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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
光合作用（photosynthesis）是光合生物（包括
绿色植物、藻类和细菌）将太阳能转化为化学能，
并同时将无机物合成为有机物贮存在生物体内的过
程［1］，是地球上最重要的生命活动过程之一。整
合于光合膜上的色素蛋白复合物（pigment-protein
complexes）根据功能通常分为光合系统 I（PS I）和
光合系统Ⅱ（PS Ⅱ）［2］。PS I 相对较多地分布于叶
收稿日期 ：2012-11-28
基金项目 ：国家自然基金资助项目（31160049）
作者简介 ：张林华，男，硕士研究生，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：zhanglh1024@126.com
通讯作者 ：祝建波，男，博士，研究员，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：zjbshz@126.com
天山雪莲 PsaH 基因的克隆及序列分析
张林华1  邱红林1  刘超1  王爱英2  邓福军3  祝建波2
（1. 石河子大学生命科学学院，石河子 832003 ；2. 石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子 832003 ；
3. 新疆农垦科学院，石河子 832000）
摘 要 ： Ps I H（Subunit H of photosystem I）是属于光合系统 I 亚族的分子量约 10 kD 的内在膜蛋白，是真核生物特有的 3 个
组成光合系统 I 的亚基之一，在植物光合作用中起重要作用。从天山雪莲（Sasussured involucrata Kar. et Kir）叶片全长 cDNA 文库中，
筛选克隆得到 PsaH 基因。序列分析表明，该基因的开放阅读框为 432 bp，编码 143 个氨基酸，包括由 47 个氨基酸组成的转运肽
和 96 个氨基酸组成的成熟 PS I H。预测该蛋白质相对分子量为 15.04 kD，理论等电点（Theoretical pI）为 9.81，存在一个跨膜结构。
序列比对表明，SikPsaH 编码蛋白与蓖麻（Ricinus communis）、毛果杨（Populus trichocarpa）PsaH 基因编码的蛋白质具有 83.3% 的
相似性。系统进化树显示，天山雪莲与石蒜（Lycoris radiata）亲缘关系最近。。
关键词 ： 天山雪莲 PsaH 基因 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of PsaH Gene from Sasussured
involucrata Kar. et Kir
Zhang Linhua1 Qiu Honglin1 Liu Chao1 Wang Aiying2 Deng Fujun3 Zhu Jianbo2
（1. College of Life Science of Shihezi University，Shihezi 832003 ；2. Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Shihezi University，
Shihezi 832003 ；3. Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science，Shihezi 832000）
Abstract:  Ps I H is an intrinsic membrane protein of 10 kD that is a subunit of photosystem I（Ps I）, Ps I H is one of the three PSI
subunits found only in eukaryotes, plays an important role in plant photosynthesis. A cDNA clone encoding a PS I H subunit of photosystem
I was cloned from Sasussured involucrata Kar. et Kir leaf cDNA library. Sequence analysis indicated that the psaH cDNA contained an open
reading frame of 432 nucleotides encoding a 143 amino acid which consisted of a 47 amino acid transit peptide and a 96 amino acid mature PS I
H peptide. Forecasted the protein relative molecular weight is 15.04 kD, Theoretical pI was 9.81, contains a span membrane structure. Sequence
alignment indicated that the deduced amino acid sequence of Sasussured involucrata Kar. et Kir showed high identity of 83.3% to those of PsaH
from Ricinus communis and Populus trichocarpa. Phylogenetic analysis further showed that the SikPsaH gene has the nearest relationship with
Lycoris radiate.
Key words:  Sasussured involucrata Kar. et Kir PsaH gene Cloning Sequence analysis
绿体类囊体膜基质膜区，在真核生物叶绿体中至少
由 13 种多肽组成，它们与反应中心的 P700、电子
受体 A0、A1、铁硫中心以及光捕获叶绿色素相结
合，构成 PS I 稳定的电子传递链［3，4］。根据发现先
后顺序编码这 13 种多肽的基因，将它们依次命名
为 PsaA-PsaN。 其 中，PsaA、PsaB、PsaC、PsaI 和
PsaJ 存在于叶绿体基因组中，而其余均存在于核基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期76
因组中［3，5］。
PS I H（Subunit H of Photosystem I）是由核基因
PsaH 编码的膜周边蛋白，分子量约为 10 kD，位于
PS I 的表面，可能与捕光色素蛋白复合体（LHC I）
作用［3，6］。郑成超等［7］ 利用 Northern 杂交技术发
现，裂叶牵牛（Pharbitis nil Choisy）PsaH 基因的表
达明显地受内生昼夜节奏的调控，并证明光是迅速
启动 PsaH 基因高水平表达的重要因子。研究表明，
PS I H 对 PS I 的稳定积累和高效的电子传递起重要
作用［8］。Lunde 等［9］研究发现，PS I H 亚基的缺失，
导致 LHC II 不能给 PS I 传递能量，而且光合状态之
间的转换受损。因此，克隆 PsaH 基因，深入研究其
功能，对阐明 PS I 的功能及与 PS II 的关系有着非常
重要的意义。
天山雪莲（Saussurea involucrata Kar. et Kir）为
菊科凤毛菊属，又名新疆雪莲、雪荷花、雪莲花等［10］。
在新疆天山，它主要生长在海拔 2 400-4 100 m 的高
山草甸、高山冰碛石、悬崖峭壁石缝等处，最高月
平均温度 3℃-5℃，最低月平均温 -19℃--21℃，为
典型的耐极端低温的多年生高山植物［11］。天山雪莲
常年在高山强烈的紫外线照射、极大的昼夜温差、
氧气稀薄等恶劣环境下能旺盛生长并且开花［12］，从
而产生了适应极端环境条件的独特的生存机制［13］，
其参与光合作用的基因值得深入研究。高山植物在
长期的自然选择过程中，不断与自然环境相互协调，
形成一系列对恶劣环境的适应机制［14，15］，其光合器
官能够对环境影响作出迅速的反应［16-18］ 。
迄今，研究人员已经从拟南芥、烟草、菠菜和
水稻等植物中克隆得到 PsaH 基因，但有关天山雪莲
PsaH 基因的研究尚未见报道。本研究以天山雪莲为
试验材料，克隆得到 1 个 PS I H 基因，并对其序列
进行分析，旨在为研究天山雪莲的光合生理特征奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 天山雪莲试管苗在 MS 培养基上
培养，16 h 光照，温度为（20±1）℃。
1.1.2 菌 株 与 试 剂 天 山 雪 莲 cDNA 文 库、 大 肠
杆菌 DH5α 由本实验室保存 ；凝胶回收试剂盒购
自 Promega 公司 ；限制性内切酶、反转录试剂盒购
自 TaKaRa 公司 ；植物总 RNA 提取试剂盒、克隆载
体 pGM-T、Taq DNA Polymerase、10×Taq Reaction
Buffer、dNTP、T4 DNA 连接酶购自 TIANGEN 公司，
其他化学试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 天山雪莲叶片总 RNA 的提取和 cDNA 的合
成 用 TIANGEN 公司植物 RNA 提取试剂盒（RNA-
prep pure Plant Kit）提取天山雪莲总 RNA，提取方
法参照说明书。cDNA 的合成参照 TaKaRa 公司的
Reverse Transcriptase M-MLV 说明书。
1.2.2 天山雪莲 PsaH 基因的克隆 从已构建的天
山雪莲叶片 cDNA 文库中大量挑取单克隆，采用通
用引物 M13 进行 PCR 扩增并测序，将测序结果在
NCBI 网站进行 Blast 比对。
比对结果发现了一条与 PsaH 基因同源的序列，
根据该序列，利用 Primer5.0 设计特异性引物（F ：
5-GGATCCACAATGGCGTCTCTTACAACCTG-3，R ：
5-GAGCTCGATTTGAGGTTGGTGATGAGATT-3， 划
线部分分别是 BamH I 和 Sac I 酶切位点），以天山雪
莲 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应体系参见
Taq DNA Polymerase（TIANGEN）说明书。PCR 反应
程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，61℃复
性 30 s，72℃延伸 30 s，30 个循环；72℃延伸 7 min；4℃
保存。PCR 产物经浓度为 1.2％的琼脂糖凝胶电泳分
离后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（Promega）回收
目的条带，操作步骤见说明书。将回收的目的片段
与克隆载体 pGM-T Easy Vecter（TIANGEN）连接，
连接反应体系参见说明书。将连接产物转化 DH5α
感受态细胞，涂布于在含有 X-gal、IPTG、氨苄青霉
素的 LB 平板上进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆于
含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中过夜培养，小
量提取的质粒经 BamH I 和 Sac I 双酶切鉴定正确后
交由北京华大基因公司进行测序。
1.2.3 序 列 分 析 和 进 化 树 构 建 测 序 结 果 利 用
DNAMAN 软件进行分析，去除两端载体序列，确定
开放阅读框及相应的氨基酸序列。蛋白理化性质预
测用 ProtParam（http ：//web.expasy.org/protparam/）分
析。 用 TMHMM 2.0（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/
2013年第6期 77张林华等 ：天山雪莲 PsaH 基因的克隆及序列分析
TMHMM-2.0/）预测蛋白质的跨膜结构。通过 Motif
Scan（http ：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan） 网
站进行蛋白质基序预测。利用 NCBI 网站的 Blastx
（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）工具进行氨基酸分析。
利用 DNAMAN 软件对其他物种的同源氨基酸进行多
重比对，Clustalx 和 MEGA4.1 软件构建系统进化树。
2 结果
2.1 天山雪莲PsaH基因的克隆
通过天山雪莲 cDNA 文库大量测序 Blast 比对
得到 PsaH 基因序列，根据该序列设计特异性引物。
以天山雪莲为材料，提取总 RNA，反转录成 cDNA，
作为 PCR 扩增的模板。通过 PCR 扩增，得到一条
450 bp 左右的条带（图 1-A）。将此 PCR 产物用凝胶
回收试剂盒回收后连接到 pGM-T 载体上，转化大肠
杆菌 DH5α，挑取阳性克隆扩大培养，提取质粒进
行双酶切鉴定（图 1-B）。测序结果经 DNAMAN 软
件分析，该序列包含 1 个长 432 bp 的完整开放阅读
框，编码 143 个氨基酸。
括由 47 个氨基酸组成的转运肽和 96 个氨基酸组
成的成熟 PS I H（subunit H of photosystem I）。通过
Motif Scan 工具对 SikPsaH 的序列进行分析，结果表
明 PsaH 具有典型的 Ps I H 蛋白结构，其中包含了 5
个蛋白激酶 C 的磷酸化位点（13-15、28-30、35-
37、40-42、96-98），5 个肉豆蔻酰基化位点（16-21、
24-29、44-49、63-68、108-113），1 个酪氨酸蛋白
激酶位点（49-56），1 个天冬酰胺糖基化位点（64-
67），1 个微体 C 末端靶向信号位点（141-143）。
2.3 同源性及进化树分析
在 GenBank 中检索发现，该序列编码的氨基
酸序列与已经报道的其他高等植物 ：蓖麻 Ricinus
communis（XP_002516025）；落花生 Arachis hypogaea
（ABI84258）；拟 南 芥 Arabidopsis thaliana（NP_188-
235）；大豆 Glycine max（NP_001236618）；芜青 Bra-
ssica rapa（O04006）；毛果杨 Populus trichocarpa（XP_
002304206）；烟草 Nicotiana sylvestris（BAA04633）的
氨基酸序列具有较高的相似性，其中与蓖麻、毛果
杨的相似性最高，达到 83.3%（图 2）。PsaH 基因在
不同植物的基因组中是非常保守的，成熟的 PS I H
多肽的结构和功能也极可能是相似的。但不同植物
PS I H 的转运肽序列却差异很大（图 2）。
用 MEGA4.1 软件将 PsaH 与 GenBank 中公布的
蒺藜苜蓿、红车轴草、落花生、大豆、拟南芥、芜青、
菠菜、玉米、葡萄、石蒜、毛果杨和蓖麻的 PsaH 进
行系统进化分析，结果显示，天山雪莲 PsaH 与石蒜
PsaH 聚为一类，亲缘关系最近（图 3）。运用生物信
息学软件 TMHMM-2.0 对天山雪莲 PsaH 蛋白质进行
跨膜结构分析，结果表明该蛋白具有 1 个跨膜结构
（图 4）。
3 讨论
本研究以高山植物天山雪莲为研究对象，利用
文库随机测序得到了 PsaH 基因的全长 cDNA 序列，
以天山雪莲为模板，克隆到该基因。序列分析表明，
该基因编码的氨基酸序列与蓖麻、毛果杨的相似性
最高，达到 83.3%。通过 Motif Scan 工具对 PsaH 的
序列进行分析，结果表明 PsaH 具有典型的 PsI H 蛋
白结构。天山雪莲 PsaH 基因与其它植物一样，在基
因组中是非常保守的，成熟的 PS I H 多肽的结构和
1，2 ：RT-PCR 扩增产物 ；3 ：连有目的基因的 pGM-T 质粒对照，
4 ：质粒经 BamH I 和 Sac I 双酶切结果 ；M ：DNA Mark III
图 1 天山雪莲 Psa H 基因的扩增（A）与重组质粒
酶切鉴定（B）
500
bp
456
A B
bp
M 1 2
500
bp
456
bp
M 3 4
2.2 蛋白质理化性质分析
用 ProtParam 工具对该基因编码的蛋白质一级结
构及理化性质进行预测，结果显示该蛋白质相对分
子量为 15.04 kD，理论等电点（Theoretical pI）为 9.81。
分子式为 C685H1081N177O199S2，不稳定指数（instability
index II）为 30.87，属于稳定蛋白；脂肪指数（aliphatic
index）为 79.23 ；平均疏水性（grand average of hyd-
ropathieity）为 -0.072，因此该蛋白为亲水性蛋白，包
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期78
功能也极可能是相似的。
郑成超等［7］发现裂叶牵牛 PsaH 基因的表达明
显地受内生昼夜节奏的调控 , 并证明光是迅速启动
PsaH 基因高水平表达的重要因子。关于 PsaH 基因
生物钟的问题存在着强烈的争论［19］ , 该领域的深入
研究将对揭示植物生物钟调控现象和光合作用实质
具有非常重要的意义。
光合系统由光合系统 I（PS I）和光合系统Ⅱ
（PS Ⅱ）组成，在真核生物叶绿体中 PS I 至少由 13
种多肽共同作用构成 PS I 稳定的电子传递链。现
已证明，光合生物对光能的吸收、传递和转化都是
在光合膜上的色素蛋白复合体上进行的，在分子水
平上研究各种膜蛋白复合体的结构和功能及其相互
关系对于揭示光合作用光能转化的机理具有重要意
义［20］。对 PS I 各组分编码基因及其基因表达调控的
深入研究将在分子水平上揭示 PS I 的功能。通过蛋
白质的分离提纯，体外重组以及化学交联等方面的
研究可以进一步阐明各蛋白组分的性质和相互关系。
4 结论
首次克隆并报道了天山雪莲的 PsaH 基因，利
用生物学软件和网站对该序列进行相似性比对、理
化性质分析、进化树分析，获知了该序列的部分信
息，为天山雪莲 PsaH 基因结构和功能的研究提供了
参考。
参 考 文 献
［1］ 李 合 生 . 现 代 植 物 生 理 学［M］. 北 京 ：高 等 教 育 出 版 社 ,
2006 ：144.
［2］ Raghvenda AS. Photosynthesis ：a comprehensive treatise［M］.
Cambridge ：Cambridge University Press, 1998 ：29.
［3］ Chitnis PR. Photosystem I［J］. Plant Physiol, 1996, 111 ：661-
669.
［4］ Parrett KG, Mehari T, Warren PG, et al. Purification and properties of
the intact P700 and Fx containing photosystem I core protein［J］.
Biochim Biophys Acta, 1989, 973 ：324-332.
［5］ Simpson DJ, Wettstein DV. The structure and function of the thyl-
akoid membrane［J］. Carlsberg Res Commun, 1989, 54 ：55-65.
［6］ Jansson S, Andersen B, Scheller HV. Nearest-neighbor analysis of
㬆哫㩭㣡⭏ᤏই㣕བྷ䉶㣌䶂∋᷌ᶘ✏㥹ཙኡ䴚㧢
㬆哫㩭㣡⭏ᤏই㣕བྷ䉶㣌䶂∋᷌ᶘ✏㥹ཙኡ䴚㧢
72
72
73
72
73
72
73
71
144
144
145
144
145
144
145
143
划线部分为转运肽
图 2 天山雪莲 PsaH 蛋白的氨基酸序列与其他相关序列的多重比对
㩭㣡⭏Arachis hypogaea ABI84258
བྷ䉶Glycine max NP001236618ᤏই㣕Arabidopsis thaliana NP188235㣌䶂Brassica rapa O04006
㨐㨌Spinacia oleracea P22179⦹㊣Zea mays NP001104905
㪑㨴Vitis vinifera XP002284496
⸣㫌Lycoris radiata ACY92095
ཙኡ䴚㧢Sasussured involucrata Kar. et Kir
∋᷌ᶘPopulus trichocarpa XP002304206
✏㥹Nicotiana sylvestris XP002516025
㓒䖖䖤㥹Trifolium pratense AAQ21121
㫪㰌㤌㬯Medicago truncatula XP003597744
1.2
1.0
0.8
0.6
Pr
ob
ab
ili
ty
0.4
0.2
20 40 60 80 100 120 140
0
transmembraneinside
outside
≘ส䞨ս⛩
图 3 不同植物 PsaH 氨基酸序列进化树
图 4 SikPsaH 跨膜结构预测分析
2013年第6期 79张林华等 ：天山雪莲 PsaH 基因的克隆及序列分析
high-plant photosystemⅠholocomplex［J］. Plant Physiol, 1996,
112 ：409-420.
［7］ 郑成超 , 张宪省 . 裂叶牵牛 psaH 基因的克隆、序列分析及其
表达研究［J］. 植物学报 , 1999, 41（8）：820-824.
［8］ Naver H, Haldmp A, Scheller HV. Cosupression of photosystem I
subumt PSI-H in Arabidopsis thaliana. Efficient electron transfer and
stability of photosystem I is dependent upon the PSI-H subunit［J］.
J Biol Chem, 1999, 274（16）：10784-10789.
［9］ Lunde C, Jensen PE, Haldrup A, et al. ThePSI-H subunit of photos-
ystem I is essential for state transitions in plant photosynthesis［J］.
Nature, 2000, 408 ：613-615.
［10］ 孙辉 , 祝建波 . 利用简并引物克隆天山雪莲 sikPIP 基因片段
及 RNAi 载体的构建［J］. 生物技术通报 , 2010（6）：107-
112.
［11］ 陈发菊 , 杨映根 , 赵德修 , 等 . 我国雪莲植物的种类、生境分
布及化学成分的研究进展［J］. 植物学通报 , 1999, 16（5）：
561-566.
［12］ 黄继红 , 谭敦炎 . 雪莲的研究进展［J］. 新疆农业大学学报 ,
2002, 25（2）：8-13.
［13］ 祝建波 , 刘海亮 , 王重 , 等 . 天山雪莲叶片全长 cDNA 文库的
构建［J］. 西北农业学报 , 2006, 15（6）：170-173.
［14］ Zhao ZG, Du GZ, Zhou XH, et al. Variations with altitude in
reproductive traits and resource allocation of three Tibetan species
of Ranunculaceae［J］. Australian Journal of Botany, 2006, 54（7）：
691-700.
［15］ Wielgolaski FE, Karlsen SR. Some views on plants in polar and
alpine regions［J］. Rev Environ Sci Biotechnol, 2007, 6 ：33-45.
［16］ Lepedus H, Viljevac M, Ceaar V, et al. Functioning of the photosy-
nthetic apparatus under low and high light conditins in chlorotic sp-
ruce needles as evaluated by in vivo chlorophyll fluorescence［J］.
Russian Journal of Plant Physiology, 2005, 52（2）：165-170.
［17］ Weng JH, Lai MF. Estimating heat tolerance among plant species
by two chlorophyll fluorescence parameters［J］. Photosynthetica,
2005, 43（3）：439-444.
［18］ Zhang SB, Zhon ZK, Hu H, et al. Gas exchange and resource
utilization in two alpine oaks at different altitudes in the Hengduan
Mountains［J］. Can J For Res, 2007, 37 ：1184-1193.
［19］ Kouril R, van Oosterwijk N, Yakushevska AE, Boekema EJ.
Photosystem I ：a search for green plant trimers［J］. Photochem
Photobiol Sci, 2005, 4（12）：1091-1094.
［20］ 匡廷云 , 彭德川 , 陈志强 . 叶绿体类囊体膜脂及叶绿素蛋白的
结构与功能［M］// 汤章城 . 植物生理与分子生物学 . 北京 ：
科学出版社 , 1998 ：171-187.
（责任编辑 狄艳红）