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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-12
基金项目 : 教育部春晖计划资助项目（Z2007-1-01036）, 内蒙古自治区自然科学基金项目（2009ZD05）
作者简介 : 于泊洋 , 女 , 博士研究生 , 研究方向 : 细胞分子生物学 ; E-mail: boyangy@126.com
通讯作者 : 吴应积 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 精原干细胞及乳腺生物反应器 ; E-mail: yingjiwu@yahoo.cn
精子发生过程是一个发生在成年哺乳动物体内
的复杂且高度调控的过程。该过程起源于精原干细
胞［1］。精子发生可分为以下3个阶段：有丝分裂阶段，
即 A 型精原干细胞的自我更新和分化为 B 型精原细
胞 ；减数分裂阶段，即 B 型精原细胞经减数分裂形
成初级精母细胞、次级精母细胞进而形成圆形精子
细胞 ；减数分裂后的精子形成阶段，即精子细胞经
过变态分化形成精子［2］。在成年睾丸曲细精管中的
精原干细胞经历以上过程并持续产生成熟精子［3］。
睾丸生精细胞分化过程的精确调控需要一个生精细
胞和周围体细胞严格的阶段特异及细胞特异的基因
表达［4］。
长期以来，由于雄性生殖细胞体外培养技术相
对滞后，精子发生机制方面的研究进展缓慢［5-7］。
目前对生精过程中重要事件的发生还缺乏有力的鉴
定手段，这为生精过程中各因子作用机理的研究带
来了一定的困难。为了对精子发生过程中各重要事
件进行更为精确的界定，需要通过基因工程手段引
进分子标记，即通过生精过程中不同阶段，不同细
胞中基因表达情况对生精过程中的重要事件进行
观测［8］。
目前对精子发生过程的体外研究相对缓慢，对
生精过程中重要事件缺乏精确的鉴定标准，因此需
要通过基因工程手段引进分子标记。由 Gsg2 所表达
的Haspin蛋白可以检测到减数分裂的完成。1994年，
Tanaka 等［9］通过构建少精突变小鼠与正常小鼠的睾
检测生精过程中减数分裂完成的质粒载体的构建
于泊洋 罗奋华 张岩 吴应积
（内蒙古大学 哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室，呼和浩特 010021）
摘 要： 旨在构建在所有转染细胞中表达绿色荧光、在核分裂的次级精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞中表达红色
荧光蛋白的 cmv-eGFP-Gsg2-DsRed载体。重组载体是以本实验室保存 CMV-EGFP-pDsRed质粒载体为基础载体，在其多克隆位点插
入 Gsg2启动子，期待可以启动红色荧光蛋白基因的表达。经大鼠睾丸共培养细胞转染试验证实，成功构建了含有 Gsg2启动子的
表达双荧光蛋白质粒载体。
关键词： 小鼠 Gsg2启动子 CMV启动子 精子发生
Construction of the Plasmid Vector Which Can Detect the
Completion of Meiosis
Yu Boyang Luo Fenhua Zhang Yan Wu Yingji
（The Key Laboratory for Mammalian Reproductive Biology and Biotechnology，Ministry of Education，
Inner Mongolia University，Hohhot 010021）
Abstract: It was to intend to construct cmv-eGFP-Gsg2-DsRed vector which can start the expression of EGFP in all transgenic cells and
start the expression of DsRed in the germ cells that have completed the meiosis proceed. The recombinant vector is based on the CMV-EGFP-
pDsRed vector which is conserved in our laboratory, and the Gsg2 promoter is inserted into the MCS. The transfection test to the rat testis co-
culture cells, suggest that cmv-eGFP-Gsg2-DsRed vector which contains the Gsg2 promoter is successfully constructed.
Key words: Mouse Gsg2 promoter CMV promoter Spermatogenesis
2012年第9期 203于泊洋等 ：检测生精过程中减数分裂完成的质粒载体的构建
丸 cDNA 差减文库分离出了一些生精细胞特异表达
基因。Gsg2 基因的全部转录单元是 Itgae 基因的一
个内含子，而 Gsg2 基因本身没有内含子结构。Gsg2
基因的转录是由一个双向启动子启动的［10］。由 Gsg2
所表达的 Haspin 蛋白在核分裂的次级精母细胞、圆
形精子细胞及长形精子细胞中表达，具有 Ser/Thr 激
酶活性，位于细胞核内，与 DNA 结合［11］。Gsg2 在
生精细胞中的作用尚不明确，一般认为其在调控细
胞周期与控制生精细胞基因表达中发挥作用［11，12］。
Tokuhiro 等［10］鉴定了 Gsg2 基因启动子的最小区域
（-144 到 +79），该段启动子可以在小鼠核分裂的次
级精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞中启动
报告基因的表达，从而为检测生精过程中减数分裂
的完成提供了分子水平鉴定标准［13］。
本研究旨在构建一个以 Gsg2 启动子启动表达
红色荧光蛋白，同时 CMV 启动子启动表达绿色荧光
蛋白的双荧光质粒载体，旨在为进一步制备在单倍
体精子细胞中同时表达红、绿两种荧光蛋白，而在
其他细胞中仅表达绿色荧光蛋白的转基因鼠，从而
为雄性生殖细胞分化机制体外研究提供适用的模式
动物。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂及耗材 pMD19-T 载体、限制性内切酶、
T4 DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、M-MLV 反转录酶、
Taq DNA 聚合酶、oligo（dT）、DNA Marker 等均购
自 TaKaRa 公司，质粒提取试剂盒、DNA 琼脂糖凝
胶回收试剂盒、DNA 纯化试剂盒购自上海华舜生物
工程有限公司及北京天根公司。PCR 引物由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。DMEM/F12 培
养液（Gibco），FBS（TBD），Lipofectamine 细胞转染
试剂盒（Invitrogen）E. coli DH5α 感受态细胞为本实
验室制备，CMV-EGFP-DsRed 质粒为本实验室保存。
其他化学试剂为国产的分析纯。
1.1.2 仪器 电热恒温隔水式培养箱（DDHZ-300），
水浴恒温箱（上海一恒），汽浴振荡摇床（THZ-C），
水平电泳槽（北京六一厂），凝胶成像仪（BIO-RAD），
高 速 离 心 机（EPPENDORF）， 高 速 低 温 离 心 机
（BECKMAN），大型超速低温离心机（BECKMAN），
超净工作台（AIRTECH），超低温冰箱（SANYO），
基因电转仪（BIO-RAD），紫外分光光度计（BIO-
RAD），高压自动灭菌锅（HIRAYAMA）。磁力搅拌
器（国华 85-2），PH 仪（TOLEDOD），电子分析天
平（TOLEDOD），紫外投射仪（UVP），生物洁净安
全柜（BHRC-1300 Ⅱ A/B3），CO2 培养箱（BINDER），
倒置相差显微镜（NIKON）。
1.1.3 试验材料 成年 C57 品系雄性小鼠及 Wistar
大鼠取自内蒙古大学实验动物研究中心国家二级清
洁型动物房。
1.2 方法
1.2.1 Gsg2 启动子的克隆 根据 Tokuhiro 等［2］研
究证实，小鼠启动子的功能区域位于 -144/+79 区
间，利用 PRIMER 5 软件设计包含该区间的 PCR 引
物，并在引物中引入 Hind Ⅲ 和 BamH Ⅰ酶切位点。
（下划线部分）以 C57 品系小鼠基因组 DNA 为模板，
分别以 Gsg2 基因启动子 5端和 3端两对引物进行
PCR 扩增程序 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性 40 s，
62℃退火 40 s，72℃延伸 40 s，共进行 35 个循环 ；
72℃延伸 10 min。Gsg2 启动子引物 ：上游 ：5-CGC
AAGCTTACTCCCTTTTCGTGTTTT-3；下游：5-CTAG
GATCCGGGTGAGCCTGTGCCATA-3。
1.2.2 DNA 克隆载体的构建与鉴定 按照 Mg2+ 浓度
优化后的条件扩大 PCR 反应，然后利用试剂盒回收
目的片段 DNA。按照 T-A 克隆载体 pMD19-T 的使用
说明书将获得的 DNA 目的片段连接到 pMD19-T 克
隆载体上，获得重组 DNA。将重组 DNA 转化 E. coli
DH5α 感受态细胞，在含有 X-gal、IPTG 和氨苄青霉
素的 LB 平板培养基中 37℃培养 14 h 后进行蓝白斑
筛选。PCR 后送上海生物工程公司进行测序。
1.2.3 载体的构建 以CMV-EGFP-pDsRed质粒为基
础载体，该载体中由 CMV 启动的绿色荧光蛋白基因
位于 pDsRed2-1 多克隆位点的相反方向，在其多克
隆位点插入 Gsg2 启动子，即可启动 RED2 红荧光蛋
白基因的表达。利用引物上引入的酶切位点 Hind Ⅲ
和BamHⅠ，将 Gsg2 启动子插入 CMV-EGFP-pDsRed
质粒载体的多克隆位点（MCS），以启动 RED2 红色
荧光蛋白的表达（图 1）。这样重组后的质粒载体可
同时启动红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的表达。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期204
图 1 CMV-EGFP-Gsg2-DsRed载体构建示意图
1.2.4 序列测定 将重组 DNA 转化 E. coli DH5α
感受态细胞，在含有卡纳霉素的 LB 平板培养基中
37℃培养 16 h 后提取质粒，限制性内切酶 Hind Ⅲ
和 BamHⅠ双酶切鉴定重组质粒。以所构建质粒载体
序列为模板，在 Gsg2 启动子与红色荧光蛋白序列两
端设计引物，上游 5-TCTCCACATCCCTCTCTCGG-3，
下游 5-CGCCCTTGGTCACCTTCAG-3。将阳性菌株
送至上海生物工程公司测序。
1.2.5 重组载体瞬时表达检测 由于 Gsg2 启动子可
以在单倍体精子细胞中表达且十分保守，本试验在
大鼠睾丸组织体外共培养体系中进行瞬时转染检测
重组载体的功能［14］。取 6只 15日龄wistar 品系大鼠，
用 75% 的乙醇浸泡 10 min，在无菌条件下将其转移
到 DPBS 溶液中，在显微镜下用镊子撕开睾丸白膜，
取出曲细精管组织块。 将组织块撕成约 2 mm 大小，
转移到含有 4 mL 培养液的 12 孔板中，每个培养皿
放入 4 块左右。在 37℃、5% CO2 的恒温细胞培养箱
中培养，每隔 2-3 d 换一次培养液。该大鼠睾丸组
织体外长期共培养体系经过大约 4 周可见大量圆形
精子细胞产生，此时利用 Lipofectamine 细胞转染试
剂盒将重组的质粒载体进行转染，48 h 后观察细胞
转染情况。
2 结果
2. 1 Gsg2启动子的PCR扩增及鉴定
以 C57 小鼠睾丸总 DNA 为模板，经 PCR 反应，
得到一个约 512 bp 的片段，与预期的片段大小相
符 （图 2）。胶回收 PCR 反应扩增产物，回收产物与
pMD19-T 载体（2 962 bp）连接，连接产物转化获
得阳性克隆，提取质粒 DNA 用 PCR 法筛选重组质
粒，得到一个约 512 bp 的片段，与目的片段大小相
符，pMD19-T 克隆载体构建成功，并命名为重组载
体 pMD19-T-Gsg2。重组质粒经 DNA 序列测定结果
表明，扩增出的 DNA 片段长 512 bp，经过序列比对，
与小鼠 Gsg2 启动子区段序列完全一致（图 3）。
2.2　含有双荧光蛋白质粒载体的构建及鉴定
利用引物上引入的酶切位点 Hind Ⅲ 和 BamH
Ⅰ，将小鼠 Gsg2 启动子插入到 CMV-EGFP-DsRed
质粒载体（5 832 bp）的多克隆位点（MCS），构建
具有双荧光蛋白质粒载体。筛选重组成功的菌株进
行扩大培养，提取质粒，用 Hind Ⅲ 和 BamHⅠ双酶
切鉴定，得到与预期相符的条带（图 4）。利用载体
2012年第9期 205于泊洋等 ：检测生精过程中减数分裂完成的质粒载体的构建
检测引物进行测序，所得结果与预期完全一致（图
5），表明本试验成功构建了含有小鼠 Gsg2 启动子的
重组质粒载体。
2.3 重组质粒载体转染大鼠睾丸组织共培养细胞
的瞬时表达检测
用荧光倒置显微镜观察，本试验所构建的重组
质粒载体可以在大鼠睾丸共培养细胞中瞬时表达，
在完成减数分裂的生精细胞中表达红、绿两种荧光
蛋白，在其他转基因细胞中仅表达绿色荧光蛋白（图
6）。试验结果证实，本试验成功构建了由 Gsg2 启动
子启动红色荧光蛋白和由 CMV 启动子启动绿色荧光
蛋白的双荧光质粒载体，由于 Gsg2 启动子的特异性，
该质粒载体在制备转基因鼠后，将仅在完成减数分
裂的生精细胞中表达红色荧光蛋白。
M. DL3000 DNA 分子量标准 ；1. 小鼠 Gsg2 基因启动子 PCR 产物
图 2 小鼠 Gsg2启动子 PCR产物凝胶电泳图
图 3 pMD19-T-Gsg2序列测定
3 讨论
1994 年，Tanaka 等［9］通过构建少精突变小鼠
与正常小鼠的睾丸 cDNA 差减文库分离出了一些生
精细胞特异表达基因。其中由 Gsg2 所表达的 Haspin
蛋白在完成减数分裂的生精细胞中表达，位于细胞
核内，与核内 DNA 相结合，具有 Ser/Thr 蛋白激酶
活性［11］。Gsg2 在生精细胞中通常以低甲基化状态
存在［15］，一般认为其在调控细胞周期与控制生精细
胞基因表达中发挥作用。由于 Haspin 蛋白在哺乳动
物睾丸中仅在完成减数分裂的生精细胞中表达，故
可作为鉴定生精过程中减数分裂完成的分子标记。
Tokuhiro 等［10］鉴定了 Gsg2 基因启动子的最小
区域（-144 到 +79），该段启动子可以在小鼠核分裂
的次级精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞中
启动报告基因的表达，从而为生精过程中减数分裂
的完成提供了分子水平鉴定标准［13］。由该质粒载体
构建的转基因鼠如果和我们已建立的睾丸细胞共培
养技术相结合［14，16］，可为进一步为日后进行精子
发生机制的研究，以及精原干细胞的研究奠定基础。
例如，精原干细胞的体外分化、利用精原干细胞进
行疾病治疗等研究建立适用的模型。
本试验所用的基础载体 CMV-EGFP-pDsRed 质
粒载体是以无启动子连接红色荧光基因 DsRed2 的
质粒在多克隆位点相反方向插入 CMV-EGFP 区段，
该质粒可以用来监测不同的启动子或启动子 / 增强
子复合物的转录能力。在 DsRed2 基因的上游序列
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期206
中插入 Kozak 转录起始位点，以增强其在真核细胞
中的转录效率。载体上的新霉素抗性基因（Neor）
可以在稳定转染真核细胞后用 G418 进行筛选［17］。
载体上的 CMV-EGFP 区段可以在所有成功转染细
胞中启动绿色荧光蛋白的表达，从而可以在单倍体
生精细胞外的其他细胞中鉴定质粒转染情况，为进
一步转基因动物的构建提供了基本鉴定标准。根据
Tokuhiro 等发表的文章中证实，人 Gsg2 启动子的功
能区域位于 -114/+79 区间。所以本试验设计包含以
上区间的启动元件连接到 CMV-EGFP-pDsRed 质粒
载体的多克隆位点。最后重组质粒载体经转染大鼠
睾丸共培养细胞检测，可以得到瞬时表达红色荧光
蛋白和绿色荧光蛋白的圆形精子细胞，说明本试验
图 5 Gsg2启动子与 DsRed序列连接部分序列测定
图 4 重组质粒酶切鉴定图
1. λ（H&E）；2. 1# plasmid；3. 1# BamH I；4. 2# plasmid；5. 2# BamH I；6.
3# plasmid ；7. 3# BamH I ；8. 4# plasmid ；9. 4# BamH I ；10. 1# BamH
I+Hind III ；11. 2# BamH I+Hind III ；12. CMV+eGFP ；13. DL3000
A. 成功转染的圆形精子细胞与支持细胞经 CMV 成功启动绿色荧光蛋白基因 ；B. 成功转染的圆形精子细胞，经 Gsg2 启动子成功
启动红色荧光蛋白基因 ；C. 可见光下的睾丸共培养细胞 ；RS. 圆形精子细胞 ；SP. 精母细胞 ；S. 支持细胞 ；（标尺为 20 μm）
图 6 重组质粒载体在大鼠睾丸共培养细胞中的瞬时表达检测
成功构建了含 Gsg2 启动子的 CMV-EGFP-DsRed 双
荧光质粒载体。因为该载体中Gsg2启动子的特殊性，
预计由该启动子制备的转基因小鼠睾丸内，将在单
倍体生精细胞中表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，
2012年第9期 207于泊洋等 ：检测生精过程中减数分裂完成的质粒载体的构建
而在其他细胞中只表达绿色荧光蛋白。将该载体通
过一定的方法转染到精原干细胞，可以为精原干细
胞分化能力的鉴定提供更为可靠的依据。将该载体
通过一定的方法稳定整合到动物体内，可以制作在
细胞核分裂的次级精母细胞、圆形精子细胞和长形
精子细胞中表达红色荧光蛋白的转基因动物，从而
为精子发生过程的研究提供有力的工具。
4 结论
以 Gsg2 启动子 DNA 序列为模板，PCR 得到两
端分别带有 BamHⅠ及 Hind Ⅲ酶切位点的 Gsg2 启
动子序列并测序。将测序正确的片段插入到 cmv-
eGFP-DsRed 载体的多克隆位点。在 Gsg2 启动子与
DsRed 序列链接部分设计引物并测序。将测序正确
质粒转染睾丸共培养体系得到了既表达红色荧光蛋
白又表达绿色荧光蛋白的生精细胞，证明了该载体
的生物学活性与功能。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）