全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-09-21
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31160469）, 内蒙古自然基金项目（2011MS0521）
作者简介 : 史偈君 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 基因工程 ; E-mail: shi-ji-jun@126.com; 杨娇馥同为第一作者
通讯作者 : 王志钢 , 男 , 教授 , 研究方向 : 哺乳动物生殖生物学与生物技术 ; E-mail: lswzg@imu.edu.cn
内蒙古白绒山羊 TSC2 基因克隆与表达模式分析
史偈君1,2 杨娇馥1 张涛1 秦毅1 谢鸿云1 李树裕1 郝喜燕1 王志钢1
（1内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021 ；2同济大学生命科学与技术学院，上海 200092）
摘 要 : 旨在克隆内蒙古白绒山羊 TSC2 基因 cDNA 并分析其特性及基本表达模式。利用 RT-PCR 分段克隆 TSC2 基因 cDNA
片段并测序，将得到的 cDNA 各片段核苷酸序列拼接后获得绒山羊 TSC2 基因编码区全长序列（HQ684023）并进行生物信息学分析。
半定量 RT-PCR 方法检测 TSC2 基因在不同组织中的表达特异性。结果表明内蒙古白绒山羊 TSC2 基因 cDNA 编码区核苷酸序列为
5 184 bp，包含了编码 1 727 个氨基酸残基的全长 ORF。核苷酸序列与牛、猪、马、大熊猫、犬、恒河猴、人、小鼠及大鼠的同源
性分别为 97%、90%、89%、88%、87%、87%、87%、86% 和 86%。NCBI CDD 程序预测该基因编码的蛋白质有一个 Tuberin 结构
域和一个 Rap-GAP 结构域 ； Psite 程序分析有 5 个 N 糖基化位点、2 个 cAMP 和 cGMP 依赖蛋白激酶磷酸化位点、16 个蛋白激酶 C
磷酸化位点、25 个酪蛋白激酶磷酸化位点。 PSORT 程序预测其定位于胞内体膜。TSC2 基因在内蒙古白绒山羊的睾丸、脑、肝脏、
肺、乳腺、脾和肾脏等组织中都有表达，mRNA 丰度在睾丸中较高，乳腺中较低。
关键词 : 内蒙古白绒山羊 TSC2 表达模式
Cloning and Expression Pattern of TSC2 Gene in Inner
Mongolia Cashmere Goat
Shi Jiejun1,2 Yang Jiaofu1 Zhang Tao1 Qin Yi1 Xie Hongyun1 Li Shuyu1 Hao Xiyan1 Wang Zhigang1
（1College of Life Science, Inner Mongolia University, Huhhot 010021 ；2School of Life Sciences and Technology，
Tongji University， Shanghai 200092）
Abstract: The present study aims at cloning the TSC2 gene cDNA in Inner Mongolia cashmere goat and analyzing its tissue-specific
expression pattern. TSC2 gene was cloned by RT-PCR in segmentations. Then, fragments were concatenated by contig method to obtain the full
length of the gene. The nucleotide sequence was analyzed with bioinformatics. The tissue-specific expression pattern of TSC2 gene was analyzed
by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that the cloned TSC2 gene cDNA was 5184 bp in length, including a complete ORF encoding
1727 amino acids. The nucleotide sequence shares 97%, 90%, 89%, 88%, 87%, 87%, 87%, 86% and 86% identity with Bos taurus, Sus scrofa,
Equus caballus, Ailuropoda melanoleuca, Canis familiari, Macaca mulatta, Homo sapiens, Mus nusculus and Rattus norvegicu. Analysis by NCBI
CDD suggested that the encoded protein contained a Tuberin domain and a Rap-GAP domain. Analysis with Psite indicated 5 N-glycosylation
site, 2 cAMP-/cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, 16 Protein kinase C phosphorylation sites and 25 Casein kinase II
phosphorylation sites in this protein. Analysis by PSORT suggested that this protein most probably localized in endomembrane. This TSC2 gene
was expressed in testicle, brain, liver, lung, mammary glands, spleen and kidney.
Key words: Inner Mongolia cashmere goat TSC2 Expression pattern
人 结 节 性 硬 化 症（Tuberous sclerosis complex，
TSC）是常染色体显性遗传紊乱而导致的，TSC 的
形成是由于两个抑癌基因 TSC1 和 TSC2 突变引起
的，它们的编码蛋白分别被称为 hamartin 和 tuberin。
TSC2 是 一 种 GTPase 激 活 蛋 白（GTPase-activating
protein，GAP），在细胞内与 TSC1 形成稳定的功能
复合体 TSC1/TSC2 而发挥作用。TSC1/TSC2 复合体
是 mTOR 信号通路上游的负调节物，TSC2 可以激活
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期86
其下游的小 GTP 酶蛋白 Rheb-GTP 使其 GTP 水解而
呈 Rheb-GDP 状态［1-4］。近年的研究表明 TSC1/TSC2
复合体作为 mTOR 的上游负调节因子，可以感受细
胞内的低能、缺 O2 和环境压力胁迫的刺激，还可
能感受细胞粘附斑的刺激［5,6］和胞内氨基酸水平的
变化［7,8］，是一个多信号汇聚的交叉点。在酵母中
TSC1 和 TSC2 的缺失会导致氨基酸吸收的缺陷，这
种缺陷会引起试验菌株对培养基中氨基酸的高度依
赖［9,10］。而且两者的变化会改变细胞对有毒的精氨
酸类似物的敏感性［11］和细胞生长［12］，这种现象类
似于氮饥饿环境下细胞出现的状况［13,14］。在哺乳动
物细胞中 TSC1 或 TSC2 表达的减少都会引起细胞周
期中 S 期的增强［15］，而 TSC1 或 TSC2 的过表达则
会引起 G1 期的延长并抑制细胞的增殖，反之则使
G1 期缩短且组织肥厚［16］。人的 TSC2 基因的 20 号
内含子的部分缺失会导致细胞的快速生长，从而引
起 TSC 疾病的发生［17,18］。已报道的哺乳动物 TSC2
基因全长在 5.5 kb 左右，因物种和转录本的不同而
有所不同，已在人及一些动物中得到深入研究，但
尚未有山羊 TSC2 基因的报道。本研究拟克隆内蒙
古白绒山羊 TSC2 基因并分析其表达模式，旨在为
进一步研究其基因产物在肌体感受营养信号及能量
代谢方面的作用提供条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和试剂 大肠杆菌 DH5α 由本实
验室保存，克隆载体 pMD19-T Vector、LA-Taq DNA 聚
合酶、T4 DNA 连接酶、反转录酶 M-MLV、常用限制
性内切酶、DNA 分子量标准 DL2000、RNAiso Reagent
等购自宝生物工程（大连）有限公司 ；氨苄青霉素
和卡那霉素购自 Sigma 公司（Sigm-Aldrich）；琼脂
糖凝胶 DNA 回收试剂盒 AxyPrep DNA Gel Extraction
Kit 购自 Axygen （杭州）有限公司；DMEM/F12 培养基、
D-PBS（Geneticin sulphate） 为 Gibco 产 品 ；标 准 胎
牛血清（FBS）、G418 为 Hyclone 产品 ；其他试剂均
为国产分析纯。
1.1.2 动物组织及细胞培养条件 内蒙古白绒山羊
40 d 胎儿取自内蒙古白绒山羊种羊场。胎儿带回实
验室后经原代培养纯化胎儿成纤维细胞，置液氮中
保存。继代培养采用单层培养子代细胞。所用培养
基 为 含 有 10% FBS 的 DMEM/F12，37 ℃、5% CO2、
饱和湿度条件下培养。
睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾和肾脏等组织
样本取自新屠宰羊，迅速放入液氮中冷冻，带回实
验室置 -80℃冰箱中保存备用。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成 按总
RNA 提取试剂盒（RNAiso Reagent）说明书的操作
方法提取绒山羊胎儿成纤维细胞和组织总 RNA，琼
脂糖凝胶电泳验证 RNA 的完整性，紫外测定定量。
用 Oligo d （T）18 Primers 按照反转录酶 MMLV 说明书
的方法反转录合成第一链 cDNA，作为 PCR 扩增的
模板。反转录完成后，PCR 扩增 β-actin 基因以检测
cDNA 第一链的合成质量。
1.2.2 引 物 设 计 及 TSC2 基 因 的 分 子 克 隆 根 据
GenBank 上公布的牛（Bos Taurus）（XM_581197）、人
（Homo sapiens）（NM_000548）、小鼠（Mus musculus）
（NM_011647）、大鼠（Rattus norvegicus）（NM_012680）
等动物 TSC2 基因编码区序列，采用分段克隆的策
略设计简并引物。经 Primer 5 软件分析设计 4 对引
物分段扩增 cDNA 片段，引物位置见图 1。第一对，
P1-1：5-ATGGCTAAGCCAGCAAGC-3，P2-1：5-ATCA
GCTTCCAGCAAGGTTC-3，预期片段长度 779 bp ；
第 二 对，P1-2 ：5-TCTGTGAACCTTGCTGGAAG-3，
P2-2：5-AGGACCGCAGTCTTCACAT-3，预期片段长
度 940 bp；第三对，P1-3：5-CCCCCTGAGCTGGAGGA
GAGAGAT-3，P2-3：5-GTCCCGGGCTCCGTGGTACA
C- 3，预期片段长度 1 620 bp；第四对，P1-4：5-CAC/T
GTCATAGCCATGTGGTTC-3，P2-4：5-TCACACGAA
MTCAGTGAAGTCG-3（其中 M 为 A、C 简并），预
期片段长度 2 574 bp。引物由大连宝生物工程有限
公司合成。
以内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞总 RNA 的反
转录产物 cDNA 为模板，以上述 4 对引物分别扩增
图 1 引物设计图及各片段的预期长度
2012年第2期 87史偈君等 ：内蒙古白绒山羊 TSC2 基因克隆与表达模式分析
相应片段，PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳后纯
化回收，回收产物连接 pMD19-T 载体，分别构建质
粒 pMD19-T-TSC2-1、pMD19-T-TSC2-2、pMD19-T-
TSC2-3 和 pMD19-T-TSC2-4，转化 E.coli DH5α。Amp
筛选阳性克隆，重组质粒经酶切鉴定正确后送上海
生工生物工程技术服务有限公司测序。各段序列通
过拼接得到 TSC2 基因 CDS 全长序列。
1.2.3 生物信息学分析方法 TSC2 基因 cDNA 序列
用 NCBI 上的 BLAST 进行序列比对（http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/BLAST/），蛋白质分子量采用 Peptide Pro-
perty Calculator 软 件 分 析 （http://www.basic.northwest-
ern.edu/biotools/proteincalc.html），等电点采用 Calcula-
tion of protein isoelectric point 软件分析（http://isoelec-
tric.ovh.org/），蛋白质结构域分析采用 NCBI CDD 软
件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.
cgi），蛋白质功能位点分析采用 Psite 软件（http://
linux1.softberry.com/berry.phtml）， 用 MEGA4.1 软 件
进行同源性比对及构建进化树。
1.2.4 组织表达特异性检测 收集内蒙古白绒山
羊睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾和肾脏组织材
料 , 提取总 RNA, 以反转录得到的 cDNA 第一链为模
板 , 选 择 P1-3 和 P2-3 作 为 引 物 PCR 扩 增 TSC2 基
因片段，预期片段长度 1 620 bp。以 β-actin 基因为
内源对照进行半定量 RT-PCR 分析，上游引物 P1:
5-TGGCACCACACCTTCTACAACGAGC-3，下游引物
P2 ：5-CGTCCCCAGAGTCCATGACAATG-3，预期片
段长度为 229 bp。利用 bandlead 软件分析电泳条带
灰度。
2 结果
2.1 TSC2基因cDNA克隆与序列测定
以内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞 cDNA 为模
板分别用 4 对引物扩增得到 4 段与预期片段大小相
符的特异性片段（图 2）。
A.TSC2 基因 cDNA 片段 1 的 PCR 扩增 ；B.TSC2 基因 cDNA 片段 2 的 PCR 扩增 ；C. TSC2 基因 cDNA 片段 3 的 PCR 扩增 ；d. TSC2 基因
cDNA 片段 4 的 PCR 扩增 ；M. DL2000 DNA Marker ；1. 阳性对照 β-actin ；2. 阴性对照 ；3. 扩增片段 ；M0. λ-Hind III digest DNA Marker
图 2 内蒙古白绒山羊 TSC2 基因 cDNA 的 PCR 扩增
2.2 基因序列分析
克隆到的内蒙古白绒山羊 TSC2 基因 cDNA 片
段长 5 184 bp，包含了完整的 ORF，对应序列编码
1 727 个氨基酸残基（HQ684023）。核苷酸序列与牛、
猪、马、大熊猫、家犬、恒河猴、人类、小家鼠及
褐 家 鼠 的 同 源 性 分 别 为 97%、90%、89%、88%、
87%、87%、87%、86% 和 86%。
已完成 TSC2 基因组序列测定的哺乳动物有很多
种，选择其中的牛（Bos taurus）、家犬（Canis famili-
aris）、马（Equus caballus）、小家鼠（Mus nusculus）、
人类（Homo sapiens）、褐家鼠（Rattus norvegicus）与
获得的白绒山羊（Capra hircus）的 TSC2 基因进行
核苷酸序列的同源性比对，以 MAGE4.1 软件的邻
接法（neighbor-joining method，NJ）程序完成进化
分析（图 3）。结果表明内蒙古白绒山羊与牛的亲缘
关系较近。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期88
2.3 编码蛋白分析及功能预测
克隆到的内蒙古白绒山羊 TSC2 基因编码的蛋
白预测分子量为 191.6 kD，等电点（pI）为 6.917，
其氨基酸组成中亮氨酸的含量最高，占 12.82%。
NCBI CDD 预测 551-883 位氨基酸残基为 Tuberin 结
构域，1 479-1 668 位氨基酸残基为 Rap-GAP 结构域
（图 4）。推测的氨基酸序列中可能有 5 个 N 糖基化
位点、2 个 cAMP 和 cGMP 依赖蛋白激酶磷酸化位点、
15 个蛋白激酶 C 磷酸化位点、25 个酪蛋白激酶Ⅱ磷
酸化位点、7 个酪氨酸激酶磷酸化位点、9 个 CAAX
box 和 1 个内质网靶序列。
3 讨论
TSC2 是 GTPase 激活蛋白（GTPase-activating pro-
tein，GAP），具有保守的 Rap-GAP 结构域和 Tuberin
结构域［19,20］。本试验所克隆的内蒙古白绒山羊 TSC2
基因 ORF 推测编码的蛋白质经 NCBI CDD 分析具
有这两种保守结构域，与其它物种 TSC2 蛋白相符，
证明内蒙古白绒山羊 TSC2 基因被正确克隆。预测
得知内蒙古白绒山羊 TSC2 的 1 479-1 668 位氨基酸
残基为 Rap-GAP 结构域，是 Rheb 的上游负调节物，
进一步证明了绒山羊 TSC2 结构与功能的一致性。
Fukuda 和 Kobayashi 等［21］研究者曾报道 TSC2
蛋白在小鼠的乳腺导管、唾液腺、胃腺体、甲状旁
腺、大肠、卵巢和子宫等多种组织及腺体中均有表达。
本研究检测结果表明，TSC2 基因在内蒙古白绒山羊
的睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾和肾脏中均有转录，
表明 TSC2 基因可在多种组织中表达，进一步证明
该基因在哺乳动物中具有保守的功能。
内蒙古白绒山羊（Inner Mongolia cashmere goat）
是经过长期的自然选择和人工选育而形成的优良产
绒品种，但近年来由于草场退化，种群数量增加，
舍饲比例加大，导致其生产性能降低，这其中肌体
对营养和能量信号刺激的敏感性起着重要的作用，
但机制尚不清楚。TSC2 是一个多种信号通路汇聚的
中心节点，在动物胚胎发育及幼体生长中也起着重
要的作用。对 TSC2 基因的研究不仅可以区别物种
间的遗传差异和进化特征，而且对动物细胞生长与
胚胎发育过程中对外界影响因素的反应机制研究具
有重要意义。
4 结论
内蒙古白绒山羊 TSC2 基因 cDNA 编码区核苷
酸序列为 5 184 bp，包含了编码 1 727 个氨基酸残基
的全长 ORF。核苷酸序列与已报道哺乳动物 TSC2
基因核苷酸序列同源性在 86%-97% 之间。TSC2 基
因在内蒙古白绒山羊的睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、
脾和肾脏等组织中都有表达，mRNA 丰度在睾丸中
较高，乳腺中较低。
参 考 文 献
［1］ Schmelzle T, Hall MN. TOR, a central controller of cell growth. Cell,
图 3 若干物种的 TSC2 核苷酸聚类分析
图 5 半定量 RT-PCR 检测 TSC2 基因组织表达特异性
图 4 TSC2 蛋白质结构域分析结果
2.4 TSC2基因组织表达特异性
半定量 RT-PCR 检测（图 5）显示，TSC2 基因
在内蒙古白绒山羊的睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾、
肾脏中均有表达，在睾丸中 mRNA 丰度较高，乳腺
组织中相对低。
表达组织
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（责任编辑 李楠）