全 文 ：作者简介:刘姝(1987 －) ，女，在读研究生，研究方向:生态学。 收稿日期:2012 － 08 － 17
天山雪莲果多酚氧化酶的特性研究
刘 姝1 王 渊1 方 佳2 刘冬志1 韩丽丽1
(1 新疆大学资源与环境科学学院，新疆乌鲁木齐 830046;绿洲生态教育部重点实验室，
新疆乌鲁木齐 830046;2 新疆众和股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830046)
摘 要:以新鲜的天山雪莲果为材料，研究了多酚氧化酶( PPO) 的最适 pH、最适温度，拟合了米氏方程并求得了 Km、
Vmax，并探讨了不同抑制剂对 PPO的活性影响。结果表明:天山雪莲果多酚氧化酶最适反应 pH 为 6. 5，最适温度为
45℃ ;以邻苯二酚为底物，km = 0. 061mol /L，Vmax = 776. 4U /min·g;在选定的浓度范围内抑制剂对 PPO 的抑制作用大
小为: NaHSO3 ﹥ L － cys﹥ Vc﹥柠檬酸。
关键词:天山雪莲果;多酚氧化酶;褐变;抑制剂
中图分类号 Q949. 783. 5 文献标识码 A 文章编号 1007 － 7731(2012)17 － 37 － 04
Study on Characteristics of Polyphenol Oxidase from Yacon
Liu Shu1 et al．
(1 College of Resources and Environment Science，Xinjiang University，Urumqi 830046，China;Key Laboratory of Oasis E-
cology，Education Ministry，Urumqi 830046，China)
Abstract:In this study，with fresh material of Tianshan Yacon ，The optimum polyphenol oxidase (PPO) ，optimum pH，op-
timum temperature，the fitting of the Michaelis － Menten equation and obtained the Km and Vmax，and explore the different
inhibitionagents on PPO activity． Using catechol as substrate，the Km and Vmax were 0． 061mol /L，776． 4U /g·min respec-
tively． The four inhibitors had different effects on inhibiting enzymatic browning and the inhibiting effect are as follow:citric
acid ＞ L － cysteine ＞ ascorbic acid ＞ acetic acid．
Key words:Tianshan Yacon;Polyphenol oxidase ;Browning ;Inhibitors
天山雪莲果为菊科，葵花属多年生草本植物。外形像
蕃薯，果肉汁多而晶莹剔透，口感甘甜爽脆，属低热量食
品，含有丰富的矿物质及钙、镁、铁、锌、钾、硒等微量元素。
具有促消化、调理胃肠道、控制胆固醇和糖尿病、通便、降
火清毒、防治面疱、提高免疫力等优点。天山雪莲果含有
一种化学成分———单宁，又称鞣质。天山雪莲果在受到机
械损伤或其它极端环境下很容易发生褐变，严重影响天山
雪莲果的运输、储藏及深加工等。多酚氧化(polyphenolox-
idase，PPO)是引起果蔬褐变的关键酶类，它可催化内源性
酚类物质氧化生成醌，醌与氨基酸(或蛋白质)作用生成
高分子络合物，从而导致褐色素的生成［1 － 2］。因此研究天
山雪莲果多酚氧化酶特性及褐变控制，对指导天山雪莲果
的生产实践具有重要意义。
本实验研究分析天山雪莲果中 PPO 的热稳定性以及
温度、pH、底物浓度、酶液浓度与 PPO 活性的关系，并考察
了几种抑制剂对酶活性的影响，以期为天山雪莲果加工过
程中防止褐变、提高产品质量提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料和试剂 新鲜天山雪莲果、磷酸二氢钠、磷
酸氢二钠、邻苯二酚、L －半胱氨酸、柠檬酸、抗坏血酸、亚
硫酸氢钠。
1. 2 主要仪器设备 高速冷冻离心机 TCL － 20M(长沙
湘仪离心机仪器有限公司) ;分光光度计 722 －可见分光
光度计(上海欣茂仪器有限公司) ;水浴锅 DK － S24 型(上
海森信实验仪器有限公司) ;分析天平 AUY220 型;磁力搅
拌器 90 － 3型(上海亚荣生化仪器厂)。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 天山雪莲果 PPO 粗酶液的制备及 PPO 活性和热
稳定性的测定 取新鲜天山雪莲果去皮，精确称取 10g，迅
速放入 4℃预冷的研钵中按照 1∶ 5(W/V)依次加入预冷的
磷酸缓冲液(pH6. 8)60mL、2% PVPP研磨 3min成匀浆，充
分混合，转入离心管中，4℃，10000r /min 离心 15min，倾出
上清液置 4℃冰箱中静止 30min后，低温搅拌透析 24 h，期
间不断更换外液 5 次。将袋内液全部密封，4℃ 保存
备用［3］。
以 2. 90mL pH6. 8 的磷酸缓冲液和 0. 1mL 0. 1mol /L
的邻苯二酚溶液为底物，35℃预热 5min 后，加入 0. 02mL
酶液，于最大吸收波长 410nm处测定 OD值。酶活力单位
73安徽农学通报，Anhui Agri. Sci. Bull. 2012，18(17)
DOI:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2012.17.083
定义:在测定条件下，吸光度值每分钟增加 0. 01 所需要的
酶量定义为一个活力单位［2］。那么 PPO 反应进程曲线是
以反应时间为横坐标，光吸收值为纵坐标(读数间隔为
30s，直至增长变缓)制作反应进程曲线，确定反应时间。
PPO热稳定性的测定是在 0 ～ 5min 内(0，1，2，3，4，5min)
分别测定 60，70，80，90℃时各自的光吸收值，以时间为横
坐标，光吸收值为纵坐标作图［6］。
1. 3. 2 温度、pH、不同底物浓度对酶促反应速度的影响 取
11个试管，加入缓冲液各 2. 9mL保温 10min，然后再分别加入
0. 1mL邻苯二酚溶液，加入 0. 02mL 酶液，在 20，25，30，35，40，
45，50，55，60，65，70℃条件下测定吸光值，制作温度和 PPO活
性的关系曲线，确定最佳酶促反应温度。
取 10 个试管，加入 pH为 3. 5，4. 0，4. 5，5. 0，5. 5，6. 0，
6. 5，7. 0，7. 5，8. 0 的磷酸缓冲液各 2. 9mL 保温 10min，然
后再分别加入 0. 1mL邻苯二酚溶液，分别加入 0. 02mL酶
液在最佳温度下测定吸光值，制作 pH和 PPO活性的关系
曲线，确定最佳酶促反应 pH［4 － 5］。
在 35℃，pH6. 0 条件下测定底物浓度分别为 0. 02、
0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6mol /L 时的吸光度，制作
不同底物浓度随时间的变化曲线，并拟合各直线斜率，即
为反应初速度，计算 Vmax和 Km
［8］。各反应体系中分别加
入不同浓度的 L －半胱氨酸、抗坏血酸、亚硫酸氢钠及柠
檬酸同时以相同体积的蒸馏水为对照，测定 PPO 活性，以
对照试验数据为 PPO的 100%相对活力，计算各抑制剂和
激活剂的抑制百分比［9 － 10］。
1. 3. 3 酶浓度与 PPO 活性的关系 取 0. 1ml 0. 1mol /L
邻苯二酚溶液，2. 8mL 0. 05mol /L pH6. 0磷酸盐缓冲液，再
分别取 0. 005、0. 01、0. 02、0. 025、0. 03、0. 05、0. 07、0. 09mL
的 PPO粗酶液，用蒸馏水补充至相同体积，在 35℃水浴中
保温 10min，测定 PPO的活性［7］。
2 结果与分析
2. 1 酶反应时间的确定
图 1 酶活与反应时间的关系
从图 1 可以看出，天山雪莲果中的 PPO 反应速度在
2min内几乎呈直线上升，随后反应速度变慢。为了正确
测定酶促反应速度并避免各种因素的干扰，就必须测定酶
促反应初期时的速度，即反应初速度。本实验选择在
2min内测定酶活。
2. 2 酶液浓度与 PPO 活性的关系
图 2 酶液浓度与酶活的关系
如图 2 所示，当加酶量小于或等于 0. 03mL时，酶活随
酶浓度的增加而增加，当加酶量大于 0. 03mL 时，酶活变
化呈下降趋势，这可能是酶的作用产物对酶产生反馈抑制
作用的结果，或与提取的 PPO纯度有关［11］。
2. 3 pH 对 PPO 活性的影响
图 3 pH对酶活的影响
由图 3 可以看出，天山雪莲果多酚氧化酶 pH 非常敏
感，其作用最适 pH 为 6. 5，pH ≤3. 5 或 pH ≥8 都没有活
性，酶活性在 pH 值 3. 5 ～ 6. 5 区间随 pH 增加而不断上
升，在 pH6. 5 ～ 8 则随 pH 增加而不断下降。与雪梨果肉
PPO最适 pH6. 4［12］、山药 PPO 最适 pH6. 0［13］、芒果 PPO
最适 pH6. 8［14］、桃杷果实 PPO 最适 pH6. 3［15］相比都很接
近，但紫甘薯 PPO的最适 pH 为 4. 0［16］，说明果蔬 PPO 最
适 pH多在 6. 5波动，但不同植物最适 pH是有区别的。
2. 4 温度对 PPO 活性的影响 由图 4 可见，在 40 ～ 55℃
条件下，天山雪莲果 PPO 活性较高，45℃时其活性最高，
45℃为天山雪莲果 PPO 的最适温度。低于 40℃或高于
55℃时 PPO活性都逐渐下降。李晓莉、沈金玉等人研究
山药 PPO 特性时得出 PPO 随着温度增加，蛋白质分子的
热运动增强，促进多重非共价键相互作用，导致蛋白分子
83 安徽农学通报，Anhui Agri. Sci. Bull. 2012，18(17)
破坏，使得 PPO变性［13］。段玉权、董维等人研究中华寿桃
PPO最适温度为 55℃［17］，庞学群、段学武等人研究荔枝果
皮 PPO最适温度为 35℃［18］，而高路等人研究紫甘薯 PPO
最适温度为 15℃［16］，这说明不同果蔬其 PPO 最适反应温
度有所不同。
图 4 温度对酶活的影响
2. 5 底物浓度与 PPO 活性的关系 在 45℃、pH 6. 5 条件
下测定底物(邻苯二酚)浓度分别为 0. 02、0. 05、0. 1、0. 2、
0. 3、0. 4、0. 5、0. 6mol /L 时，不同底物浓度时产物吸光度随
时间的变化，并分别拟合所得直线斜率即为反应初速度
V0，如图 5所示。作出反应初速度 V0 随邻苯二酚浓度的
变化曲线，如图 6 所示。在底物浓度小于 0. 05mol /L 时，
PPO活性与底物浓度呈线性关系;当底物浓度大于
0. 3mol /L时，PPO活性增加开始变得缓慢，不再呈线性关
系。根据 Lineweaver － Burk 方程 1 /V = (1 /［S］)Km /Vmax
+ 1 /Vmax，以 1 /V为纵坐标，1 /［S］为横坐标作图，见图 7，
拟合直线相关系数达到 0. 9938，可见天山雪莲果 PPO 的
酶促褐变反应动力学符合米氏方程。根据直线斜率和截
矩可求得该反应的米氏常数 Km = 0. 061mol /L，最大反应
速度 Vmax = 776. 40U /g·min，相应的动力学方程为 V =
776. 4［S］/(0. 061 +［S］)。Km 值越小，说明达到最大反
应速度一半时所需底物浓度就越少，酶对底物的亲和力就
越大，反之亦然。
图 5 不同底物浓度对应的反应初速度
注:◆0. 02mol /L v = 0. 013OD /min;+ 0. 3mol /L，v = 0. 047 OD /
min;■0. 05mol /L，v = 0. 0215 OD /min;●0. 4mol /L ，v = 0. 0465 OD /
min;▲0. 1mol /L，v = 0. 030OD /min;﹡ 0. 5mol /L ，v = 0. 049 OD /min;
× 0. 2mol /L，v = 0. 0385 OD /min;﹦ 0. 6mol /L，v = 0. 052 OD /min。
图 6 底物浓度与酶活的关系
图 7 1 /V － 1 /S
2. 6 抑制剂对 PPO 活性的影响 由图 8、9 可以看出，
Vc、L － cys、NaHSO3 以及柠檬酸对天山雪莲果 PPO 活性
都有很好的抑制作用，其中 NaHSO3 和 L － cys的抑制效果
要好于柠檬酸和 Vc。在选定的浓度范围内，这 4 种抑制
剂的抑制效果由强到弱依次为:NaHSO3 ＞ L － cys ＞ Vc ＞
柠檬酸。NaHSO3 的抑制机理目前尚不清晰，一般认为一
方面是由于 SO2 的还原作用，将中间产物邻二醌还原;另
一方面是 SO2对酶的直接抑制作用
［11］。虽然 NaHSO3 对
PPO活性抑制明显，但由于国家相关标准规定禁止在腌制
菜中添加亚硫酸盐，所以不常用。L －半胱氨酸对多酚氧
化酶的抑制作用，主要是由于它能还原多酚氧化酶作用所
产生的醌。由图 7 可知，Vc 对天山雪莲果多酚氧化酶也
具有明显的抑制作用。随着 Vc 浓度的加大，多酚氧化酶
活性逐渐下降，Vc对多酚氧化酶的抑制作用是因为 Vc不
仅是多酚氧化酶辅基铜离子的螯合剂，而且也是多酚氧化
酶作用底物的竞争性抑制剂。此外，Vc 还可以还原多酚
氧化酶作用所形成的醌［18］。Vc 是人体所必需的一种维
生素，食用安全，因此，Vc 是目前防止多酚氧化酶酶促褐
变的最常见、使用最广泛的物质，作为果蔬的防褐变剂具
有广阔的应用前景。柠檬酸主要是提供酸性环境，使 PPO
偏离其最适 pH，同时柠檬酸的三个羧基能够鳌合 PPO 中
的铜离子。
9318 卷 17 期 刘姝等 天山雪莲果多酚氧化酶的特性研究
图 8 Vc、亚硫酸氢钠、L －半胱氨酸对酶活的影响
图 9 柠檬酸对酶活的影响
3 结论
天山雪莲果多酚氧化酶反应的初速度在 2min内呈线
性增加;最适 pH为 6. 5;最适温度为 45℃;天山雪莲果多
酚氧化酶动力学研究表明，以邻苯二酚为底物时，其动力
学方程为:V = 776［S］/(0. 061 +［S］)。Km = 0. 061mol /
L，Vmax = 776Umin·g。不同抑制剂对天山雪莲果多酚氧
化酶都有不同程度的抑制作用，在选定的浓度范围内抑制
效果由强到弱依次为:NaHSO3 ＞ L － cys ＞ Vc ＞柠檬酸。
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454. ( 责编: 施婷婷)
(上接 4页)略和农业品牌化趋势要求，加大农产品区域品
牌建设力度势在必行。今后应该继续发展“一村一品”，
加大品牌资源的开发利用，加强品牌营销的专业化指导，
重点建设好区域品牌。除了在建设主体、运行模式和发展
模式方面努力之外，还应抓好农产品的区域品牌保护与传
播推广工作。主要保护措施应包括积极进行商标注册、原
产地注册、地理标志认证，实施行业准入制度，制定产品技
术质量标准等。主要的品牌传播推广措施可采取举办农
事节庆活动、参加农产品品牌评选和进行整合营销传
播等。
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产业，2007，7(11) :63 － 66. ( 责编:陶学军)
04 安徽农学通报，Anhui Agri. Sci. Bull. 2012，18(17)