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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):93-99
作为粮饲能兼用的作物，高粱［Sorghum bicolor
（L.）Moench］对全球农业生态系统的贡献日益显
现［1］。按年产量计算，高粱是世界上第五大重要的
谷类作物，仅次于玉米、小麦、水稻和大麦（http：//
www.fao.org）。更值得注意的是，高粱具有其他作物
无法比拟的多重抗逆性，在雨水稀少的美国南部平
原和非洲东北部，以及中国东北和新疆广阔的干旱
收稿日期 ： 2015-01-29
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31271790，31471558）
作者简介 ：杨泽伟，男，硕士研究生，研究方向 ：植物抗逆机理 ；E-mail ：yangzewei555@sina.com
通讯作者 ：朱莉，女，副研究员，硕士生导师，研究方向 ：植物抗逆分子生物学 ；E-mail ：zhuli01@caas.cn
高粱 SbGABA-Ts 基因的克隆、原核表达及纯化
杨泽伟1，2  王龙海1，2  朱莉2  汪海2  黄大昉2  郎志宏2
（1. 西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010 ；2. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： 植物中 GABA（γ-氨基丁酸）代谢与植物生长发育、信号传递及逆境响应等过程密切相关，而参与 GABA 代谢的关
键酶 GABA-T（γ-氨基丁酸转氨酶）在重要农艺作物中的研究相对滞后。利用同源性分析在高粱基因组数据库中获得两个 γ-氨基丁
酸转氨酶（SbGABA-T）基因，RT-PCR 方法进行基因克隆，并连入原核表达载体 pET28a（+），转化 E. coli BL21（DE3）进行基因
异源表达分析。结果表明，包含 SbGABA-T 编码区全长的融合蛋白主要在包涵体中表达，而去除了 SbGABA-T N 端信号肽的融合蛋
白以部分可溶的形式存在。进一步优化表达条件，IPTG 浓度为 1 mmol/L 时，16℃低温诱导 18 h，即可获得大量可溶性融合蛋白。
用带 His 标签的镍柱对融合蛋白进行了纯化。
关键词 ： 高粱 GABA-T ；原核表达 ；纯化 ；信号肽
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.015
Cloning，Prokaryotic Expression of Sorghum bicolor SbGABA-Ts
Yang Zewei1，2 Wang Longhai1，2 Zhu Li2 Wang Hai2 Huang Dafang2 Lang Zhihong2
（1. Southwest University of Science and Technology，School of Life Science and Engineering，Mianyang 621010 ；2. Biotechnology Research
Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: GABA is a ubiquitous four-carbon，non-protein amino acid，and has been associated with growth and development，
signaling transduction，and stress response in plants. GABA transaminase（GABA-T），the enzyme responsible for the catabolism of GABA，
has not been fully explored，especially in several important crops. Two putative GABA transaminase genes（GABA-T）from Sorghum bicolor
were obtained based on homology analysis with the identified GABA-Ts of other plants and RT-PCR. Subsequently，the two SbGABA-T genes
and corresponding N-terminal truncated SbGABA-Ts were inserted into pET28a（+）vector and individually imported into E. coli strain
BL21（pLysS，DE3）. Percentage improvement of soluble recombinant proteins were showed when removing the targeting peptide sequence
of SbGABA-Ts. The fusion proteins were expressed partially in soluble form after incubating for 18 h at 16℃ by adding 1 mmol/L IPTG，and
purified through nickel-affinity chromatography column.
Key words: Sorghum bicolor GABA-T ；prokaryotic expression ；purification ；signal peptide
盐碱地都有广泛的种植。目前，已完成对美国优良
高粱自交系 BTx623 的测序［2］。高粱基因组的高密
度遗传图谱、表达图谱及基因功能鉴定等研究［3］，
为玉米、小麦、大麦等禾谷类作物基因组研究提供
极有价值的信息，是禾谷类作物的一个模式基因组。
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一
种四碳非蛋白质氨基酸，广泛存在于动植物和各种
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.594
微生物体内，其合成与代谢通过 TCA 循环的一个旁
路，即 GABA 旁路进行［4］。研究表明，GABA 旁路
途径能通过调节胞质 pH、碳氮代谢、蛋白质降解、
激素合成、活性氧形成、多胺代谢、信号传递等重
要生理过程，继而影响植物的生长发育、形态建成
及胁迫应答［5-7］。
γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）是 GABA 分解代
谢中的第一步关键酶。较之哺乳动物和微生物，植
物中 GABA-T 基因的研究相对滞后。最近几年，相
继从拟南芥、番茄、水稻中克隆到 GABA-T 基因，
这些研究表明，GABA-T 基因在亚型数量、亚细胞定
位、组织发育丰度等各方面，随植物种类的变化而
表现出较大的差异，对胁迫的响应也不尽相同［8-10］。
干 扰 GABA-T 基 因 的 表 达， 拟 南 芥 gaba-t/pop2 突
变体花粉管发育异常、种子产量降低，对盐胁迫
的耐受力下降［11］；番茄（Solanum lycopersicum L.）
SlGABA-T RNAi 转基因植株后代出现严重的矮化和不
育［12］；利用 GABA-T 专一性抑制剂 vinyl-GABA（VGB）
处理甘蓝幼苗，其主根长度减少了约 44%［13］，这表
明 GABA-T 对于保障 GABA 的正常代谢，从而维持
植株正常的生长发育和胁迫应答至关重要。
目前为止，有关 GABA 积累的确切生理学意
义，及 GABA 旁路与其他生理进程间相互作用的分
子机制仍不清楚，需要对 GABA 旁路途径中关键基
因及关键环节作进一步解析。相关的报道也多集中
在拟南芥和烟草等模式植物中，在重要农作物尤其
是高粱中的研究还属空白，关键的基因尚未得到克
隆和鉴定，更不清楚 GABA 途径是否在高粱多重抗
逆性中扮演关键角色。本研究通过序列相似性比对
和 RT-PCR 方法，首次从高粱基因组中克隆得到两
个候选 SbGABA-T 基因，将其在大肠杆菌 BL21（DE3）
中进行诱导表达，并利用镍柱对融合蛋白进行纯化，
旨为高粱 SbGABA-T 蛋白的底物活性、催化机制的
研究，以及进一步相关抗体的制备及免疫学方法的
考察等奠定基础，也为其他禾谷类作物相关基因的
研究提供借鉴意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 高粱［Sorghum bicolor（L.）Moe-
nch］自交系 BTx623，由中国科学院植物所景海春课
题组馈赠。
1.1.2 表达菌株及质粒载体 本研究所用菌株 E.
coli DH5α、BL21（DE3）pLysS、 克 隆 载 体 T-easy
blunt 购于北京全式金生物技术有限公司。表达载体
pET28a（+）购于 Novagen 公司。
1.1.3 工具酶及生化试剂 RNA 提取所用的 Trizol
试剂购于 Invitrogen 公司 ；限制性内切酶、T4 DNA
连接酶、Phusion 高保真酶等购自 NEB 公司 ；反转
录试剂盒为 Fermentas 公司产品 ；胶回收试剂盒、质
粒提取试剂盒、DNA Marker（DL5000）、Ni-Agarose
His 标签蛋白纯化试剂盒等均购自北京康为世纪生
物科技有限公司 ；IPTG 及其他生化试剂等购自于
Sigma 公司 ；引物合成及测序由北京中美泰和公司
完成。
1.2 方法
1.2.1 SbGABA-T 基因的 cDNA 扩增 以拟南芥（Ar-
abidopsis）的 GABA-T 基因序列（GenBank Accession
No.At3g22200）［14］在高粱全基因组数据库（NC_01-
2876）中进行比对，选取序列同源性较高的基因，
在 线 分 析 程 序 NEW PLACE（https ：//sogo.d n a.affrc.
go.jp/）、TargetP（http ：//www.cbs.dtu.dk/serv ices/
TargetP/）、PSORT（http ：//psort.hgc.jp/ form.ht m l ） 分
析其信号肽序列［15］。利用 Primer Premier 5.0 软件分
别设计开放阅读框（ORF）全长引物（SbGABA-T 表
示）及去除 N 端信号肽后剩余区域（SbGABA-ΔT 表示）
的引物（下划线为限制酶酶切位点）：
SbGABA-T1 ：F 5-CGGGATCCATGATCGCACA-
AGGCCTCCGC-3，R 5-CGAGCTCCTAATTCTTCCT-
GGATTTCAGTT-3 ；
SbGABA-T2 ：F 5-CGGGATCCATGATCGCGCG-
ACGCCTG-3，R 5-CGAGCTCCTAGTTCTTCTTGGA-
TTTCAGGG-3 ；
SbGABA-ΔT1 ：F 5-CGGGATCCAGTTCTGAACC-
TTCACTTCAGG-3，R 5-CGAGCTCCTAATTCTTCC-
TGGATTTCAGTT-3 ；
SbGABA-ΔT2 ：F 5-CGGGATCCTTTAGTTCAGCT-
CCATCTGCAC-3，R 5-CGAGCTCCTAGTTCTTCTT-
GGATTTCAGGG-3。
2015,31(5) 95杨泽伟等：高粱 SbGABA-Ts基因的克隆、原核表达及纯化
利用 Trizol 试剂提取高粱 BTx623 幼苗总 RNA，
并反转录生成 cDNA，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩
增。扩增条件为 ：98℃预变性 30 s ；98℃ 变性 10 s，
58℃退火 20 s ；72℃延伸 1 min，循环 33 次 ；72℃
延伸 5 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回
收所需大小的条带，连接至克隆载体 T-easy blunt，
并转化到大肠杆菌 DH5α 中，选取阳性转化子送公
司测序。
1.2.2 原核表达载体的构建 提取阳性转化子质粒，
BamH I 和 Sac I 双酶切处理，所得片段连入相同酶
切的 pET28a（+）质粒，并转化到大肠杆菌 DH5α 中，
涂布含卡那霉素（终浓度为 50 mg/L）的 LB 平板。
选取 PCR 阳性的克隆提取质粒进行酶切验证，同时
送公司测序。鉴定正确的转化子提取质粒，转化到
表达菌株 BL21（DE3）pLysS 中。
1.2.3 重 组 质 粒 的 诱 导 表 达 挑 取 BL21（DE3）
pLysS 阳性单菌落，接种至含卡那霉素（终浓度为 50
mg/L）的液体 LB 培养基中，37℃，200 r/min 培养过
夜，所得培养物按 1% 接种至新鲜培养基 ；37℃、
200 r/min 培 养 至 OD600 约 0.6， 加 入 IPTG 溶 液，
16℃、200 r/min 进行诱导表达［16，17］。设定 IPTG 诱
导浓度梯度（终浓度）：0、0.25、0.5、1.0 mmol/L ；
及诱导时长梯度 ：10、14、18、22、34 h。分别取
样进行 SDS-PAGE 分析，以确定合适的诱导表达
条件。
按确定的优化条件进行诱导表达，离心收集
菌 体， 用 PBS 溶 液（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L
KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，2
mmol/L PMSF，1% Triton-X-100）重悬，超声波间歇
处理破碎菌体。离心后，菌液上清与沉淀分别取样
进行 SDS-PAGE 电泳检测。
1.2.4 融合蛋白的纯化 按 Ni-Agarose His 标签蛋
白纯化试剂盒说明书填充好镍柱，平衡柱子后负载
上样（菌液上清），收集流穿液 ；依次用不同梯度
的咪唑缓冲液进行目的蛋白的洗涤和洗脱，分别
收集洗涤液和洗脱液。缓冲液成分为 ：20 mmol/L
Tris-HCl（pH7.9），0.5 mol/L NaCl，10 -500 mmol/L
咪唑。收集的液体分别取样进行 SDS-PAGE 电泳
检测。
2 结果
2.1 高粱SbGABA-T基因的cDNA克隆
根据已知的拟南芥 AtGABA-T 基因（GenBank
Accession No.At3g22200） 序 列， 在 高 粱 基 因 组 中
数 据 库（NC_012876） 中 进 行 Blast， 获 得 两 个 候
选 GABA-T 基 因 亚 型（hypothetical protein， 未 注
释），本研究将其分别命名为 SbGABA-T1（GenBank
Accession No.XM_002445162）、SbGABA-T2（GenBank
Accession No.XM_002 447046），其中，SbGABA-T1 位
于高粱基因组第 7 号染色体上，编码 509 个氨基酸；
SbGABA-T2 则位于高粱基因组第 6 号染色体上，编
码 511 个 氨 基 酸。SbGABA-T1、SbGABA-T2 与 拟 南
芥 AtGABA-T 的氨基酸序列相似性分别为 73.11%
和 72.51%，两亚型间的相似性为 78.78%，且可变
区域多集中在序列 N 端。进一步分析可知，其前
端信号肽剪接位点分别在第 30 和第 31 位氨基酸位
置。据此设计引物，以高粱 BTx623 品种 cDNA 为
模板，分别克隆基因全长序列及截去 N 端信号肽后
剩余部分序列，如图 1 琼脂糖凝胶电泳所示，基因
全长大小约为 1 500 bp，截去 N 端信号肽后大小约
为 1 400 bp，与预期的片段大小相符。将 PCR 产物
连入克隆载体并测序，测序结果与公开数据库中的
相关序列一致，表明高粱 BTx623 基因组中确实存在
SbGABA-T1、SbGABA-T2 两个转录本。保守功能域分
析（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.
cgi）表明，SbGABA-T1、SbGABA-T2 均隶属于乙酰
鸟氨酸转氨酶（AAT _ Ⅰ）超家族，而 γ-氨基丁酸
转氨酶是该家族成员之一。
5000
bp
M 1 2 3 4
1500
1000
500
M ：DL5000 Marker ；1-4 ：SbGABA-T1 基因
图 1 RT-PCR 克隆高粱 SbGABA-T 基因
2.2 重组质粒pET28a（+）-SbGABA-Ts的构建
分别将 SbGABA-T1、SbGABA-T2、SbGABA-ΔT1、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.596
SbGABA-ΔT2 四个片段构建到带有 His 标签的原核
表达载体 pET28a（+）上（图 2-A）。相应的重组质
粒 pET28a（+）-SbGABA-Ts 经 过 BamH Ⅰ 和 Sac Ⅰ
双酶切鉴定，结果如图 2-B 所示，酶切后表达载体
大小约为 5 300 bp，目的片段大小约为 1 500 bp 和
1 400 bp，符合预期。进一步测序结果表明目的基
因均位于正确的读码框中，表明重组质粒 pET28a
（+）-SbGABA-Ts 构建正确。
照组，加有 IPTG 诱导的实验组在 55 kD 附近新增了
一条蛋白条带（图 3 箭头指示），与预期融合蛋白的
分子量相符。
5000
bp
M 1 2 3 4
1500
1000
500
A
B
pET28a+
5 369 bp
BamH I Sac I
SbGABA-T1
SbGABA-T2
SbGABA-ΔT1
SbGABA-ΔT2
3000
2000
4000
5000
1000
T4 term
inator
T4 tag
T7 pronoter
locl prom
oter
（A）重组质粒 pET28a（+）-SbGABA-Ts 构建示意图 ；（B）重组质粒 pET28a
（+）-SbGABA-Ts 双酶切验证电泳图 ；M ：DL5000 Marker ；1-4 ：分别为重组
质粒 pET28a（+）-SbGABA-T1、T2、△T1、△T2 双酶切片段
图 2 重组质粒 pET28a（+）-GABA-Ts 的构建
2.3 重组蛋白pET28a（+）-SbGABA-Ts诱导表达
条件
将构建正确的重组表达载体利用热激法转入表
达菌株 E. coli BL21（DE3）pLysS 后，进行融合蛋白
的诱导表达。实验中发现，无论如何优化诱导表达
条件，如 IPTG 浓度、诱导时长等，SbGABA-Ts 全
长融合的目的蛋白表达量均非常少，且多集中在包
涵体中，无法满足下一步研究需要 ；而截去 N 端信
号肽后的 SbGABA-△T 的融合蛋白，成功实现在可
溶性组分中高效表达（图 3）。较之未加 IPTG 的对
170
kD M 1 2 3 4 5 6 7 8
100
55
40
35
25
M：蛋白 Marker；1-4：BL21（DE3）/pET28a（+）-SbGABA-T1 总蛋白；5-8：
BL21（DE3）/pET28a（+）-SbGABA-△T1 总蛋白 ；其中 1、2、5、6 为上清
总蛋白，3、4、7、8 为沉淀总蛋白 ；1、3、5、7 未加 IPTG 诱导，2、4、6、
8 加入 IPTG 诱导
图 3 重组蛋白 pET28a（+）-SbGABA-T1/ △ T1 的诱导
表达
进一步优化表达条件，以转化 pET28a（+）-
SbGABA-T1 重组质粒的菌株进行 IPTG 诱导浓度和
诱导时长的探索，结果如图 4 所示。加有 IPTG 的
实验组均成功实现重组蛋白的表达，尽管融合蛋白
在包涵体中分布较多，但菌体破碎上清中仍有明显
目的蛋白的产生（图 4-A）。不同浓度 IPTG 作用下，
融合蛋白表达量的差别并不明显，表明融合蛋白的
表达量受 IPTG 诱导浓度的影响有限。相对来说，1
mmol/L IPTG 诱导下的目的蛋白表达量在可溶性组分
中分布最多，相应地在包涵体中分布较少，表明 1
mmol/L IPTG 可以作为比较合适的诱导浓度。图 4-B
表明，pET28a（+）-SbGABA-△T1 重组蛋白表达量
随诱导时间的延长而增加，但增加幅度有限，考虑
到诱导时间过长可能影响融合蛋白的结构功能，选
择表达量相对较高的 18 h 作为最适的诱导时长。
2.4 重组蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T的纯化
根据优化的诱导表达条件对重组菌 BL21（DE3）/
pET28a（+）-SbGABA-△T1/△T2 进行融合蛋白的大
量诱导表达，并利用带 His 标签的镍柱进行目的蛋
白的纯化。如图 5-A、B 所示，流穿液中目的蛋白的
量明显减少，表明目的蛋白已结合到镍柱上，经过
梯度浓度的咪唑缓冲液洗涤后，杂蛋白被除去，最
2015,31(5) 97杨泽伟等：高粱 SbGABA-Ts基因的克隆、原核表达及纯化
170
kD
A
B
M 1 2 3 4 5 6 7 8
100
55
40
35
25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
（A）不同浓度 IPTG 诱导下 BL21（DE3）/pET28a（+）-SbGABA-△T1 蛋白表达；
M ：蛋白 Marker ；1-4 ：分别为 IPTG 浓度 0、0.25、0.5、1.0 mmol/L 诱导下
的上清总蛋白 ；5-8 ：分别为 IPTG 浓度 0、0.25、0.5、1.0 mmol/L 诱导下的
沉淀总蛋白；（B）不同诱导时间下 BL21（DE3）/pET28a（+）-SbGABA-△T1
蛋白表达 ；1-5 ：诱导时长 10、14、18、22、34 h 下的上清总蛋白 ；6-10 ：
诱导时长 10、14、18、22、34 h 下的沉淀总蛋白
图 4 不同 IPTG 浓度及不同诱导时间下重组蛋白 pET28a
（+）-SbGABA-△T1 的表达
终目的蛋白在咪唑浓度为 250 mmol/L 时被洗脱下来，
相应的 SDS-PAGE 图表明，纯化的目的蛋白条带单
一，且浓度较高，能够满足进一步实验的需要。
3 讨论
植物受各种逆境胁迫而快速积累 GABA 的现象
已广为人知［4-6］，近年的研究进一步表明，GABA 途
径在植物胞质 pH 调节、碳 / 氮源平衡、环境胁迫应答、
植株生长发育及形态建成等方面都发挥着重要的作
用［5-7］。作为 GABA 分解代谢的关键基因，GABA-T
对于维持 GABA 途径的正常运转具有重要意义，而
植物中相关的研究一直比较滞后。近年来，随着拟
南芥、水稻、番茄等作物中 GABA-T 基因相继被克隆，
GABA-T 在植物生长发育和胁迫应答中的作用才日益
清晰［8-10］。本研究首次对高粱 SbGABA-Ts 基因进行
了分离及原核表达分析。研究发现，不同于拟南芥
中 GABA-T 基因的单拷贝，高粱中存在两个 GABA-T
基因亚型，与番茄（Solanum lycopersicum L.）中相
关基因亚型数量一致。GABA-T 基因以基因家族形式
存在，一定程度上有助于植物在干热环境下光呼吸
作用积累的乙醛酸的代谢，是植物适应环境压力的
表现［8］。
多 序 列 比 对 和 保 守 结 构 域 分 析 表 明， 高 粱
SbGABA-T 基因与已知的植物 GABA-T 基因的氨基酸
序列相似性达到 71%-88%，而且均隶属于乙酰鸟氨
酸转氨酶（AAT_ Ⅰ）超家族。但以往的研究证实，
植物中 GABA-T 基因各亚型间的时空表达模式、亚
细胞定位、蛋白酶活性等不尽相同，预示着植物中
GABA-T 基因各亚型间生理功能上的差异［8-10］。这
种结构与功能上的保守性和差异性，确保了 GABA-T
基因各亚型间在各种生理过程中既能“相互协作”，
又能“各司其职”，体现了植物相关代谢调控的灵活
和巧妙［18］。
GABA-T 酶活的考察是 GABA-T 基因原核表达后
重要的研究内容之一。植物中 GABA-T 蛋白酶底物
特异性的研究仍存在争议。早期研究发现，哺乳动
物、真菌、原核生物中的 GABA-T 多以 α-酮戊二酸
作为氨基受体［13］，而植物体内 GABA-T 则表现出丙
酮酸和 α-酮戊二酸两种活性［19］。但植物体内酶活的
研究不可避免的受到诸多因素的影响，如目标蛋白
170
kD
A
B
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
100
55
70
40
35
25
170
kD
100
55
70
40
35
25
（A）重组蛋白 pET28(a)-SbGABA-△T1 的纯化 ；（B）重组蛋白 pET28（a）-
SbGABA-△T2 的纯化 ； M ：蛋白 Marker ；1 ：未加 IPTG 的对照组 ；2 ：加
有 IPTG 的实验组 ；3 ：流穿液 ；4-9 ：分别为 10、20、50、100、250、500
mmol/L 咪唑浓度洗脱液
图 5 重组蛋白 pET28a（+）-SbGABA-△T1/△T2 的纯化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.598
酶提取效率低、分离困难、其他蛋白酶的干扰等［20］。
对目的蛋白进行异源表达是研究蛋白结构和功能的
有效手段。近期，Clark 等［8］通过对拟南芥 GABA-T
体外重组表达分析发现，拟南芥中 GABA-T 主要以
丙酮酸和乙醛酸为氨基酸受体，而非 α-酮戊二酸，
类似的结果也相继出现在番茄、水稻 GABA-T 的研
究中［8-10］。植物中 GABA-T 酶具有乙醛酸底物活性
的发现，进一步开拓了人们关于 GABA 途径的传统
认知。乙醛酸作为植物光呼吸途径的主要产物，表
明 GABA 途径可能与植物光呼吸途径联系［21］，由
此推测，GABA-T 能直接利用异柠檬酸降解而来的
乙醛酸形成甘氨酸和第二个琥珀酸分子（GABA 旁
路中琥珀酸脱氢酶作用形成一分子琥珀酸），补充至
TCA 循环中，这有助于维持受胁迫植物在碳源不足
的状态下的能量供应［22］。
本研究通过序列相似性比对和 RT-PCR 方法成
功 克 隆 到 高 粱 两 个 GABA-T 基 因， 并 利 用 pET28a
（+）原核表达系统进行基因的异源表达分析，最终
获得了大量高质量纯化的重组蛋白，蛋白浓度分别
达到 965.46 ng/μL 和 893.09 ng/μL。值得注意的是，
GABA-T 基因编码区全长融合的目的蛋白与去除了 N
端信号肽的目的蛋白在原核表达系统中的差异非常
显著，前者存在于包涵体中，且表达量有限 ；而后
者虽然在包涵体中也有大量分布，但在可溶性组分
中也有明显的表达。一种解释是原核细胞中缺乏相
关的机制对诱导的蛋白质前体进行进一步加工，而
去除了 N 端信号肽的 GABA-△T 是一种更接近于植
物体内成熟的 GABA-T 的存在形式，这对于目的蛋
白在原核表达系统中表达量和可溶性的提高更为有
益［8］。重组蛋白以可溶性形式存在，使后续的蛋白
纯化过程可以在无变性剂的相对温和条件下进行，
纯化后的蛋白可以最大限度地保持其空间构象与功
能，这为今后高粱 GABA-T 酶活的分析、相应抗体
的制备及通过免疫学方法的深入研究奠定了基础，
也为其他禾谷类作物相关基因的研究提供了参考和
借鉴。
4 结论
通过序列相似性比对和 RT-PCR 方法首次克隆
得到高粱两个 GABA-T 基因，保守结构域分析表明
该基因均隶属于乙酰鸟氨酸转氨酶（AAT _ Ⅰ）超
家族。利用 pET28a（+）原核表达系统进行基因的
异源表达，表明 SbGABA-T 编码区全长的融合蛋白
主要在包涵体中表达，而去除了其 N 端信号肽的融
合蛋白以部分可溶的形式存在，且在 1 mmol/L IPTG
（终浓度）、16℃诱导条件下高效表达。经 Ni 亲和层
析柱纯化，250 mmol/L 咪唑溶液洗脱，即可得到纯
化的融合蛋白。
参 考 文 献
［1］王海莲 , 管延安 , 张华文 , 等 . 高粱基因组学研究进展［J］. 基
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（责任编辑 李楠）