全 文 ：·76· 生物加工过程 第5卷第4期
PAG．OA衍生物I5对酿酒酵母转化合成ATP的影响
许兵，应汉杰，姚月兰，李楠
(南京工业大学制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：一种新型促渗透刑PAG—OA(聚氧烯油酸二醇)I5，甲苯、气流干燥度吐温100等，时酿酒酵母进行细胞渗
透性增强处理，考察了酿酒酵母的促渗透性对三磷酸腺苷生产的影响。结果表明，与其他促渗透方式相比，I5时
酿酒酵母三磷酸腺苷的产量有很太的提高。加入0．022mol／L腺苷．三磷酸腺苷得率为0038mol／L，转化率98％；
三磷酸腺苷台成时间缩短为1．5h。经促渗透化处理的酿酒酵母细胞能很好的释放胞内代谢的极性物质；其三磷
酸腺普生产话性犬幅度提高。
关键词：促渗透刺；酿酒酵母；ATP；奎细胞催化；能量偶联
中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)04—0076—04
Effectofpolyoxyalkyleneglycols-oleicacidderivativeI5onactivityof
Saccharomycescerevi iaeofATPproduction
XUBing，YINGHan-jie，YAOYue—lan，LINan
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，NanjingUniversityofTechnology，Nanjing210009，China)
Abstract：TherelationshipofcellpermeabilityandalcoholfermentationforA耶productionwastudiedn
Saccharomycescerevi iae．ANewtypepenetrantI5(polyoxyalkyleneg yco s-oleieaciderivative)，toluene，
pneumaticcoveryingdryingandTween1130weleusedforcellpermeability．Comparedwiththerpermea-
ringtreatmentthtMs．resultsindicatedthateel]permeabilityforATPproductiontreatedbythenewtype
penetrantI5wasraisedobviously．0．022moL／Ladenosinewasadded．andtheyieldofArrPproduction
was0．038moL／LandIrartsformationefficiencywag98％．．11ler actiontimewasdecreasedto1．5h．1"he
effeetofpenetrmatI5 OiltheactivityofSaccharomycescerevi iaeofATPproductionWasobvious．
Keywords：penetrant；Saccharomycescerevisiae；ATP；wholecellcatalysis；energycoupling
改变细胞的渗透性来促进胞内代谢产物的释
放和提高细胞酶系的生物催化活性，是生物合成和
生物催化应用研究中常用的一种有效方法。
低温冷冻、脱水干燥和超声波处理等提高酵母
细胞的渗透性物理方法，对细胞膜和细胞壁的结构
产生破坏，细胞因膜／壁结构性损伤而提高促渗透
性。采用物理方法提高细胞的渗透性在生产操作
上有一定难度；有机溶剂法具有可操作性，但受到
环境和卫生安全方面的限制。应用生物生理调控
方法，使培养酵母的细胞膜产生生理性缺陷而形成
特殊的促渗透性能”1，具有潜在的工业价值。
培养基添加表面活性剂可以改变酵母的生理
特性。如聚氧乙烯三梨聚糖脂肪酸酯(吐温)可以
提高Saccharomycesu。arum酒精产量，增加絮凝效
收稿日期：20074)5-21
基金项目：圆末高技术研究发展计础“863”基金童助项臣(Z006AACf22236)
作者简介：许兵(1981一)，男，江苏姜堰人．硕士研究生．主要研究方向：发酵工程。
联系人：应递杰．鞋授．E-mail：ying}l删iel34@163∞m。
万方数据
2007年11月许兵等：PAG．OA衍生物I5对酿酒酵母转化合成ATP的影响 ·77·
果”。J。聚氧烯油酸二醇(PAG．OA)冷凝物作为消
泡剂，对Kluyveromycesbulgaricus和Saccharomyces
Ⅲmm的生长、呼吸都有促进作用[41。PAG-OA表
面活性剂同样可以对酵母细胞渗透化，渗透化的程
度取决于酵母的种类及细胞膜固醇含量”。。
Benchekroun等”1指出，PAG表面活性剂的相对分
子质量在2000—3300，对Saccharomycescerevisiae
细胞生长、变异及酒精产量作用最好。
本实验室自身合成一种PAG．OA的衍生物，相
对分子质量在2000-4200。其分子式如下所示。
C2IH”NCI(CH2)1700(CH2CH20)。(CH2CH
(CH3)0)6(CH2CH20)。H
其中，o=10，b=20—30，c=7。在普通PAG-OA的
烷基段，添加了季铵盐。
对本试验室保藏一株啤酒酵母S．eer砒／ae
A82．398(2n)进行破壁促渗透化研究。在不同促渗
透方式下，通过研究细胞活性(酒精生产能力)与细
胞合成ATP的关系，探讨I5促渗透机理。
l实验
1．1实验材料
菌种为啤酒酵母S．cerev／s／aeAs2．398(2n)，本
试验室保藏。斜面培养基、种子培养基、合成培养
基组成同文献[7]。
1．2实验仪器
1．2．1ATP含量测定
色谱柱：江苏淮阴汉邦科技有限公司Hehm-
spherC18(讲．6mmx250mill)；流动相：甲醇
0．6％、pH6．5磷酸二乙胺溶液(体积比为91：9)；柱
温：室温；检测器仪器：戴安UVDl70U；检测波长：
254am；流速：1．0mL／min；进样量：20皿。
1．2．2酒精含量测定
色谱柱：美国Bio-Rad公司AminexHPX-87H
IonExclusionColumn(研．8mmx300mm)；流动
相：5mmol／LH2so,一H20溶液，流速：0．6mL／
min；进样量：0．5mL；柱温：65℃；检测器仪器：戴
安SummitP680A；检测方法参考文献[8]。
1．3实验方法
1．3．1培养及发酵方法
斜面恒温培养：超净台上将菌种涂于斜面，于
台式恒温隔水培养箱内3l℃恒温培养36h，冰箱4
℃保存备用。
三角瓶发酵培养：挑取斜面菌种一环，接人三
角瓶培养基(250mL)中HYG—IIa迥转式恒温调速
摇瓶柜内18ac下恒温培养72h，摇床速125r／rain。
摇床发酵培养：将三角瓶摇瓶种子接人发酵培
养基(1000mL)中，于HYG-11a逼转式恒温调速摇
瓶柜内15℃下恒温培养72h。
1．3．2细胞的促渗透处理
促渗透化处理：用适量的水调腺苷成浆状，最终
为0．022mol／L。葡萄糖30g／L，酵母180g／L，硫酸铵
5．0g／L，硫酸镁2．0g／L，氯化钠0，2s／L，磷酸二氢
钾33．5g／L，pH6．8，温度38．O℃。I5、甲苯、吐温
100的加入量分别nOl∥L、50mL／L、n1吕／L。
气流干燥处理：10g过滤分离的细胞均匀地分
布在细目过滤网上，过滤网放在一个相应大小地布
氏漏斗上，从漏斗底部均匀地通入压缩空气，24气
下气流干燥24h”1。
1．3．3活细胞鉴别
次甲基亚蓝染色法测定。
1．3．4胞内物质释放
将2．0g湿细胞或0．5g空气干燥细胞均匀地
悬浮在10mL磷酸钾缓冲液中，用50mmolKH2P04
和1．0moVLKOH调节pH6，6～7．0，在给定的温
度下间隙搅动提取2．0h；离心分离，取上清液分析
释放的胞内物质浓度。以缓冲液作空白，于波长
260nm测定提取液的吸光度A．；零时(未处理)提
取液的吸光度^为基值，胞内释放到提取液中物质
的吸光值A=A；一Ao”⋯。
2结果与讨论
2．1酵母细胞的渗透性
利用酵母细胞酶系合成ATP，细胞膜的存在使
得胞内酶不能完全发挥作用，另外，也限制了细胞
对极性物质的运输。
采用营养缓冲液、添加I5的n01g／L的营养
缓冲液、体积分数为2％的甲苯营养缓冲液、体积分
数5％的吐温100的营养缓冲液和气流干燥等对培
养的全细胞进行促渗透化处理。吸光值A对应于
胞内物质释放程度，直观的显示出渗透效果。其结
果如表1所示。
万方数据
-78· 生物加工过程 第5卷第4期
表1不同方法处理的细胞促渗透性
Table1 De目eeofyeasteellpermeabilizationunder
varioustreatmentthods
方法 雌oC7热ODm
从表1可以看出，经处理的细胞与未处理的细
胞相比，其渗透性明显改观；添加新型破壁剂0．01
g／L的营养缓冲液的细胞渗透性可与气流干燥的效
果相媲美。
2．2促渗透剂对ATP合成的影响
几十年来研究工作者对酵母细胞合成ATP反
应的机理做了大量的研究，认为该机理与糖酵解途
径而不是与TCA途径相关联。酿酒酵母合成ATP
需糖酵解途径偶联腺苷激酶和腺苷酸激酶。渗透
化处理的细胞酒精发酵过程中产生的能量，被腺苷
加以利用，以高能磷酰化合物ATP的形式被贮存。
经渗透化处理的细胞，酒精发酵能力提高。由于ATP
的合成与之相偶联，就此而言，酒精代谢途径越发
达，越有利于ATP的合成。不同处理方式对酿酒酵
母ATP合成的影响如图1。
从图1可看出，经渗透化处理的细胞，其合成
ATP能力有大幅度的提高；I5破壁剂对酵母细胞促
渗透化后的酒精及ATP生长能力最高，其次是甲
苯、吐温100，说明酒精产量与ATP产量密切相关。
2，3细胞膜的渗透性对酒精生产能力的影响
经促渗透化处理的酿酒酵母合成ATP，涉及到
14个酶，同时需要一些辅酶和辅因子如钾离子、镁
离子等⋯1。葡萄糖进人反应体系，进行分解代谢，
如图2所示，糖酵解主要是酒精发酵。经促渗透化
处理的细胞，提高了糖的转运，高糖浓度明显磷酸
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周1 不同处理方式对酿酒酵母ATP台成的影响
Fig1 ProductionofATPunderdiffercnttreatmentthods
抑制戊糖等途径，葡萄糖绝大部分代谢为酒精m1。
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图2酿酒酵母台成ATP途径
Fig2 PathwaysforATP日Ⅱ【I目jinSomharomycescere“／s／ae
从图3可以看出，经过促渗透化处理的细胞，其
酒精发酵能力有明显提高。经I5促渗透化的酿酒
细胞酒精发酵能力提高极大，最终酒精质量浓度可
达6g／L，对葡萄糖的转化率84％。另外，实验测定
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万方数据
2007年11月许兵等：PAG—OA衍生物I5对酿酒酵母转化合成ATP的影响 ·79
的最终残糖浓度基本为0，此现象说明可能在酿酒
酵母转化合成三磷酸腺苷初期存在着其他的糖代
谢途径，例如甘油合成途径。以上实验说明经I5
促渗透处理的酿酒酵母磷酸化合成三磷酸腺苷，主
要是与糖酵解途径相关联。
}．-l--盟Nutri嚣tionnbcuuttmer／r一一——·}．={裟誊。。／
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如
图3不同处理方式。酿酒酵母酒精生产能力
Fig．3Degreeofyeastcellalcoholproduction
tleatedbyvariousmethods
2．4对I5促渗透机理初探
I5促渗透作用过程可以分为5步，即吸附到细
菌表面，穿透细胞壁，与细胞膜结合，扰乱细胞膜组
成，导致胞内物质泄漏。
带正电PAG—OA衍生物I5首先被吸附到菌体
表面，穿透细胞壁，与细胞膜的类脂层和蛋白质层
结合，阻碍了细胞对外界的正常离子交换和物质交
换，并破坏控制细胞渗透性的原生质膜，使细胞内
物质外渗。KimLewis等”“研究了季铵盐聚阳离子
的促渗透化机理，并且研究了不同相对分子质量的
季铵盐聚合物的抗菌活性的不同。结果表明，为了
达到较好的杀菌效果，聚阳离子必须要有足够长的
链。并且通过碘化丙锭染色法证明季铵盐的目标
主要是细胞膜，因为这种红色的荧光染料只能进入
到细胞膜损失的细胞，此实验说明了破坏细胞膜是
表面接触杀菌聚合物的杀菌机理，聚合物长链可以
穿过微生物细胞的外层细胞壁将活性部分伸人到
细胞膜从而杀死细胞。
在促渗透过程中，带正电荷的I5首先选择性
的吸附到带负电的细胞膜表面，形成一层高浓度的
离子基团，改变了细胞膜导电性、表面张力、溶解
性，其疏水性基团和亲水性基团可分别渗入菌体细
胞膜的类脂层与蛋白质层，从而改变菌体细胞浆膜
的渗透性，使细胞内物质外渗，导致酵母菌体窒息
死亡或抑制其生长。同时，其官能团烷氧基等可与
蛋白质上的一些基团发生反应形成络合物，从而使
蛋白质变性。
3小结
经I5促渗透处理的酿酒酵母细胞能很好释放
胞内代谢极性物质，ATP得率为0．038raoL／L，转化
率98％；三磷酸腺苷合成时间缩短为1．5h。
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