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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 2期
内蒙古白绒山羊 VEGF164基因 cDNA克隆及
组织表达特异性分析
鲍文蕾
杨娇馥
李彬
刘俊娥
王潇
郭旭东
王志钢
侯鑫
刘东军
(内蒙古大学生命科学学院 哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特 010021 )


摘
要:
旨在克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子 ( vascu lar endo the lial grow th factor, VEGF164)基因并分析其基本表达
模式。采用 RT-PCR技术克隆基因, 将得到的基因 cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用半定量 RT-
PCR方法进行组织表达检测。获得了内蒙古白绒山羊 VEGF164基因编码区 cDNA全长序列,扩增片段全长 573 bp,包含了完整
的 ORF,编码 190个氨基酸残基。核苷酸序列与绵羊的 VEGF164( EU857623
1)基因同源性为 99%, 相应的氨基酸序列同源性为
99%。 SMART程序分析表明, ORF编码的蛋白质具有信号肽序列及血小板衍生和血管内皮生长因子家族 ( PDGF, VEGF )结构
域。Psite程序分析表明,有 1个蛋白激酶 C磷酸化位点, 4个酪蛋白激酶磷酸化位点。P ro tCom p Version 9
0程序分析将其定位
于细胞外。RT-PCR检测表明, VEGF164基因在绒山羊脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺组织中均有表达。
关键词:
内蒙古白绒山羊
血管内皮生长因子
基因克隆
表达模式
C loning and Characterization of VEGF164 Gene cDNA and Analysis of
Its Tissue-specific Expression in InnerM ongolia Cashmere Goat
BaoW enle i
Yang J iaofu
L iB in
L iu June
W ang X iao
Guo Xudong
W ang Zhigang
Hou X in
L iu Dong jun
(K ey Laboratory of M ammalR eproductive Biology and Biotechnology, M inistry of Education,
Co llege of Lif e Sciences, InnerM ongolia University,H ohhot 010021)


Abstrac:t
The present study aim s a t c lon ing the CDS fragm ent ofVEGF164 gene cDNA in Inne rM ongo liaC ashm ere Goat and an-
a lyzing its tissue- spec ific expression. VEGF164 gene cDNA w as c loned by RT-PCR. The nucleotide sequence w as ana lyzed by BLAST
wh ile am ino ac id sequencew as analyzed by online softw ares SMART and Psite. The tissue- spec ific expression pa ttern o fVEGF164 w as
analyzed by sem -i quantitative RT-PCR. The c loned VEGF164 gene cDNA w as 573 bp in leng th, inc lud ing a com plete ORF encod ing
190 am ino acids. The am ino acid sequence shares 99% identity w ith theOvis aries VEGF164 ( EU857623
1). Analysis w ith SMART
suggested that the encoded pro te in con tained a signal peptide and a P late le t-der ived and vascu la r endo the lia l grow th factors ( PDGF,
VEGF) fam ily dom a in. Analysis w ith P site indicated a P rote in k inase C phosphory la tion site and fou rC ase in k inase II phospho ry la tion
sites in th is pro tein. Ana lysis w ith P ro tCom p Ve rs ion 9
0 suggested th is prote in to be ex tracellular ( secreted). VEGF164 gene w as
shown to express in bra in, hea rt, testis, pancreas, sp leen, kidney and lung.
Key words:
InnerMongo lia cashm ere goa t
Vascular endothelia l g row th facto r
Gene c loning
T issue-spec ific expression pa ttern
收稿日期: 2010-06-24
基金项目:转基因生物新品种培育重大专项课题研究计划 ( 2008ZX08008-002 )
作者简介:鲍文蕾,女,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学; E-m ai:l bw lnhm@ s ina. com
通讯作者:侯鑫,男,副教授,研究方向:生物化学与分子生物学; E-m ai:l houxin2005@ hotm ai.l com
内蒙古白绒山羊是经过长期自然选育形成的优
良地方性绒肉兼用型品种,所产羊绒具有径细绒长、
综合品质优良的特点,但由于近年来草场退化,种群
数量增加,舍饲比例加大,导致产绒量降低。通过转
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
基因技术导入促进毛囊发育和绒毛生长的功能基
因,培育高产绒量新品系是解决这一问题的有效
手段。
血管内皮细胞生长因子 ( vascu lar endothelial
cell grow th factor, VEGF)也称为血管渗透因子 ( vas-
cular perm eab ility factor, VPF)
[ 1- 3 ]
,对血管的发生和
生长具有重要的作用 [ 4]。过表达 VEGF转基因小鼠
导致血管化作用加强 [ 5]。
近年发现, VEGF与动物毛发生长关系密切,可
以通过调节血管的发生控制毛发的生长和毛囊的大
小 [ 6]。它是毛乳头细胞的一种自分泌生长因子,在
人初级毛囊中有表达, 在外分泌汗腺的囊泡基底膜
中的表达量也较丰富 [ 7]。体外培养的鼠触须毛乳
头细胞中加入不同浓度的 VEGF, 可以明显促进毛
乳头细胞的增殖和迁移 [ 8]。转基因小鼠研究结果
表明 VEGF 可以促进毛发生长 [ 9]。目前, 关于
VEGF促进毛发生长的功能在人和小鼠研究较多,
尚未见与绒山羊相关的研究报道。
本研究基于 VEGF的生物活性特点,克隆内蒙古
白绒山羊 VEGF164基因,并确定该基因的基本表达
模式,为构建毛囊特异性表达载体, 进而通过转基因
克隆技术获得高产绒量绒山羊新品系提供条件。
1
材料与方法
1
1
相关载体及试剂
RNA提取试剂盒 ( TaKaRa RNA iso Reagent)、
PrimeScript
TM
RT-PCR K it、pMD19-T载体、PrimeSTAR
HS DNA Po lymerase、Taq Po lym erase、质粒提取试剂
盒、胶回收试剂盒、限制性内切酶 E coR
、H ind
、
DNA M arker购自大连 T aK aRa公司。DMEM /F12
培养基、PBS为 G ibco产品。胰蛋白酶 ( T rypsin)、标
准胎牛血清 ( Feta l bov ine serum, FBS)为 S igm a产
品,大肠杆菌 DH5
感受态细胞为本实验室保存的。
其余试剂均为国产分析纯。
1
2
动物组织及细胞培养
内蒙古白绒山羊的脑、心脏、睾丸、胰腺、肝、脾、
肾和肺等组织采自内蒙古白绒山羊种羊场屠宰后的
羊体, 现场采集后立即放入液氮冷冻,带回实验室置
- 80
保存。40 d胎儿现场采集带回实验室后经
原代培养纯化胎儿成纤维细胞, 于液氮中保存。继
代培养采用单层培养子代细胞。所用培养基为含有
10% FBS的 DMEM /F12, 37
、5% CO 2、饱和湿度条
件下培养。
1
3
总 RNA的提取及反转录
按总 RNA提取试剂盒 ( RNA iso Reagent)说明书
的操作方法分别提取内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细
胞及脑、心脏、睾丸、胰腺、肝、脾、肾和肺组织总 RNA,
琼脂糖凝胶电泳验证 RNA完整性,用 O ligo d( T ) 20
Primers按照反转录酶 AMV说明书的方法反转录合
成 cDNA第一链。以胎儿成纤维细胞提取的总 RNA
合成的 cDNA( cDNA1)作为 PCR扩增 VEGF164编码
区片段的模板。RT-PCR检测分别以相应组织总
RNA反转录合成的 cDNA第一链 ( cDNA2)为模板。
1
4
内蒙古白绒山羊 VEGF164基因的分子克隆
根据 GenBank中绵羊血管 VEGF 基因 mRNA
序列 ( EU857623
1)设计 PCR特异性引物, 上游引
物 P1: 5
-CGGTCGACATGAACTTTCTGCTCTCT-3

(其中 CG为保护碱基, GTCGAC为 Sal
的酶切位
点 )。扩增的下游引物 P2: 5
-AT GCATGCTCAC-
CGCCTCGGCTTGTC-3
( AT 为保护碱基, GCATGC
为 Sph
的酶切位点 )。以反转录合成的 cDNA1为
模板进行 PCR扩增, PCR扩增的反应体系为: 25
L
体系, 5
Prim eSTAR Buffer 5
L; 2
5mmol /L dNTPs
2
L; 10
mo l/L引物 P1、P2各 0. 5
L;模板 cDNA
0. 5
L ; Prim eSTAR DNA聚合酶 0. 25
L; 去离子
水 16
25
L。 PCR的反应程序: 95
预变性 5m in,
95
1 m in, 55
30 s, 72
1 m in, 共 35个循环,
72
延伸 10 m in, 72
Taq Polymerase加尾 30m in。
预期片段长度 573 bp。反应结束后, PCR产物经 1
%琼脂糖凝胶进行电泳, 回收特异性条带。回收产
物与 pMD19-T载体连接, 转化 E. coli DH5
感受态
细胞,蓝白斑筛选, 重组质粒经酶切 ( E coR
、H ind

)鉴定正确后送英潍捷基 (上海 )贸易有限公司公
司测序。
1
5
生物信息学分析
测序得到的内蒙古白绒山羊 VEGF164基因
cDNA序列用 NCB I上的 BLAST进行序列比对 ( h-t
tp: / /www. ncb.i nlm. n ih. gov /BLAST / ), 开放阅读框
( ORF)预测采用 DNA star。理论分子量大小和蛋白
等电点预测采用 Pro tein property calcu lator软件 ( h-t
tp: / /www. basic. North w esttern
edu /b io too ls/ pro-
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鲍文蕾等 :内蒙古白绒山羊 VEGF164基因 cDNA克隆及组织表达特异性分析
teincalc. htm l)。蛋白质结构域分析采用 SMART程
序 ( http: / / smar.t emb.l de / ), 蛋白质功能位点分析
采用 Psite程序 ( http: / /www. so ftberry. com ) , 蛋白
质亚细胞定位采用 Pro tCompV ersion 9
0程序,进化
树建立使用 CLC软件。
1
6
组织表达半定量 RT-PCR检测
以内蒙古白绒山羊不同组织总 RNA反转录得到
的 cDNA2第一链为模板, 以山羊
-actin编码 cDNA
为内源对照 (引物 P3: 5
-TGGCACCACACCTTCTA-
CAACGAGC-3
; P4: 5
-CGTCCCCAGAGTCCATGA
CAATG-3
)进行 RT-PCR分析。
2
结果与分析
2
1
编码区片段的克隆与序列测定
用引物 P1、P2以 cDNA1为模板扩增得到与预期
片段大小相符的特异性片段 (图 1)。回收的 PCR产物
与 pMD19-T连接成的重组质粒 pMD19T-VEGF164经
酶切鉴定正确 (图 2)。序列测定结果表明, 扩增出的
cDNA片段长 573 bp,包含了全部的 ORF。
2
2
VEGF164基因序列分析及同源性比较
测序得到内蒙古白绒山羊 VEGF164基因 cDNA
核苷酸序列中 G + C 含量为 51
1% (图 3)。与人
(AF486837
1)、猕猴 ( XM _001089925
1)、犬属 (NM _001
110502
1)、小鼠 ( BC061468
1)、马 (AB053350
1)野猪
(AF318502
1)、牛 (AB450824
1)、绵羊 (EU857623
1)的
VEGF基因的碱基序列同源性分别为 94%、94%、94%、
90%、95%、95%、98%和 99%。相应的氨基酸序列同源
性分别为 94%、94%、94%、90%、95%、95%、98% 和
99%。与 14种脊椎动物的 VEGF基因根据基因间核苷
酸序列的同源性建立进化树 (图 4),表明内蒙古白绒山
羊与绵羊的亲缘关系最近。
2
3
编码蛋白分析
内蒙古白绒山羊 VEGF164基因最大 ORF编码
一个由 190个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白理
论分子质量 22
3 kD,等电点 ( pI) 8
02, 氨基酸组成
中 G lu、Cys含量最高,为 16%。 SMART分析表明
该蛋白质 1 - 26氨基酸位形成信号肽结构域,
49- 131氨基酸位为血小板衍生和血管内皮生长
因子家族 ( PDGF, VEGF)结构域, 128- 172氨基酸
为表皮生长因子相似结构域, 该结构域包含一些
保守的半胱氨酸残基, 对蛋白的三级结构形成非
常重要 (图 5)。Psite分析表明在 100- 103氨基酸位
有一个蛋白激酶 C磷酸化位点, 146- 184氨基酸位有 4
个酪蛋白激酶磷酸化位点, 56- 59氨基酸位有 1个 N-
豆蔻酰化位点, 83- 88氨基酸位有 1个微体 C端靶信
号, 171- 173氨基酸位有 1个血小板衍生的生长因子
家族 ( PDGF, VEGF)标签 (图 6)。ProtCompVersion 9
0
将其定位于细胞外 (分泌 )。
1.绒山羊 VEGF164 PCR产物; M. DL2000 m arker
图 1
VEGF164 PCR产物电泳检测
M1.
-E cot14 I m arker; 1. pMD19-T-VEGF164 E coR I单酶
切; 2. pMD19-T-VEGF164 E coR I + H ind
双酶切; M 2.
DL2000 m arker
图 2
pMD19-T-VEGF164酶切鉴定电泳检测
2
4
组织表达特异性分析
组织半定量 RT-PCR分析 (图 7)表明, VEGF164
基因在脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺中都有表达,
其中在睾丸、胰腺和肺中表达量相对较高, 在脑、心
脏和肾中相对较低。
3
讨论
人的 VEGF-A基因定位于第六对染色体长臂,该
基因包含 8个外显子和 7内含子 [ 10]。由于基因转录水
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平剪切方式不同,在人中至少发现 7种剪接变体,分别
为 VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGFI83、
VEGFI89和 VEGF206[ 11- 14]。其中 VEGF165不但可以
分泌到细胞外,而且可以与肝素结合 [ 15],是研究最多的
一种剪接变体。我们克隆的内蒙古白绒山羊 VEGF164
基因通过 B last比对与人 VEGF165基因编码的蛋白特
性极为接近。人 VEGF165基因编码 191个氨基酸,
其中 N端的 26个氨基酸是信号肽序列, 内蒙古白
绒山羊的 VEGF164基因编码的 190个氨基酸中 N
端的 26个氨基酸与人的完全相同,证明内蒙古白绒
山羊的 VEGF164编码的氨基酸具有信号肽序列, 该
序列与其分泌功能有关。去掉信号肽序列后的活性
蛋白包含 164个氨基酸残基, 应该是人 VEGF165的
同源物,故命名为 VEGF164。
图 3
内蒙古白绒山羊 VEGF164基因 cDNA 核苷酸序列及预测蛋白序列
图 4
根据 VEGF164基因 cDNA序列推测内蒙古白绒山羊与其他脊椎动物的亲缘关系
图 5
SMART分析 VEGF164的 190个氨基酸包括的结构域
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下划线标记蛋白激酶 C磷酸化位点的氨基酸 ( NITM ) ;黑色底纹标记酪蛋白激酶磷酸化位点的氨基酸 ( SER, TCK, SCK, TCR) ;方框标
记 N-豆蔻酰化位点的氨基酸 ( TLVD) ;灰色底纹标记微体 C端靶信号位点的氨基酸 ( GGCCND) ;粗体标记血小板衍生的生长因子家
族标签的氨基酸 ( CKA )
图 6
内蒙古白绒山羊 VEGF164氨基酸序列与绵羊 ( 443103)、牛 ( 281572)、人 ( 7422)、小鼠 ( 22339)的
氨基酸序列比较及 P site活性位点分析
A.各个组织中 VEGF164及
-act in的电泳对比图; B. B and
L eader Ver. 300软件量化后的比较; 1.脑; 2.心脏; 3. 睾丸;
4.胰腺; 5.脾; 6.肾; 7.肺

图 7
内蒙古白绒山羊 VEGF164基因在不同组织中的
mRNA丰度
血管内皮生长因子是血管内皮生长因子家族成
员,也属于血小板衍生生长因子 ( PDGF)家族 [ 16 ]。
SMART分析表明内蒙古白绒山羊 VEGF164基因编
码的蛋白也有血小板衍生和血管内皮生长因子家族
( PDGF, VEGF)结构域。
动物毛囊的发育和周期性变化受一系列诱导因
子和信号的控制,目前国内外的研究主要集中在一
些内分泌激素上, 血管内皮生长因子 ( VEGF)是研
究的焦点之一 [ 17, 18]。VEGF及其受体仅在生长期毛
囊 (主要在外毛根鞘、毛母质和毛乳头 )表达, 进入
退行期后逐渐降低, 在休止期则基本消失 [ 19]。将
6- 8周小鼠的背部脱毛后,灌饲或注射 VEGF质粒
后, 生长期毛囊的数量明显增加, 显著促进毛发的生
长 [ 20- 22]。克隆得到的内蒙古白绒山羊 VEGF164基
因将为 VEGF在绒山羊毛囊发育和绒毛生长中的作
用机制研究提供条件。
4
结论
克隆的内蒙古白绒山羊 VEGF164基因 cDNA
序列为 573 bp, 包含了全长 ORF。VEGF在脑、心
脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺组织中均有表达。
VEGF164基因的克隆为下一步作为促进绒毛生长
的功能基因通过转基因克隆技术建立高产绒量内蒙
古白绒山羊新品系提供了条件。
参 考 文 献
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(责任编辑
李楠 )
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