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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
长期以来酿酒酵母都是生物研究中重要的模式
菌株，因其具有天然产乙醇的能力，更是生物质能
源研究利用分子克隆转化纤维素分解基因的热点［1］。
Lönn 等［2］应用基因工程改造酿酒酵母利用木糖。
在这些研究过程中获得高质量无 DNA 污染的 RNA
进行其它分子生物学研究的关键［3］。常规试验中用
收稿日期 ：2012-04-09
基金项目 ：中国农业科学院作物科学研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助项目（2060302-13）
作者简介 ：李维维，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物学 ；E-mail: congtouzailai888@126.com
通讯作者 ： 曲娟娟，女，教授，博士生导师，研究方向 ：微生物遗传育种 ；E-mail ：juanjuanqu@126.com
顿宝庆，男，副研究员 ；E-mail: baoqingdun9@hotmail.com
一种改良的热酚法高效快速提取酿酒酵母总 RNA
李维维1，2  顿宝庆2  王智2  曲娟娟1
（1 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030 ；2 中国农业科学院作物科学研究所
中国农业科学院生物质能源研究中心，北京 100081）
摘 要 ： 以酿酒酵母单倍体 CEN.PK1 与双倍体 CEN.PK2 为研究对象，利用改良热酚法，快速高效地提取酿酒酵母总 RNA。
结果显示应用该方法提取的酿酒酵母 CEN.PK1 和 CEN.PK2 的总 RNA 经分光光度计测定浓度为 7.63 μg/μL 和 3.77 μg/μL，OD260/280
分别为 2.10 和 2.04，OD260/230 分别为 2.32 和 2.24，浓度与纯度均能达到后续分子生物学试验的要求。经 PCR 与荧光定量 PCR 检测，
该方法提取的 RNA 无 DNA 污染，可作为 PCR 反应的模板，与 Trizol 方法提取 RNA 相比，该方法不仅浓度高并且可将提取时间由
常规的 2.5 h 缩短为 1.5 h，具有操作简单、 高质、高效等优点，经多次试验证明，此方法同样适用于酿酒酵母总 RNA 的大量提取试验，
有较高的实用价值。
关键词 ： RNA 分离 酿酒酵母 热酚法 cDNA 荧光定量 PCR
A Modified Method for the Efficient and Fast Extraction of Total RNA
from Saccharomyces cerevisiae with Hot-Phenol
Li Weiwei1，2 Dun Baoqing2 Wang Zhi2 Qu Juanjuan1
（1 Institute of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030 ；2 Biomass Energy Research Center，Institute of Crop Science，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract:  To research an efficient method for total RNA extraction from Saccharomyces cerevisiae, haploid CEN.PK1and diploid CEN.
PK2 as the object of study was used to study the new modified hot-acid-phenol method. The total RNA concentration of CEN.PK1 and CEN.PK2
was 7.63 mg/mL and 3.77 mg/mL, OD260/280 was 2.10 and 2.04 and OD260/230 was 2.32 and 2.24, using the modified method by spectrophotometer
determination．It is proved that the RNA was fit for the requirements of follow-up experiments in molecular biology by PCR and fluorescence
quantitative PCR detection without DNA contamination compared with the Trizol method. The extraction time 1.5 hours is shorter than that of
conventional method 2.5 hours used and the modified method has the advantages of simple operation, high efficiency and high quality. Repeated
experiments proved that this method can also be used to extract the total RNA amount of Saccharomyces cerevisiae and can be used for practical
applications．
Key words:  RNA extraction Saccharomyces cerevisiae Hot-phenol method cDNA Fluorescence quantitative PCR
于 RNA 提取的方法有 TRIZOL 法、异硫氰酸胍法
等［4］，这些方法中所用各种试剂配制简单，所用药
品费用与市售试剂盒相比较低，但是提取时间需要
3 h 左右。本试验就是在各种提取总 RNA 方法基础
之上总结、试验出来较为适合酿酒酵母快速高效提
取总 RNA 的方法。常规提取 RNA 的方法不适合液
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期164
体发酵酵母，而且这些方法太繁琐不能应用于大量
样品的提取［5］。经多次试验本方法也同样能够大量
提取酿酒酵母的总 RNA，而且提取的总 RNA 质量、
浓度与少量提取的相比同样能达到后续试验的要求。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株 单倍体酿酒酵母 CEN.PK1 和双倍
体酿酒酵母 CEN.PK2，为本实验室保藏。
1.1.2 主 要 试 剂 和 仪 器 Trizol，TES 溶 液（ 在 80
mL DEPC 水中加入 1 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH7.5），
2 mL 0.5 mol/L EDTA，5 mL 10% SDS， 定 容 至 100
mL，高压灭菌）；PBS 溶液（磷酸盐缓冲溶液）；水
饱和酚；酚 / 氯仿 / 异戊醇（25 24 1）；乙酸钠（pH 5.2）；
无水乙醇 ；75% 乙醇 ；DEPC 处理过的水 ；QIAGEN
反转录试剂盒 ；液氮 ；超净工作台 ；低温离心机 ；
涡旋混合器 ；分光光度计 ；凝胶成像仪 ；水浴锅 ；
Biometra PCR 仪 ；ABI7300 荧光定量 PCR。
1.2 方法
1.2.1 酿酒酵母细胞培养 从平板上挑取酿酒酵母
接种到活化培养基中，于 30℃ 160 r/min 培养。至
培养基 OD 值为 1.0 时，转接到新鲜培养基中，30℃
160 r/min 继续培养直至取样测其 OD 值为 1.0，并计
算 2×108 个细胞所用培养液的体积。
1.2.2 改良热酚法提取酿酒酵母总 RNA 室温下
5 000×g 离心 2 min，然后各加入适量 PBS 溶液重悬，
离心弃上清。加入 400 μL TES 溶液、400 μL 水饱和
酚，剧烈振荡混匀，于 65℃的水浴中加热 10 min，
期间每隔 2 min 剧烈振荡 1 次。冰浴 3 min，4℃，
10 000×g 离心 6 min。水相转移到新的离心管中，
400 μL 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇（25 24 1） 抽 提 一 次，
4℃，10 000×g 离心 5 min。水相再转移到新的离心
管中，加入 1/10 体积的乙酸钠（pH5.2）及 2 倍体
积的无水乙醇，液氨中沉淀 2 min，4℃，10 000×g
离心 5 min，弃上清。沉淀用 1 mL 75% 乙醇洗 1 次，
室温晾干，加入 60 μL DEPC 处理过的水，在 65℃
水浴加热 5 min 并充分溶解 RNA 沉淀。
1.2.3 Trizol 法提取酿酒酵母总 RNA Trizol 法提取
过程详见其说明书。
1.2.4 酿 酒 酵 母 总 RNA 检 测 以 1×TAE 为 电 泳
缓冲液，用 1.5% 的琼脂糖凝胶，电压 120 V，电流
100 mA 电泳 10 min，检测酿酒酵母总 RNA 的完整
性。用分光光度计测定酿酒酵母总 RNA 的浓度和纯
度，并测定 OD260/OD280 的数值。
1.2.5 反转录 PCR（RT-PCR）及普通 PCR 验证
利用以上两种方法所提取的酿酒酵母总 RNA 进行反
转录。反转录体系为 ：Oligo-dT primer（10 μmol/L）
2 μL，10×Buffer RT 2 μL，dNTP Mix（5 mmol/L each
dNTP）2 μL，RNase inhibitor（10 units/μL）1 μL，
Ominscript Reverse Transcriptase 1 μL，模板 RNA 5 μL，
用无 RNase 的 H2O 补充至 20 μL。37℃ 1 h 将 mRNA
反转录为 cDNA。试验针对酿酒酵母 ACT1 保守基因
根据 GenBank 中提供的 ACT1 基因序列（GeneID ：
850504）， 利 用 Primer5.0 设 计 引 物， 并 在 NCBI ：
Primer Blast 中比对所设计引物，所设计引物由北京
六合华大基因科技股份有限公司合成。酿酒酵母肌
动蛋白基因（不含内含子）正向引物 ATGGATTCT-
GAGGTTGCTGCTT，反向引物 AGATGGACCACTTT-
CGTCGTATT。以反转录 cDNA 稀释 100 倍为模板进
行 PCR 验证。 PCR 反应体系 20 μL ：无菌去离子水
16.6 μL ；10×Ex Taq buffer 2 μL ；dNTP Mix 0.4 μL ；
正向引物 0.4 μL ；反向引物 0.4 μL ；模板 cDNA 0.1
μL ；Ex Taq 酶 0.1 μL。PCR 反应程序 ：94℃，5 min ；
94℃，45 s ；52℃，45 s ；72℃，1 min 20 s ；72℃，
10 min ；4℃无限延伸 ；25 个循环。
1.2.6 RNA 中有无 DNA 污染检测 以单倍体和双
倍体酿酒酵母基因组和改良方法所提总 RNA 为模
板，用酿酒酵母肌动蛋白基因（含有内含子）正向
引 物（TATGTTCTAGCGCTTGCACCA）， 反 向 引 物
（TAGATGGACCACTTTCGTCGTATT） 进 行 PCR 扩
增验证。PCR 反应体系 20 μL ：无菌去离子水 16.6
μL ；10×Ex Taq buffer 2 μL ；dNTP Mix 0.4 μL ；正向
引物 0.4 μL ；反向引物 0.4 μL ；模板 0.1 μL ；Ex Taq
酶 0.1 μL。PCR 反应程序：94℃，5 min；94℃，45 s；
52℃，45 s；72℃，2 min；72℃，10 min；4℃无限延伸；
25 个循环。
1.2.7 荧光定量 PCR 用改良热酚法所提 RNA 反转
录的 cDNA 稀释 100 倍为模板做荧光定量 PCR。荧
光定量 PCR 反应体系 20 μL ：SYBR® Premix Ex TaqTM
（2×）10 μL ；PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4
2012年第12期 165李维维等 ：一种改良的热酚法高效快速提取酿酒酵母总 RNA
μL ；PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL ；Rox
Reference Dye（50×）0.4 μL ；cDNA 模板 2 μL ；无
菌去离子水 6.8 μL。荧光定量 PCR 反应程序两步法：
第一步预变性 95℃ 30 s ；第二步 PCR 反应 95℃ 5 s，
60℃ 31 s，40 个循环。
2 结果
2.1 酿酒酵母总RNA电泳图
提取的总 RNA 经 1.5% 的琼脂糖凝胶检测结果
如图 1 所示。用改良热酚法所提 RNA 经电泳检测后，
28S 与 18S 条带亮度接近 2 1 且没有降解（图 1-a），
用 Trizol 法所提 RNA 有少量降解且点样孔有杂质污
染（图 1-b）。
2.2 RNA浓度及纯度
用 Trizol 法所提 RNA 经分光光度计测定 OD260/280
大于 2.1，OD260/230 值小于 2.0，表明所提 RNA 纯度
较低。用改良热酚法提取 RNA 经分光光度计测定
OD260/280 值介于 1.8-2.1 之间，OD260/230 值大于 2.0（表
1），表明所提 RNA 纯度较高。与 Trizol 方法相比所
提 RNA 浓度与纯度都较高，通过多次试验验证，结
果稳定。
2.3 RT-PCR检测
酿酒酵母总 RNA 的 RT-PCR 扩增酿酒酵母肌动
蛋白基因电泳检测结果，如图 2 所示。改良热酚法
所提 RNA 反转录 cDNA 为模板扩增出酿酒酵母中保
守肌动蛋白编码基因的 PCR 产物电泳图（图 2-a），
以及 Trizol 法所提 RNA 反转录 cDNA 为模板扩增出
酵母中保守肌动蛋白编码基因的 PCR 产物电泳图（图
2-b），均显示与酿酒酵母肌动蛋白基因（不含内含
子）1 104 bp 大小一致，表明用改良热酚法所提
RNA 与 Trizol 法相比同样能进行反转录及后续试验
反应。
2.4 RNA中DNA污染的检测
以酿酒酵母基因组和改良方法所提总 RNA 为
PCR 模板，扩增酿酒酵母肌动蛋白基因（含有内含
子）电泳检测结果，如图 3 所示。用含有内含子的
28S
1 3 42
18S
a
28S
1 3 42
18S
b
1，3. CEN.PK1 总 RNA ；2，4. CEN.PK2 总 RNA
图 1 用改良热酚法（a）及 Trizol 法（b）所提取的酿酒
酵母总 RNA 电泳图
表 1 酿酒酵母总 RNA 浓度及纯度
方法 菌株 材料（细胞个数） RNA 含量（μg） OD260/280 OD260/230 浓度（μg/μL）
Trizol 法
CEN.PK1 2×108 96 2.15 1.93 0.96
CEN.PK2 2×108 49 2.01 1.74 0.49
改良热酚法
CEN.PK1 2×108 534.1 2.10 2.32 7.63
CEN.PK2 2×108 263.9 2.04 2.24 3.77
M. 2 000 bp Marker ；1，3. CEN.PK1 所提 RNA 反转录 cDNA 扩增动蛋白基因
（不含内含子）；2，4.CEN.PK2 所提 RNA 反转录 cDNA 扩增动蛋白基因（不
含内含子）
图 2 用改良热酚法（a）及 Trizol 法（b）所提取的酿酒酵
母 cDNA 扩增肌动蛋白基因（不含内含子）电泳图
1M 3 42
1000
bp bp
a
1M 3 42
1000
b
酿酒酵母肌动蛋白引物进行 PCR，结果酿酒酵母基
因组能扩增出目的片段（1 403 bp）；而以 RNA 为
PCR 模板不能扩增出目的片段，证明用改良热酚法
所提 RNA 中没有酵母基因组污染，所提 RNA 纯度
较高。
2.5 荧光定量PCR
酿酒酵母总 RNA 提取质量的荧光定量 PCR 电
泳检测结果，如图 4 所示。用改良热酚法所提 RNA
反转录 cDNA 进行荧光定量 PCR 电泳图条带清晰，
大小 250 bp 与所设计片段大小一致，证明用改良热
酚法所提 RNA 能进行荧光定量等后续反应。
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3 讨论
酿酒酵母细胞壁主要由葡聚糖、甘露寡糖、糖
蛋白和几丁质组成，葡聚糖构成细胞壁的基质，中
间是一层蛋白质分子，其上覆盖一层甘露寡糖。由
于其特殊复杂的细胞壁结构就增加了提取 RNA 的难
度。常规提取 RNA 的方法不适合稳定期和液体发酵
酵母，而且这些方法太繁琐不能应用于大量样品提
取。本试验方法是参照 Amin-ul Mannan 等［5］的提取
方法，经过改良所成。试验中 PBS 清洗酵母可以降
低液体培养基中杂质与细胞外界的 RNase 酶。本方
法利用 TES 试剂可以解决单独破壁、匀浆的步骤［6］，
一步结合破壁与匀浆降低了在破壁与匀浆过程中
RNase 酶对 RNA 的降解。通过加入 SDS 试剂配合
65℃水浴［5］与涡旋能够将破壁与匀浆结合并且 SDS
能够抑制 RNase 酶的活性，防止 RNA 的降解。涡
旋结束后冰浴可以使 RNA 充分溶解到细胞外并且低
温环境降低 RNase 酶的活性。利用酚 / 氯仿 / 异戊
醇抽提可去除多糖、蛋白、DNA 等杂质，再次用水
饱和酚抽提一次彻底去除 DNA 与蛋白质的污染，提
高了 RNA 的纯度［7，8］。用无水乙醇在液氮中沉淀 2
min，利用瞬时超低温可以破坏残存 RNase 的结构使
其失去活性，并且能够快速沉淀 RNA，与常规提取
RNA 的方法［9］相比能够节约 30 min 达到同样的效果。
通过酿酒酵母单倍体与双倍体基因组与 RNA
电泳图可知应用本试验方法提取出来的酿酒酵母总
RNA 没有基因组 DNA 污染，5S 条带不明显且没有
拖尾现象，RNA 完整性较高。
4 结论
应用改良的热酚法提取的酿酒酵母总 RNA 浓
度与纯度均能达到后续分子生物学试验的要求。所
提取的 RNA 无 DNA 污染，可作为 PCR 反应的模
板。该方法可将提取时间由常规的 2.5 h 缩短为 1.5
h，且具有操作简单、 高质、高效等优点。此方法同
样适用于酿酒酵母总 RNA 的大量提取试验，有较高
的实用价值。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）
图 3 RNA 中 DNA 污染的检测电泳图
M. 2 000 bp Marker；1，2. CEN.PK1、CEN.PK2 基因组扩增酵母肌动蛋白基因；
3，5 和 4，6 分别为 CEN.PK1、CEN.PK2 所提 RNA 为模板
1M 3 4 5 62
1000
2000
bp
1M 3 42
200
400
bp
M. 4 000 bp Marker；1，2. CEN.PK1 荧光定量 PCR 产物电泳图；
3，4. CEN.PK2 荧光定量 PCR 产物电泳图
图 4 酿酒酵母 cDNA 荧光定量 PCR 电泳图