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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-09-19
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目（30860191, 31160469）
作者简介 : 宝梅英 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 分子细胞生物学 ; E-mail: baomeiying1984@126.com
通讯作者 : 王志钢 , 男 , 教授 , 研究方向 : 哺乳动物生殖生物学与生物技术 ; E-mail: lswzg@imu.edu.cn
内蒙古白绒山羊 IGF-IR基因 cDNA克隆及
组织表达特异性分析
宝梅英1 赵荷雅1 杨娇馥1 鲍文蕾1 李彬1 杨军2 侯鑫1 王志钢1
（1内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021 ；2内蒙古呼和浩特市环境科学研究所，呼和浩特 010030）
摘 要： 旨在克隆内蒙古白绒山羊 IGF-IR基因并分析其基本表达模式。采用 RT-PCR克隆基因，将得到的 IGF-IR基因
cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。半定量 RT-PCR进行组织特异性表达检测。获得了内蒙古白
绒山羊 IGF-IR基因3端编码区2 118 bp的cDNA序列 （JN200823） ， 编码705个氨基酸残基。核苷酸序列与牛的 IGF-IR （XM606794.3）
基因同源性为 98%，相应的氨基酸序列同源性为 99%。SMART分析表明，推导出的编码蛋白具有跨膜域，酪氨酸激酶催化域。半
定量 RT-PCR检测表明，IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达。
关键词： 内蒙古白绒山羊 IGF-IR 组织特异性表达
Cloning and Tissue-specific Expression Pattern of IGF-IR Gene cDNA in
Inner Mongolia Cashmere Goat
Bao Meiying1 Zhao Heya1 Yang Jiaofu1 Bao Wenlei1 Li Bin1 Yang Jun2 Hou Xin1 Wang Zhigang1
（1College of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021；2Hohhot Institute of Environmental Science, Hohhot 010030）
Abstract: The present study aims at cloning the code sequence fragment of IGF-IR gene cDNA from Inner Mongolia cashmere goat and
analyzing its tissue-specific expression pattern. IGF-IR gene cDNA fragments were cloned by RT-PCR. The nucleotide sequence was analyzed
by BLAST while amino acid sequence was analyzed by online soft wares SMART. The tissue-specific expression pattern of IGF-IR gene was
analyzed by semi-quantitative RT-PCR. The cloned 3 terminal 2 118 bp IGF-IR gene cDNA （JN200823） from Inner Mongolia Cashmere goat
was a part of coding region, encoding 705 amino acid residues. The nucleotide sequence shares 98% identity with Bos tuarus IGF-IR gene
（XM606794.3） and the amino acid sequence shares 99% identity. Analysis with SMART suggested that the deduced encoding protein contained
a transmembrance domain and a TyrKc domain. The IGF-IR gene was shown to express in brain, pancreas, liver and kidney.
Key words: Inner Mongolia cashmere goat IGF-IR Tissue-specific expression
胰岛素样生长因子I受体 （insulin-like growth fac-
tor I receptor, IGF-IR）是胰岛素样生长因子家族（insu
lin-like growth factors system, IGFs）的一个重要成员，
该家族由一个与哺乳动物的生长，发育、代谢以及
细胞增殖，存活，迁移和分化相关的多肽类组成，
包括 3 个配体（IGF-I、IGF-Ⅱ和胰岛素）及其细胞
表面的受体， 6 个高亲和力结合蛋白（IGFBP-1 至
IGFBP-6）和它们的蛋白酶［1, 2］。IGFs 广泛存在于多
种体液中，如脑脊液、尿液、唾液、乳汁、羊水等，
对机体组织细胞的生长发育具有广泛而重要的调节
作用。
IGF-IR 是一种跨膜酪氨酸蛋白激酶受体，由胞
外的 2α 亚单位和跨膜的 2β 亚单位构成四聚体，2α
亚单位和 2β 亚单位通过共价键连接。胞外的 2α 亚
单位包含 IGF 结合位点，2β 亚单位细胞内区域有
酪氨酸激酶结构域［3, 4］。结合配体后，受体的酪氨
酸蛋白激酶活性被激活，随机引起一系列磷酸化级
联反应，最终导致细胞生理和 / 或基因表达的改变。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期104
激活的 IGF-IR 具有促进细胞生长及阻滞凋亡的功
能。IGF-IR 在小鼠胚胎发育中起着重要作用［5］，敲
除 IGF-IR（-/-）的小鼠显示出严重的生长阻滞［6］。
近期的研究表明，IGF-IR 具有调节细胞黏附和迁移
及诱导细胞分化的功能［7］。随着对 IGF-IR 研究的
深入，显示 IGF-IR 在正常生理调节中的作用是十分
重要和复杂的。IGF-IR 基因及其编码的蛋白在人及
一些动物中已得到深入的研究，但迄今尚未有山羊
IGF-IR 基因研究的报道。
内蒙古白绒山羊是内蒙古西部半荒漠地区的优
良生产品种，但对营养物质在其生长发育和代谢中
的作用机制尚不清楚。对 IGF-IR 基因的核苷酸组成
和特性的研究不仅可以建立绒山羊遗传信息库，区
别物种间的遗传差别和进化特征，而且可为动物个
体发育过程中基因表达和代谢调控研究提供良好的
模式，将对优良绒山羊品系的保存和提高其生产性
能具有重要意义。本研究试图建立有效的克隆内蒙
古白绒山羊 IGF-IR 基因的 RT-PCR 体系及检测该基
因在绒山羊不同组织中表达情况的半定量 RT-PCR
体系，旨在获得绒山羊 IGF-IR 基因编码区 cDNA 序
列及表达模式数据。
1 材料与方法
1.1 材料
总 RNA 抽提试剂盒（RNAiso Reagent）、克隆载
体 pMD19-T、反转录酶 AMV、PrimeSTAR Taq DNA
聚合酶、普通 Taq DNA 聚合酶，限制性内切酶 EcoR
I 和 Hind III、EcoR I 和 Sal I 、dNTP、Oligo d（T）18
Primers、DNA Marker 等均购自宝生物工程（大连）
有限公司 ；琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（AxyPrep
DNA Gel Extraction Kit）购自 AXYGEN 生物技术（杭
州）有限公司。大肠杆菌 DH5α 由本实验室保存，
其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 动物组织及细胞培养 内蒙古白绒山羊的脑、
胰腺、肝及肾等组织采自内蒙古白绒山羊种羊场屠
宰后的羊体，现场采集后立即放入液氮冷冻，带回
实验室置 -80℃保存。绒山羊胎儿成纤维细胞培养采
用单层培养子代细胞，所用培养基为含有 10% FBS
的 DMEM/F12，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
1.2.2 总 RNA 的提取及反转录合成 cDNA 第一链
按总 RNA 提取试剂盒（RNAiso Reagent）说明书的
操作方法分别提取内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞
及脑、胰腺、肝、肾组织总 RNA，琼脂糖凝胶电泳
验证 RNA 完整性，用 Oligo d（T）20 Primers 按照反
转录酶 AMV 说明书的方法反转录合成 cDNA 第一
链。以胎儿成纤维细胞提取的总 RNA 合成的 cDNA
（cDNA1）作为 PCR 扩增 IGF-IR 编码区片段的模板。
半定量 RT-PCR 检测分别以相应组织总 RNA 反转录
合成的 cDNA 第一链（cDNA2）为模板。cDNA 第一
链的合成按照反转录酶 AMV 说明书进行。
1.2.3 内蒙古白绒山羊 IGF-IR 基因的分子克隆 由
于没有山羊 IGF-IR 基因的核苷酸序列，参考 Gen-
Bank 中公布的牛（XM_606794.3）、马（XM_001489-
765.1）、人（NM_000875.3）、小鼠（NM_010513.2）
及大鼠（NM_052807.1）的 IGF-IR 基因 cDNA 编码
区序列，通过 CLC Sequence Viewer 6 软件比对，找
出其同源保守区作为引物设计序列，以牛的 IGF-
IR 基因 cDNA 编码区全序列为基准，利用 Primer
Premier 5.0 软件设计简并引物，分段克隆绒山羊
IGF-IR 基 因。863 bp 片 段 的 上 游 引 物 序 列 P1 ：
5-CTGCTCCAAAGACAAAATMC-3 20 mer，下游引
物 序 列 P2 ：5-CTCCCACTATCAACAGAACC-3 20
mer，M 表示 C/A 兼并碱基 ；1 255 bp 片段上游引
物 P3: 5-CGCTCTGCCCATTGCGGTTC-3 20 mer ；下
游 引 物 P4: 5-TCAGCAGGTSGAYGACTGGGG-3 21
mer，S 和 Y 分别表示 G/C 和 C/T 兼并碱基，引物由
上海生工生物技术有限公司合成。以反转录合成的
cDNA1 为模板进行 PCR 扩增，863 bp 片段的反应体
系 ：PrimeSTAR Taq（2.5 U/μL）0.5 μL，5×PS buffer
（Mg2+ plus）5 μL，dNTP（各 10 mmol/L）2 μL，模板
cDNA 1 μL，P1（10 μmol/L）1 μL，P2（10 μmol/L）
1 μL，无菌蒸馏水 14.5 μL。总体系为 25 μL。PCR
扩增程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 1 min，48℃ 2 min，
72℃ 3 min，35 个 循 环 ；72℃ 10 min ；普 通 Taq
酶 72℃ 30 min 加尾。1 255 bp 片段的反应体系 ：
PrimeSTAR Taq（2.5 U/μL）0.5 μL，5×PS buffer
（Mg2+plus ）5 μL，dNTP（各 10 mmol/L）2 μL，模板
cDNA 1 μL，P3（10 μmol/L）1 μL，P4（10 μmol/L）
1 μL，无菌蒸馏水 14.5 μL。总体系为 25 μL。PCR
2012年第4期 105宝梅英等 ：内蒙古白绒山羊 IGF-IR 基因 cDNA 克隆及组织表达特异性分析
扩增程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 1 min，62℃ 2 min，
72℃ 3 min，35 个循环 ；72℃ 10 min ；普通 Taq酶
72℃ 30 min 加尾。PCR 反应产物经 1% 琼脂糖凝胶
电泳后用 AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit 50-prep 回
收，与 pMD19-T 连接，转化感受态大肠杆菌 DH5α，
接种于含 Amp+ 的 LB 培养基，37℃过夜培养筛选重
组菌落，提取质粒。重组质粒经 PCR 和酶切鉴定正
确后送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.4 生物信息学方法 IGF-IR 基因 cDNA 序列
用 NCBI 上 的 BLAST 进 行 序 列 比 对（http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），蛋白质结构域分析采用
SMART 程序（http://smart.embl.de/），进化树建立使
用 MEGA4.1 软件。
1.2.5 组织特异性表达检测 收集内蒙古白绒山羊
脑、肾、肝及胰腺组织材料，提取总 RNA，以反转
录得到的 cDNA 第一链为模板（cDNA2），P1 和 P2 为
引物扩增 IGF-IR 基因，预期片段长度 863 bp。以山
羊 β-actin 为内源对照，引物 P5：5-TGGCACCACAC-
CTTCTACAACGAGC-3 25 mer ；P6 ：5-CGTCCCC-
AGAGTCCATGACAATG-3 23 mer，预期片段长度
229 bp。半定量 RT-PCR 检测 IGF-IR 基因在不同组
织中的 mRNA 丰度。使用 Quantity One v4.62 凝胶定
量分析软件量化条带灰度。
2 结果
2.1 编码区cDNA片段的克隆与序列测定
以 P1、P2 为引物，cDNA1 为模板扩增得到
863 bp 的片段（IGF-IR-1）；以 P3、P4 为引物扩增
得到 1 255 bp 的片段（IGF-IR-2），扩增产物与预期
片段大小相符（图 1）。回收的 PCR 产物与 pMD19-T
连接成的重组质粒经酶切鉴定正确后测序。将测
序后的两个片段的核苷酸序列拼接得到 2 118 bp 的
cDNA 序列（JN200823），是 IGF-IR 基因编码区的部
分序列。
M. DL2000 Marker; 1. 863 bp 的 PCR 产物 ; 2. 1 255 bp 的 PCR 产物
图 1 内蒙古绒山羊 IGF-IR基因 PCR产物电泳检测
图 2 根据基因的氨基酸序列推测内蒙古白绒山羊与其他脊椎动物的亲缘关系
2.2 IGF-IR基因序列分析及同源性比较
测序得到的内蒙古白绒山羊 IGF-IR 基因编码区
3端终止密码子前 2 118 bp 的 cDNA 核苷酸序列与
牛（XM606794.3）、人（NM000875.3）、犬（XM853347.1）
和小鼠（NM010513.2）的 IGF-IR 基因的碱基序列同
源性分别为 98%、90%、90% 和 88%，相应的氨基
酸序列同源性分别为 99%、97%、97% 和 96%。与
9 种脊椎动物的 IGF-IR 基因根据基因间核苷酸序列
的同源性建立进化树（图 2），表明内蒙古白绒山羊
与牛的亲缘关系最近。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期106
2.3 编码蛋白分析
根据获得的内蒙古白绒山羊 IGF-IR 基因部分编
码区序列核苷酸序列，推导出编码 705 个氨基酸残
基组成的蛋白，该蛋白氨基酸组成中 Glu 含量最高，
为 10.2%。SMART 分析（图 3）表明，该蛋白质第
274-296 位氨基酸为跨膜域，第 337-604 位氨基酸
为酪氨酸激酶催化域，该结构域是磷酸转移酶类、
酪氨酸特异性激酶家族结构域。
期中，一旦细胞进入 G1 期，在其他生长因子缺乏
的情况下，IGF-I 可促使细胞增殖周期完成［8］。而
IGF-I 的活性主要是由 IGF-IR 介导的，IGF-IR 在很
大程度上决定了细胞增殖状况，IGF-IR 可促进有丝
分裂的发生［9］。IGF-IR 作为细胞生存和增殖因子，
在正常个体发育的各个阶段，包括卵母细胞阶段及
各个器官的发育中起了关键作用［10］，在体外培养的
细胞中及体内均有阻止细胞凋亡的作用［11］，而且细
胞表面表达 IGF-IR 的数量越高，细胞生存率越高［12］。
IGF-IR 在正常的细胞增殖、凋亡、机体生长发育中
起了关键作用，这些都说明了 IGF-IR 的重要性。
试验得到的内蒙古白绒山羊 IGF-IR 基因 cDNA
核苷酸序列和推导的氨基酸序列经 NCBI Blast 序列
比对，与已报道的牛、马、人及小鼠等物种的 IGF-
IR 基因具有高度的同源性 ；由核苷酸序列推导的编
码蛋白经 SMART 程序预测具有跨膜酪氨酸蛋白激酶
受体家族特征结构域，表明试验建立了有效的 RT-
PCR 体系，绒山羊 IGF-IR 基因被正确克隆。Kuang
等［13］报道在鱼类的胚胎及幼体发育中 IGF-IR 基
因在多个组织中表达，在猪出生后各期也有同样情
况［14］。本研究采用半定量 RT-PCR 检测表明，该基
因在所检测的脑、胰腺、肝和肾组织中均有表达，
表明该基因具有管家基因的特征，与其功能重要性
相符。
内蒙古白绒山羊是珍贵的地方畜种资源之一，
具有与当地自然环境相适应的生物学特性，耐热、
耐旱、耐粗饲，比绵羊、牛更能有效利用山地牧场
和贫脊草原，具有重要的经济价值。近年来由于草
场退化，种群数量增加，舍饲比例加大，导致其生
产性能降低，这其中肌体对营养和能量信号刺激的
敏感性起着重要的作用，但机制尚不清楚。IGF-IR
是细胞生长的重要调节因子，在动物胚胎发育及个
体生长中起着重要的作用。对 IGF-IR 基因的研究不
仅可以区别物种间的遗传差异和进化特征，而且对
动物胚胎发育与个体生长过程中对营养与代谢机制
研究具有重要意义。
4 结论
内蒙古白绒山羊 IGF-IR 基因 cDNA 编码区 3
端核苷酸序列为 2 118 bp，编码 705 个氨基酸残基。
图 3 SMART分析 IGF-IR的结构域及氨基酸位置
2.4 组织表达特异性分析
采用半定量 RT-PCR 方法测定内蒙古白绒山羊
的脑、胰腺、肝及肾组织中的 IGF-IR mRNA 丰度，
以 β-actin 为内标标准化 IGF-IR 基因转录水平。结果
（图 4）显示，IGF-IR 基因在检测的 4 种组织中均有
表达，其中在肾中表达量较高，胰腺、脑和肝中相
对较低。
A. 半定量 RT-PCR 检测 IGF-IR 基因在不同组织中的表达 ；
B. 用 β-actin 标准化后的 IGF-IR 基因转录水平
图 4 内蒙古白绒山羊 IGF-IR基因在
不同组织中的 mRNA丰度
3 讨论
IGF-I 是一个重要的细胞增殖因子，在细胞周
2012年第4期 107宝梅英等 ：内蒙古白绒山羊 IGF-IR 基因 cDNA 克隆及组织表达特异性分析
核苷酸序列与已报道哺乳动物 IGF-IR 基因核苷酸
序列同源性在 88%-98% 之间。IGF-IR 基因在内蒙
古白绒山羊的脑、胰腺、肝及肾组织中均有表达，
mRNA 丰度在肾组织中较高。
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（责任编辑 马鑫）