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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(2):208-216
收稿日期 ： 2014-07-14
基金项目 ：云南省创新团队基金项目（2011C1123），国家自然科学基金项目（31160237）
作者简介 ：韩冰，男，硕士研究生，研究方向 ：自噬与油脂代谢关系的研究 ；E-mail ：1017830953@qq.com
通讯作者 ：崔清华，女，教授，研究方向 ：自噬与肿瘤关系研究 ；E-mail ：cuiqinghua@ynu.edu.cn
细胞自噬（autophagy）是真核细胞中高度保守
的细胞内自身降解的代谢过程［1］，通常细胞自噬的
发生主要是将部分胞浆和坏死或衰老的细胞器隔离
在具有双层膜结构的囊状自噬体中，通过自噬体运
输，将这些细胞成分运送到降解性的细胞器（如动
物细胞的溶酶体和植物细胞的液泡）中进行分解，
分解产生的大分子物质进一步回收利用。自噬是细
胞内自我更新的重要途径，对细胞的生命维持和细
胞繁殖具有重要的意义。在真核细胞中，主要存在
3 种类型的自噬，即大自噬、小自噬和分子伴侣介
导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。这
斯达油脂酵母中自噬与油脂积累的关联性分析
韩冰  杨琴  崔清华
（云南大学生命科学学院，昆明 650091）
摘 要 ： 旨在证明斯达油脂酵母中自噬参与油脂积累过程。在不同油脂积累水平下，检测相关自噬基因的表达，观察自噬
与油脂积累是否有潜在相关性；用自噬促进剂促进自噬后，观察酵母油脂积累水平是否有差异。结果表明，与油脂低积累水平相比，
在油脂高积累条件下，斯达油脂酵母自噬水平较低 ；用自噬促进剂处理后，酵母油脂积累降低。在斯达油脂酵母中，自噬与油脂
积累成负相关性，自噬水平的提高会使酵母中油脂积累降低。
关键词 ： 自噬 ；斯达油脂酵母 ；油脂积累 ；泛素样共轭体系
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.031
An Investigation of Cellular Autophagy and Oil Accumulation in the
Oleaginous Yeast Lipomyces starkeyi
Han Bing Yang Qin Cui Qinghua
（The School of Life Sciences，Yunnan University，Kunming 650091）
Abstract: It was to prove autophagy is involved in the accumulation of lipid in Lipomyces starkeyi. Detecting the expression of autophagy-
related gene in different lipid accumulation level to determine whether autophagy is potentially involved in lipid accumulation; promoting
autophagy by autophagy accelerator to observe whether there are differences in yeast lipid accumulation level. Results showed that the level
of autophagy is low in high lipid accumulation condition compare with low condition. After treatment with autophagy accelerator, the lipid
accumulation in yeast is reducing. In Lipomyces starkeyi, autophagy is negatively related to lipid accumulation, the improving of autophagy level
will reduce the lipid accumulation in yeast.
Key words: autuphagy ；Lipomyces starkeyi ；oil accumulation ；autophagy ubiquitin-like conjugated system
些自噬过程不仅有明显的功能分工，而且它们的作
用机理显著不同［2］。由于在小自噬和分子伴侣介导
的自噬的研究进展一直比较缓慢，一般所说的自噬
通常指的是大自噬。大自噬的发生主要是通过自噬
相关蛋白 Atg（Autophagy-related genes）来实现的。
一般来说，大自噬主要涉及两个过程 ：自噬的
诱导（图 1-A）和自噬体的形成（图 1-B）。在自噬
体的形成和成熟过程中起关键作用的是两个自噬泛
素样共轭体系 ：Atg8-PE（磷脂酰乙醇胺）和 Atg12-
Atg5-Atg16 系统［3］。细胞自噬水平一般通过共轭体
系的表达量来衡量。Atg8-PE 体系的形成是通过新
2015,31(2) 209韩冰等：斯达油脂酵母中自噬与油脂积累的关联性分析
合成的 Atg8 蛋白的 C 末端甘氨酸残基在半胱氨酸
蛋白酶 Atg4 的作用下暴露出来，随后在泛素活化样
酶（E1）Atg7 和泛素结合样酶（E2） Atg3 的作用下
激活 Atg8，并通过甘氨酸与 PE 结合［4］。此外，新
合成的 Atg12 蛋白在 E1 样酶 Atg7 和 E2 样酶 Atg10
的作用下与 Atg5 结合，最终 Atg12-Atg5 缀合物与
Atg16 结合形成 Atg12-Atg5-Atg16 体系。
真核细胞自噬的发生通常是程序化的调控过程，
特别是由丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 TOR（Target of
rapamycin）介导的信号调控通路，在自噬的发生过
程中经常起着主导作用。在正常营养条件下，TOR
处于激活状态，细胞自噬受到抑制 ；当细胞处于营
养饥饿的条件下，TOR 被抑制，使得 Atg13 与 Atg1、
Atg17 的亲和力上升，形成大量的 Atg1-Atg13-Atg17
激酶复合物，这些激酶复合物进一步诱导细胞自
噬 增 强［5］。 除 了 TOR 信 号 通 路， 磷 脂 酰 肌 醇 -3-
激酶（PtdIns3K）复合物 I 也对细胞自噬起着非常
重要的调控作用。PtdIns3K 复合物 I 是一种脂质激
酶，包含 4 种组分，即 Vps34、Vps15、Vps30/Atg6
和 Atg14［6］。PtdIns3K 复 合 物 I 定 位 到 PAS（Pre-
autophagosomal structure/Phagophore assembly site）位
点（自噬体形成的位点）并形成磷脂酰肌醇 -3-磷酸
（PtdIns（3）P）进而通过 PtdIns（3）P 募集自噬体
形成必须的 Atg 蛋白。PtdIns（3）P 主要的下游蛋
白是 Atg18 和 Atg21，Atg2-Atg18 复合体在自噬体膜
的转运中发挥着重要作用。
A ：自噬的诱导过程 ；B ：自噬体的形成过程
图 1 自噬过程
自噬通常参与细胞的发育和分化、维护细胞
的生命以及调节生命的延长等重要的生理过程。最
近的研究发现自噬可能与油脂代谢有紧密的联系。
Lapierre 等［7］在线虫中发现，自噬作用参与了线虫
油脂代谢，通过清理细胞内多余脂肪，促进了能量
的重新利用，最终延长了机体的寿命 ；Heaton 和
Randall［8］研究发现登革病毒能够通过调控寄主自噬
来提高油脂代谢水平，进而产生大量 ATP 提供病毒
复制的能量 ；Vescovo 等［9］的研究发现，自噬可以
抵消由丙型肝炎病毒引起的油脂代谢改变，自噬的
中断会促进携带丙型肝炎病毒病人脂肪肝的发展 ；
特别是 Singh 等［10］在小鼠的肝细胞中发现，自噬参
与了脂滴中油脂的降解，并且提出了一个“脂类自
噬”的模型，在调控通路的作用下自噬泛素样共轭
体系会在脂滴外膜上聚集并包裹着一部分脂滴形成
“脂类自噬体”，脂类自噬体包裹着含有三酰甘油的
Atg13
PPP
Atg17
A B
Atg13
Atg1
Atg17
Atg8GR㠚ಜփ
Atg8G
Atg8G
Atg4
Atg1
TOR
㩕ޫ侕侯
Atg7
Atg3 Atg16
Atg10
Atg7
Atg5
Atg27
Atg23
Atg8G অս㟌㔃ᶴ 㚼ࣘ㳻ⲭ ཆઘս⛩Atg9Atg11Arp2Arp3PASVps15 Vps34Atg14Atg6Bc1-2
Atg12G
Atg12G
Atg12G
PE
自
噬
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2210
脂滴与溶酶体融合并被溶酶体内的水解酶水解形成
脂肪酸，随后脂肪酸在线粒体内通过 β-氧化为细胞
提供能量。这些在动物细胞中的研究都预示着自噬
在油脂代谢中的主要作用是通过降解脂肪来实现的。
然而，Zhang 等［11］的研究发现在产油酵母 - 圆红冬
孢酵母（Rhodosporidium toruloides）中，在细胞增殖
和油脂累积过程中自噬相关基因，如 Atg1、Atg2、
Atg8 和 Atg20，表达水平显著上调，强烈预示了这
些自噬相关基因可能参与了油脂的生物合成过程。
但是对自噬相关基因参与油脂累积的代谢机理至今
知之甚少。在酵母中，自噬相关基因是否参与调控
了油脂的生物合成还不清楚。
斯 达 油 脂 酵 母（Lipomyces starkeyi） 是 一 种 重
要的产油酵母，由于细胞能够利用多样的碳源，高
效累积储存油脂（单细胞油脂累积能够达到干重
65%），斯达油脂酵母在工业上利用微生物工程化产
油的生产实践中受到高度关注［12］。本研究通过调
查斯达油脂酵母在油脂累积过程中自噬泛素样共轭
体系基因的表达规律，揭示酵母中细胞自噬与油脂
积累的内在联系，不仅有助于探讨在酵母中自噬相
关基因参与调控油类代谢的分子机理，而且对提高
产油效率的斯达油脂酵母菌株工程化改良具有参考
意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 斯达油脂酵母 AS 2.1560，由中国普
通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）提供，保藏
于 -80℃中。
1.1.2 培 养 基 YPD 培 养 基 成 分 包 括 ：酵 母 膏
10 g/L ；蛋白胨 20 g/L ；葡萄糖 20 g/L ；琼脂 15 g/L
（ 固 体 培 养 基 ）。 基 础 发 酵 培 养 基［13］ 成 分 包 括 ：
KH2PO4 12.5 g/L ；Na2HPO4 1 g/L ；（NH4）2SO4 0.5 g/L ；
MgSO4·7H2O 2.5 g/L ；CaCl2·2H2O 0.25 g/L ；酵母浸
粉 1.9 g/L ；葡萄糖 36 g/L ；微量元素溶液 0.625 mL ；
pH5.0。其中微量元素溶液的成分 ：FeSO4·7H2O 16
g/L ；MnSO4·H2O 4 g/L ；Al2（SO4）3·18H2O 5.52
g/L ；CoCl2·6H2O 2.92 g/L ；ZnSO4·7H2O 0.8 g/L ；
Na2MoO4·2H2O 0.8 g/L ；CuCl2·2H2O 0.4 g/L ；H3BO3
0.2 g/L ；KI 1.6 g/L，所有成分溶于 5 mol/L 的盐酸中。
基础发酵培养基各成分溶解于去离子水中，高压
灭菌。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 用接种针蘸取少量菌液，在 YPD
平板上划线培养直至出现单克隆（约 5 d），挑取单
克隆于装有 30 mL YPD 液体培养基的三角瓶（100
mL）中，30℃，200 r/min 培养 2 d。吸取 500 μL 菌
液于新的 YPD 液体培养基中，30℃，200 r/min 培养
2 d，在 600 nm 处检测菌液 OD 值并根据 OD 值吸取
一定量的菌液于 2 mL EP 管中，离心收集并用灭菌
水洗 2 遍，然后分别转移到装有 30 mL 碳氮比 30 和
150 发酵培养基的三角瓶（100 mL）中，使菌液起
始 OD 值为 0.4，30℃，200 r/min 培养，每 24 h 收集
菌液进行后续检测。不同碳氮比培养基是在基础发
酵培养基的基础上配制的，在其他成分不变的前提
下，改变基础发酵培养中氮源（酵母浸粉和硫酸铵）
的含量使得碳元素和氮元素的比值为 30 和 150（硫
酸铵和酵母浸粉同比例增加或减少）。
1.2.2 Atg 蛋白的鉴定与序列分析 以酿酒酵母数据
库（http ：//www.yeastgenome.org/）和拟南芥数据库
（http ：//www.arabidopsis.org/） 里 已 知 的 Atg 蛋 白 序
列作为探针，在斯达油脂酵母数据库（http：//genome.
jgi.doe.gov/pages/blast.jsf?db=Lipst1_1） 中 进 行 blastp
比对，对于具有显著 E 值（<10-5）的蛋白被认为是
潜在的斯达油脂酵母 Atg 蛋白。同样的方法用于鉴
定毕赤酵母（Pichia pastoris）潜在的 Atg 蛋白。在
在线服务器 GSDS（http ：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）中，
通过比对酿酒酵母、毕赤酵母和斯达油脂酵母共轭
体系中自噬相关基因的基因组和 cDNA 序列，检测
这些基因的外显子和内含子的分布。
1.2.3 油脂含量的检测 采用磷酸 - 香草醛法检测
油脂含量［14］。取 2 mL 菌液，12 000 r/min 离心 10
min，蒸馏水洗 2 次。定容至 2 mL，取 50 μL（对照
取蒸馏水），加入一带塞试管中，加入 18 mol/L H2SO4
1 mL，沸水浴中孵化 10 min，常温水浴 5 min，加入
2.5 mL 磷酸 - 香草醛试剂，37℃保温 1 h，常温水浴
10 min，于 530 nm 测其 OD 值。剩余的 1.95 mL 菌
液烘干，测量干重。油脂含量 =（0.10718+3.63× 吸
光度）/ 干重。
2015,31(2) 211韩冰等：斯达油脂酵母中自噬与油脂积累的关联性分析
1.2.4 自噬共轭系统的表达检测 采取液氮研磨法
提取 RNA。离心收集一定量的酵母菌液，用蒸馏
水洗涤 3 遍，离心收集菌体并放入液氮预冷的研钵
中，加入液氮研磨将研磨后的菌体转移到装有 1 mL
Trizol 的试管中，在涡旋仪上震荡 30 s，室温静置 5
min，4℃，12 000 r/min 离心 15 min ；取上清加入 0.2
mL 氯仿，震荡 15 s，静置 5 min ；4℃，12 000 r/min
离心 15 min，取上清，加入等量的异丙醇，轻轻混
匀， 室 温 静 置 10 min ；4 ℃，12 000 r/min 离 心 10
min，弃上清 ；加入 1 mL 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀，
4℃，7 500 r/min 离心 5 min，弃上清 ；待乙醇挥发
完全，加入适量 RNase free 水溶解。吸取少量提取
的 RNA 通过 1% 琼脂糖凝胶进行检测，确定提取的
RNA 无明显降解（有 3 个明亮条带），通过 Thermo
Scientific NanoDrop 2000 进 行 浓 度 和 纯 度 的 检 测，
A260/A280 值在 1.8-2.0 之间说明 RNA 纯度较好。提取
的 RNA 通过宝生物公司的 PrimeScriptTM RT reagent
Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time） 试 剂 盒 进
行逆转录，逆转录体系中加入 1 μg 的 RNA 模板，
逆转录后通过 Thermo Scientific NanoDrop 2000 检测
体系中 cDNA 浓度，并将所有样品的 cDNA 浓度稀
释到 100 ng/μL。通过 Real-time PCR 的方法检测自
噬共轭体系转录水平的表达，使用的仪器为 Applied
Biosystems7300，使用的荧光染料为宝生物的 SYBR
Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），PCR 体系为 20
μL，cDNA 模板量加入 200 ng。共轭体系所涉及到
的基因引物序列如表 1 所示，引物扩增片段为 80-
150 bp 之间，Tm 值为 60℃左右。
表 1 Real-time PCR 引物
基因 引物序列（5-3）
Actin F: AGAAGGAGATAACCGCTTTGG R: AGGGAGGCGAGAATGGAAC
Atg3 F: GTCTCGTTCCAGCACTTCTCC R: GTCATCGTCCTCGGGCTTA
Atg4 F: ACAAATCTGGGTTCACTTCGG R: GTCGATCCAGGCTGCGTAT
Atg5 F: GACTGATTCGGATGAAATGTGG R: ATGGCAATAGCTTCTTGGTGAT
Atg7 F: CGTTCCCCGCTGTTCATT R: CGATTTATGCCAACTTGTGATG
Atg8 F: CTAAGTTCAAAGACGAGCACCC R: TCCACCTTCTCGCAGATAACC
Atg12 F: ACAAGAAACCATTCCCGAAGA R: AGTAGCAGGGCGAGCATAAAC
1.2.5 自噬诱导剂 - 雷帕霉素处理对油脂累积的影
响 为了检测自噬活性增加后对油脂累积的影响，
在斯达油脂酵母培养基中增加了细胞自噬诱导剂 -
雷帕霉素。首先将雷帕霉素溶解于 DMSO 中（使
其储存浓度为 10 000 μmol/L），再分别加入到碳氮
比 30 和 150 培养基中，使雷帕霉素在培养基中的
浓度为 0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、
1 μmol/L 和 10 μmol/L（不同浓度的雷帕霉素溶解于
相同体积的 DMSO 中），揺菌培养 4 d 后，检测细胞
的油脂含量。
2 结果
2.1 斯达油脂酵母中自噬相关基因的鉴定与序列
分析
基于斯达油脂酵母全基因组序列，以酿酒酵母
和拟南芥中已知的 Atg 基因氨基酸序列为搜索探针，
以序列相似性 E 值 <10-5 阈值为标准，共鉴别了 13
个潜在的斯达油脂酵母 Atg 基因（表 2），根据这些
基因在酿酒酵母和拟南芥自噬过程中的作用，13 个
潜在的斯达油脂酵母 Atg 基因作用于不同自噬过程，
包括 Atg3、Atg4、Atg5、Atg7、Atg8、Atg12 参与形
成以 Atg8 和 Atg12 为主体的自噬泛素样共轭体系，
Atg1、Atg6、Atg13、Atg20 和 Vps15、Vps34 参与到
上游的自噬调控通路中，Atg2、Atg9 和 Atg18 参与
到 Atg9 循环系统中。
通常，自噬泛素样共轭体系在自噬过程中发挥
着极其重要的作用。参与这些过程的 Atg 基因结构，
尤其是外显子（exon）和内含子（intron）在基因组
中的分布规律，包括数量和发生位置，能够反映基
因的产生和进化过程［15］。为了进一步检查酵母自噬
泛素样共轭体系在基因结构上的保守性，我们根据
毕赤酵母的基因组序列，鉴别了毕赤酵母泛素样共
轭体系相关的基因，比较分析了酿酒酵母、毕赤酵
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母和斯达油脂酵母泛素样共轭体系基因的结构，包
括内含子的数目和位置、特征性位点。如图 2 所示，
酿酒酵母 6 个基因都没有内含子，毕赤酵母的 Atg8
和 Atg12 各有 1 个内含子，而斯达油脂酵母的每个
Atg 基因都有内含子，其中 Atg3 和 Atg12 的内含子
数为 1 个，Atg4、Atg5 和 Atg8 的内含子数均为 3 个，
Atg7 的内含子数为 5 个。比较斯达油脂酵母和毕赤
酵母内含子发生的位置发现，尽管毕赤酵母的 Atg8
和 Atg12 各只有一个内含子，但他们发生的位置和
斯达油脂酵母相似。通过比对在酿酒酵母中每个基
因已经鉴别到的特征位点发现，斯达油脂酵母和毕
赤酵母都具有相似的位点，包括 Atg3 和 Atg7 中的
半胱氨酸位点（C），Atg5 中的赖氨酸受体位点（K），
Atg8 和 Atg12 上参与共价结合的保守甘氨酸位点（G）
（毕赤酵母未检出保守甘氨酸位点），以及 Atg4 蛋白
水解活性的半胱氨酸位点（C）。这些结果说明酵母
共轭体系蛋白的保守性很强，可能与 Atg 蛋白相似
的功能有关。然而，这些基因序列的长度以及特征
位点的位置在 3 个酵母中有很大的变异，特别是斯
达油脂酵母在基因结构上和其它两个酵母有更大的
差异，反映了在系统发生上斯达油脂酵母和其它两
种酵母的关系较远。
表 2 斯达油脂酵母自噬相关蛋白
蛋白体系 自噬蛋白 基因登录号 在酵母中的功能与特征
磷脂酰肌醇 -3- 激酶复合物 招募自噬相关蛋白
Atg6 scaffold_2 ：588671-590172 VPS30
VPS15 scaffold_12 ：674166-679610 蛋白激酶
VPS34 scaffold_13 ：603276-606071 磷脂酰肌醇 -3- 激酶
泛素样共轭体系 （Atg12） 形成 ATG12-ATG5 共轭复合体
Atg5 scaffold_12 ：279932-280977 ATG12 的结合蛋白
Atg12 scaffold_1 ：650713-651185 泛素样蛋白，与 ATG5 作用
泛素样共轭体系 （Atg8） 形成 ATG8-PE 复合体
Atg3 scaffold_5 ：929693-931418 泛素样结合酶
Atg4 scaffold_13 ：608360-610317 半胱氨酸蛋白酶
Atg7 scaffold_3 ：413790-416066 泛素样活化酶
Atg8 scaffold_7 ：527005-527829 泛素样蛋白，与 ATG3 作用
Atg9 循环系统 自噬体膜的循环过程
Atg9 scaffold_5 ：827702-829396 膜蛋白，起到自噬体膜载体的作用
Atg2 scaffold_14 ：539201-545007 作用于 ATG9 的循环过程
Atg18 scaffold_6 ：636851-639187 作用于 ATG2 的定位
Atg1 复合体 自噬的诱导
Atg1 scaffold_5 ：606237-608960 丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶
Atg13 scaffold_2 ：940894-943530 磷蛋白
Atg20 scaffold_10 ：740383-742510 与 ATG1-ATG13 复合体结合
2.2 斯达油脂酵母油脂积累过程中泛素样共轭体
系基因的表达分析
研究已经发现酵母细胞油脂累积通常受到培养
基中的碳氮比的强烈诱导［16］。在我们前期的研究发
现，斯达油脂酵母在碳氮比为 30 和 150 的培养条件
下，细胞生长良好、且累积油脂呈现了很大的差异。
因此，本研究进一步检测了斯达油脂酵母分别在碳
氮比为 30 和 150 的培养条件下，不同时期油脂的累
积规律（图 3）显示，油脂快速累积主要发生在细
胞培养的前 4 d，在培养第 4 天时细胞干重的油脂含
量相差很大，在碳氮比为 30 和 150 的培养条件下油
脂累积分别为 31.2% 和 49.4%。
为探讨斯达油脂酵母油脂的累积是否与自噬
相关，我们同时检测了在细胞生长过程中，泛素样
自噬共轭体系相关基因（包括 Atg3、Atg4、Atg5、
Atg7、Atg8 和 Atg12）随着油脂的积累在转录水平上
基因的表达变化。由于油脂快速累积主要发生在细
胞培养的前 4 d，因此我们集中检查了斯达油脂酵母
细胞在前 4 d 的表达规律。将碳氮比 150 条件下培
养 1 d 的细胞中自噬相关基因的表达量设为 1，其它
2015,31(2) 213韩冰等：斯达油脂酵母中自噬与油脂积累的关联性分析
时期基因的表达量和培养 1 d 的比较，获得基因的
相对表达量。如图 4 所示，在碳氮比为 30 培养下条
件 6 个 Atg 基因的表达均高于碳氮比为 150 培养条
件下基因的表达，说明斯达油脂酵母在高的碳氮比
培养下 Atg 基因的表达降低。在碳氮比为 30 的培养
条件下，随着培养时间的增加，Atg3、Atg4、Atg5
图 2 斯达油脂酵母（Ls）、毕赤酵母（Pp） 和酿酒酵母（Sc）自噬共轭体系基因结构图
100 bp
Legend: Exon Intron conservative-position
100 bp
100 bp
100 bp
100 bp
100 bp
LsAtg3
PpAtg3
ScAtg3
LsAtg4
PpAtg4
ScAtg4
LsAtg5
PpAtg5
ScAtg5
LsAtg7
PpAtg7
ScAtg7
LsAtg8
PpAtg8
ScAtg8
LsAtg12
PpAtg12
ScAtg12
C249
C231
C234
C161
C166
C147
K144
K151
K149
C529
C522
C507
C186
C141
C116
C116
117aa
141aa
186aa
315aa
139aa
118aa
C116
630aa
652aa
668aa
294aa
282aa
292aa
494aa
514aa
486aa
310aa
318aa
345aa
和 Atg7 的基因表达均呈下降趋势，而 Atg8 呈上升
趋势，Atg12 在开始阶段呈上升趋势，随后开始下降；
在碳氮比为 150 的培养条件下，随着培养时间的增
加，6 个基因的表达量变化不大。
2.3 促进自噬可降低油脂积累
雷帕霉素（rapamicin）作为 TOR 的抑制剂，有
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2214
助于 Atg13 的去磷酸化，进而促进 Atg1-Atg13-Atg17
激酶复合物的形成并诱导自噬。为了检测细胞自噬
对油脂累积的影响，我们利用自噬诱导剂雷帕霉素，
分别在碳氮比 30 和碳氮比 150 培养条件下促进酵母
的自噬活动，培养 4 d 后检测不同雷帕霉素处理浓
度的酵母生物量（通过检测 OD 值），发现酵母生物
量变化不大，说明不同浓度的自噬诱导剂对细胞生
长的影响非常有限。进一步检测细胞的油脂含量，
结果（图 5）显示，在碳氮比 30 和碳氮比 150 的培
养条件下，随着雷帕霉素处理浓度的增加斯达油脂
A ：Atg3 ；B ：Atg4 ；C ：Atg5 ；D ：Atg7 ；E ：Atg8 ；F ：Atg12
图 4 自噬共轭体系相关基因的表达
60
60
40
30
20
10
0
1 2 3 4 5 6 7
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图 3 不同碳氮比条件下的油脂累积曲线
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酵母的油脂含量呈下降趋势，在低浓度（如 1 和 10
nmol/L）的雷帕霉素处理下，斯达油脂酵母细胞油
脂累积没有显著变化，而在高浓度（如 100-10 000
nmol/L）的雷帕霉素处理下，油脂累积显著降低，
特别是在碳氮比 150 条件下，高浓度的雷帕霉素处
理大幅度降低了斯达油脂酵母细胞的含油量。这个
结果说明在斯达油脂酵母中细胞自噬活性增加确实
能够减少细胞储存油脂的累积。
3 讨论
本研究基于斯达油脂酵母的基因组序列，利用
生物信息学方法鉴别了参与细胞自噬的 13 个 Atg 基
因，集中分析了斯达油脂酵母泛素样共轭体系基因
的结构特征，通过与酿酒酵母、拟南芥 Atg 基因进
行序列比对发现，斯达油脂酵母不仅存在自噬过程
中所涉及到的关键 Atg 基因，而且自噬泛素样共轭
体系基因的保守位点与酿酒酵母完全相同，这说明
真核生物中自噬是一个高度保守的过程。然而基因
结构的显著差异，说明斯达油脂酵母自噬共轭体系
基因在系统发生上与毕赤酵母和酿酒酵母关系较远。
研究已经发现在产油酵母的培养过程中碳氮比
能够显著影响细胞的油脂累积，增加碳源或减少氮
源都能促进产油酵母的油脂累积。本研究利用减少
2015,31(2) 215韩冰等：斯达油脂酵母中自噬与油脂积累的关联性分析
氮源的方式来调节碳氮比，在高碳氮比的条件下（碳
氮比为 150）斯达油脂酵母细胞累积油脂显著增加。
在高碳氮比培养条件下，随着细胞油脂的累积，参
与自噬相关基因的表达均显著低于低碳氮比条件下
的细胞培养，可能预示着随着细胞自噬活动降低确
实减少了油体的降解，从而增加了油脂的累积。然而，
在高碳氮比条件下，实际上相当于减少了培养基中
的氮源，使细胞处于缺氮的逆境中，由于氮源是蛋
白质合成的主要成份，而细胞自噬活动主要是依靠
Atg 蛋白的相互作用来实现的，因此，本研究在高碳
氮比条件下 Atg 基因的表达降低也可能是由于氮源
的缺乏而引起的。
在利用酵母细胞自噬诱导剂增加 Atg 活性的试
验中，结果显示了在一定浓度范围内自噬诱导剂雷
帕霉素不影响斯达油脂酵母的细胞生长，但随着雷
帕霉素的增加细胞油脂的累积显著降低，说明酵母
细胞自噬活动可能直接降解细胞内油体，而减少细
胞油脂累积。从本研究结果来看，在产油酵母油脂
累积过程中，细胞自噬的活动和油脂累积呈负相关，
暗示了细胞自噬相关基因确是通过降解活动参与了
产油酵母的油脂代谢活动。然而，自噬活动在酵母
细胞繁殖和生长过程中参与和调控了广泛的代谢和
生理过程，且生理调控机制通常是复杂的［17］，而且
本研究也缺乏在蛋白水平上引起自噬活动变化的证
据，自噬相关基因对油脂累积的调控是通过调节油
脂合成通路中的关键酶，从而减弱了油脂累积，还
是直接参与油体的降解减少油脂的累积，这些问题
尚不清楚，有待深入研究。
4 结论
本研究基于斯达油脂酵母的全基因组鉴别了 13
个参与细胞自噬过程的 Atg 基因，针对泛素样共轭
体系的自噬基因，结合其它酵母自噬基因的序列结
构，集中分析、比较了斯达油脂酵母泛素样共轭体
系基因的结构特征，发现虽然酵母自噬基因的功能
位点很保守，但在物种间基因的结构变异较大。在
不同碳氮比的培养条件下，斯达油脂酵母细胞油脂
累积和泛素样共轭体系基因的表达呈负相关，通过
人为调节细胞自噬水平，进一步验证了细胞油脂累
积和自噬活性呈负相关的规律，强烈地预示着酵母
细胞自噬活动参与（或影响）了油脂累积过程。
参 考 文 献
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A ：碳氮比 30 ；B ：碳氮比 150
图 5 雷帕霉素处理对斯达油脂酵母的油脂含量影响
40
䴧ᑅ䴹㍐⎃ᓖ/(nmol·L-1)1 10 100 1000 100000⋩㜲
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ਜ਼䟿/% 505545
35
40
0
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（责任编辑 马鑫）