4:5 － GTTGTTGGATCCTTGTTTTATATTTGTT
GTAAAAAGTAG－3
其中 P2 和 P4 分别带有 Not I、BamH I 酶切
位点。
以 YPH499 基因组为模板分别用引物 P1 和 P2
PCＲ 扩增片段 pTEF1，引物 P3 和 P4 PCＲ 扩增
pPGK1 片段。PCＲ 在 50μL 体系中进行，反应条件
为:98℃预变性 5min;98℃变性 10s，58℃退火 15s，
72℃延伸 1min，30 个循环;72℃延伸 7min。获得两
个 pTEF1 和 pPGK1 的 PCＲ扩增片段后，再使用融合
PCＲ技术将 pTEF1 和 pPGK1 反向融合起来，得到新
的目的片段。融合 PCＲ 的模板为 pTEF1 与 pPGK1
的 PCＲ产物按等浓度的混合物，PCＲ 体系 50μL 引
物为 P2、P4。将融合的 PCＲ产物及表达质粒 pESC－
Leu用 Not I、BamH I 限制性内切酶进行双酶切反应，
再纯化回收酶切后片段进行连接，连接液转化大肠
杆菌 DH5α感受态细胞，用经酶切鉴定的阳性克隆
送南京金斯瑞公司测序确认，获得质粒 pESC－LeuD
简称 pESCD。
1.4.2 引物设计与合成 根据 UGT 基因序列和
CloneEZ PCＲ Cloning Kit 的引物设计原理合成引物
如下:
P5:5 － CTATAGGGCCCGGGCGTCGACATGGAA
AATAAGACTGAAACTACTG－3;
P6:5 － GCGGTACCAAGCTTACTCGAGTTATAAT
GATGAAATATAAGAAACC－3
P5 和 P6 分别带有 SalⅠ、XhoⅠ酶切位点。
以 pYES2－ UGT 质粒为模板，用引物 P5 和 P6，
PCＲ扩增 UGT 基因。PCＲ 在 50μL 体系中进行，反
应条件为:98℃预变性 5min;98℃变性 10s，62℃退火
15s，72℃延伸 2min，30 个循环;72℃延伸 7min。将
经 Sal I、Xho I 双酶切后的质粒 pESCD 纯化回收，与
纯化后的 PCＲ 产物用 CloneEZ Enzyme 进行连接，连
接液转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，用经酶切鉴
定的阳性克隆送南京金斯瑞公司测序确认，获得重
组质粒 pESCD－UGT。
1.4.3 重组 UGT76G1 的表达 将重组质粒 pESCD－
UGT采用化学转化法转入到酿酒酵母 YPH499 感受
态细胞中，30℃培养约 48h，在 SD－L 筛选平板上得
到重组酵母 YPH499(pESCD－UGT)，挑取单菌落到
SD－L 培养液中，30℃振荡培养活化。种子液按终
OD600为 0.4 的接种量转接于 100mL 新鲜 SD－L 液体
中，30℃、200r /min 培 养 8、12、16、24h。室 温
6000r /min离心 10min收集菌体、用 0.1mol /L 磷酸钾
缓冲液(pH7.2)悬浮洗涤后备用。
1.4.4 粗酶液的制备 取适量上述细胞加液氮反复
研磨，用 300μL 0.1mol /L磷酸钾缓冲液(pH7.2)重悬
样品，4℃、12000r /min 离心 15min。上清即为粗酶
液，进行 SDS－PAGE凝胶电泳实验和酶催化实验。
1.4.5 粗酶催化反应 在 3mL 的反应体系中
(1.2mmol /L St甙、4mmol /L UDPG、3mmol /L MgCl2、
10μg /mL BSA、0.89mg 粗酶、pH7.2) ，加入粗酶液反
应，30℃反应每隔 1h 取次样，高温加热 5min 终止反
应。12000r /min离心 1min 后上清液用高效液相色
谱(HPLC)进行分析［12］。
1.4.6 全细胞催化方法 取 30℃培养 24h 的重组酿
酒酵母 YPH499(pESCD－UGT)的湿菌体，用磷酸钾
缓冲液洗涤两次后转移至 50mL 三角瓶中，在 10mL
体系(0.1mol /L磷酸钾缓冲溶液，pH7.2)中加入终浓
度为 40g /L 的葡萄糖，底物 St 甙 2g /L，MgCl26g /L，
15g /L柠檬酸钠，并分别加入 1%甲苯和 10g /L 普朗
尼克 F－68，于 37℃，200r /min 条件下进行全细胞催
化反应。5、15、24h取样离心去除菌体，上清 95℃煮
沸 10min，样品 － 20℃保存待液相分析。
164
1.4.7 色谱分析条件 色谱柱:Lichrospher NH2 柱
(250mm × 4.6mm，5μm) ;流动相为乙睛 ∶水(80 ∶20，
V∶V) ，用冰醋酸酸调节 pH 至 4.56;流速:1mL /min;
柱温:40℃;检测波长:210nm。
2 结果与讨论
2.1 pESCD组成型载体的构建与鉴定
以 YPH499 基因组为模板，经 PCＲ 反应扩增得
到片段 pPGK1、pTEF1，再使用融合 PCＲ 技术将
pTEF1 和 pPGK1 反向连接，得到新的目的基因片段，
纯化后的 PCＲ片段用 Not I、BamH I 双酶切，回收该
片段，与同样酶切处理的质粒 pESC－Leu连接。将连
接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，提取质粒
用 BamH I 和 Not I 对所提的重组克隆菌进行双酶
切，酶切结果见图 1。4 号重组质粒经酶切后有明显
的目的基因的条带(1.4kb左右)，经测序后鉴定为阳
性克隆。构建好的重组质粒 pESCD如图 2 所示。
图 1 pPGK1＆pTEF1 融合启动子的酶切验证
Fig.1 pPGK1＆pTEF1 fusion promoter enzyme cutting test
注:1～3:带有 pESC－Leu载体的假阳性克隆菌;
4:带有 pESCD载体阳性克隆菌;5:DNA Marker DL2000。
图 2 空质粒 pESCD构建示意图
Fig.2 Construction of plasmid pESCD
2.2 表达重组子 pESCD－UGT的构建与鉴定
以 pYES－UGT质粒为模板，经 PCＲ 反应扩增得
到 UGT片段，再使用 SalⅠ、XhoⅠ双酶切 pESCD 质
粒，纯化回收该质粒与 PCＲ产物，用 CloneEZ Enzyme
连接纯化后的 pESCD 质粒和 PCＲ 产物。将连接产
物转化入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，提取质粒用
BamHⅠ对所提的重组克隆菌进行双酶切，酶切结果
见图 3，1 号重组质粒酶切后有明显的条带，约
750bp，与预期一致。构建好的重组载体 pESCD－
UGT如图 4 所示。
2.3 重组蛋白的 SDS－PAGE凝胶电泳结果
图 3 酶切 pESCD－UGT鉴定
Fig.3 Enzyme digestion of pESCD－UGT
注:1:pESCD－UGT酶切产物;
2:对照 pESCD－UGT;3:DNA Marker DL15000。
图 4 重组质粒 pESCD－UGT构建示意图
Fig.4 Construction of recombinant plasmid pESCD－UGT
由细胞破碎液上清的 SDS－ PAGE 凝胶电泳图
(图 5)可知，与泳道 1 相比，泳道 4、5 在大约 52ku 处
有外源蛋白表达条带，与 UGT 分子量一致，说明
UGT76G1 已在重组菌 YPH499(pESCD－UGT)中成功
表达。通过对比泳道 4～7 可知在重组菌处于对数中
期(培养 8h)时，目标蛋白 UGT61G1 表达量最高。目
标蛋白表达量随培养时间延长而降低，该结果与文
献［11］报道的 PGK1 启动子的性质吻合。
图 5 细胞破碎液上清 SDS－PAGE凝胶电泳图
Fig.5 SDS－PAGE of the clear liquid of the cell disruption
注:1，Marker－ＲM013;2，培养 24h的重组菌 YPH499
(pESCD);4～7，分别为培养 8、12、16 和 24h的
重组菌 YPH499(pESCD－UGT);8，Marker－Ｒ0571。
2.4 重组菌生长与残糖量的确定
如图 6 所示，酿酒酵母 YPH499(pESCD－UGT)
以半皿 /100 mL接入 SD－L培养基时，在 16h 后对数
期基本结束进入稳定期，其 OD600达到 7.84。而培养
24h时，培养基内葡萄糖基本耗尽，此时重组菌为稳
165
定期。对重组菌生长状况的初步研究为重组蛋白表
达条件尤其是表达时机的选择奠定了基础。
图 6 重组菌 YPH499(pESCD－UGT)生长状况与残糖关系
Fig.6 Ｒelationship of the growth and
glucose concentration of recombinant
2.5 重组菌与对照菌的催化能力比较
实验结果表明，对照菌(pESCD)本身也能够催
化生成 ＲA甙，在 4h后，重组酵母菌催化能力远大于
原始菌，是原始菌的 7～10 倍。原始菌也能催化合成
ＲA甙，可能是其具有相似结构酶活中心的糖基转
移酶。
图 7 重组菌 YPH499(pESCD－UGT)
与 YPH499(pESCD)酶催化合成 ＲA甙比较
Fig.7 Comparison of crude enzyme catalytic ability
in YPH499(pESCD－UGT)and YPH499(pESCD)
2.6 重组菌 YPH499(pESCD－UGT)的菌龄对粗酶
催化能力的影响
由实验结果知:收集 SD－L 培养基中培养 8h 的
菌体，处理后其粗酶催化能力最高，反应 4h 后可催
化产生 300mg /L ＲA甙，粗酶催化能力随所用重组细
胞的菌龄的增长而降低，这与重组蛋白 SDS－ PAGE
电泳图谱(图 5)显示的结果相一致，培养 8h 的细胞
中重组酶活力最高，随着培养基中葡萄糖消耗，PGK1
启动子作用下的重组酶的活力随培养时间延长而
降低［11］。
2.7 全细胞催化反应
将表达后的重组菌菌体离心，进行全细胞催化
反应。结果如图 9 所示，甲苯在此转化体系中表现
出较佳的通透性，催化能力是对照组的 5 倍。通透
剂甲苯的加入，使底物 St 甙进入细胞内，在 UGT 糖
基转移酶的催化下酿酒酵母利用葡萄糖，将 St 甙转
化为 ＲA甙。采用重组菌催化 15h 能产生 288mg /L
的 ＲA 甙，24h 后 ＲA 甙产量略微降低为 276mg /L。
可能是由于 ＲA甙在酵母催化体系中不稳定。
图 8 重组菌不同菌龄粗酶液催化能力比较
Fig.8 Enzyme catalytic ability of the recombinants
of different culture durations
图 9 不同通透条件下全细胞催化 St甙合成 ＲA甙
Fig.9 The influence of different cell surfactant
on the whole cell transformation
3 结论
本研究成功实现了糖基转移酶 UGT76G1 在酿
酒酵母体系的组成型表达，重组菌在 SD－L液体培养
基中培养 16h 后对数期基本结束进入稳定期，培养
24h后，培养基内葡萄糖基本耗尽。培养 8h 的重组
菌的粗酶液中，目标蛋白量及其酶催化能力优于更
长时间培养的重组菌。选用 1%甲苯比 F－68 的细胞
通透效果更好，催化反应在 24h 内产物达到
287.5mg /L最大值。后续研究中可考虑对组成型启
动子进行优选，使重组菌外源蛋白的表达水平与菌
体生长相协同，进一步提高重组菌全细胞催化 St 甙
产 ＲA甙的能力。
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(下转第 170 页)
170
为 28.9，30.0，29.3AU /mL，平 均 抑 菌 活 性 为
29.4AU /mL，实验结果与模型吻合较好。
2.4 培养基优化前后的抑菌活性与成本
通过对比培养基优化前后代谢物的抑菌活性，
丙酸杆菌在优化后的培养基上所产代谢物平均抑菌
活性为 29.4AU /mL，而在原始培养基上所产代谢物
平均抑菌活性为 18.7AU /mL，抑菌性提高了 57.2%。
优化后不仅降低了葡萄糖的使用量，而且培养基主
要成分玉米浆替换原始培养基中的酵母提取物、大
豆蛋白胨代替原始培养基的胰蛋白胨，成本显著降
低。可见，丙酸杆菌发酵培养基经优化后不仅提高
了代谢物抑菌活性，而且大大降低了培养基成本，为
该产品的工业化生产提供参考。
3 结论
实验优化了薛氏丙酸杆菌产抑菌性代谢物的培
养基，筛选出玉米浆干粉和大豆蛋白胨分别代替原培
养基中的酵母提取物和胰蛋白胨，并依据响应面分析
中的 Box－behnken实验设计对培养基各成分含量进行
优化，所得薛氏丙酸杆菌产抑菌性代谢物的最佳培养
基组成为:葡萄糖 8.2g /L，大豆蛋白胨5.1g /L，玉米浆
12.7g /L，模型预测抑菌性最高可达 29.5AU/mL，与验
证实验的 29.4AU/mL非常接近，说明了该模型有较好
拟合性。优化后的培养基发酵丙酸杆菌不仅使代谢物
抑菌活性提高了 57.2%，而且培养基成本大大降低，实
验结果为工业化生产丙酸杆菌抑菌性代谢物作为新型
食品防腐剂奠定了基础。
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