全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
构建 LEF1 基因毛囊特异表达载体并稳定
转染胎儿成纤维细胞
李彬 鲍文蕾 张涛 侯鑫 郭旭东 王潇 王志钢 刘东军
(内蒙古大学生命科学学院 哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特 010021)
摘 要: 旨在构建内蒙古白绒山羊(Capra hircus)淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor，LEF1)基因真核表达载
体并转染胎儿成纤维细胞，获得稳定表达红色荧光蛋白及毛囊特异性表达 LEF1 的转基因细胞克隆。以 pCDsRed2 载体为基
本骨架将 LEF1 基因亚克隆到 KAP6-1 启动子下游，连接红色荧光蛋白表达元件，构建 LEF1 基因毛囊特异表达载体 pCDsRed-
KL。外源表达载体以 lipofectamineTM2000 介导转染胎儿成纤维细胞，通过 G418 筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR 鉴定外
源基因在细胞基因组中的整合。测序显示构建的表达载体 pCDsRed-KL序列中，LEF1 基因正确连接在 KAP6-1 启动子下游，
顺序连接 CMV启动子和红色荧光蛋白基因，载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为 14． 0%，经 G418 筛选得到高效
表达红色荧光蛋白转基因细胞克隆。PCR检测显示外源 KAP6-1 启动子和 LEF1 基因整合到胎儿成纤维细胞基因组中。
关键词: 内蒙古白绒山羊 淋巴样增强因子-1 毛囊特异性表达载体 稳定转染
Construction of Hair Follicle Specific Expression Vector of LEF1 Gene and
Its Transfection into Caprine Fetal Fibroblasts Cells Stably
Li Bin Bao Wenlei Zhang Tao Hou Xin Guo Xudong Wang Xiao Wang Zhigang Liu Dongjun
(The Key Laboratory of Mammal Reproductive Biology and Biotechnology，
Ministry of Education，College of Life Science，Inner Mongolia University，Huhhot 010021)
Abstract: The present study aims at constructing a eukaryotic expression vector pCDsRed2-KL of LEF1(Lymphoid enhancer fac-
tor 1)gene and then to transfer it into Inner Mongolia goat(Capra hircus)fetal fibroblast(GFb)cells to obtain a transgenic cell line，
which stable expresses red fluorescence and hair follicle specific expresses LEF1． The vector pCDsRed-KL was constructed by connect-
ing the LEF1 gene with KAP6-1 promoter and inserting the KAP6-1 promoter-LEF1 fragment into the basic vector pDsRed2，which con-
tains a DsRed expression unit． The GFb cells were transfected with the expression vector by lipofectamineTM2000． Cell clones stably ex-
pressing red florescence was obtained after screening by G418． The sequencing result showed the LEF1 gene was connected properly to
the downstream of pKAP6-1，then the CMV promoter and the DsRed2 gene in sequence． Identification of the transgene in the cell clones
was examined by PCR and the exogenous DNA(pKAP6-1 and LEF1 gene)has been integrated into genome． The stably transfected cell
line can express the red fluorescence efficiently． The stable transfection efficiency is about 14% ．
Key words: Inner Mongolia cashmere goat Lymphoid enhancer factor 1 Follicle specific expression vector Stable transfec-
tion
收稿日期:2010-07-28
基金项目:转基因生物新品种培育重大专项课题研究计划(2008ZX08008-002)
作者简介:李彬，男，硕士研究生，研究方向:生物化学与分子生物学;E-mail:lb19870620@ 163． com
通讯作者:王志钢，男，教授，研究方向:哺乳动物生殖生物学与生物技术;E-mail:lswzg@ imu． edu． cn
淋巴样增强因子-1(lymphoid enhancer factor，
LEF1)是淋巴增强因子 /T-细胞因子(LEF /TCF)家
族的成员之一，属于高迁移率组分(high mobility
group，HMG) ，相对分子量为 44 kD［1，2］。LEF1 作为
转录因子可以与 β-catenin 结合激活下游靶基因转
录［3］。LEF1 广泛分布于各种组织、器官和细胞中，
在胚胎发育及成熟个体组织的自我平衡和自我更新
过程中发挥重要的作用［4］，具有多种生物学功能。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
毛囊是皮肤基本的结构单位之一，毛囊能够通
过其周期性生长来维持其自我更新。在毛囊的 Bu-
gle区存在毛囊干细胞，具有很强的增殖能力及多向
分化潜能，能够分化成为毛囊、表皮及皮脂腺［5，6］。
研究表明，在激活 Bulge 毛囊干细胞向毛囊定向分
化过程中 Wnt 信号通路起着关键作用，LEF1 可以
介导来自于Wnt通路的信号刺激，结合 β-catenin促
进毛囊特异性角蛋白基因的表达进而促进毛囊发
育［7 － 9］。研究报道 LEF1 突变的小鼠仅有少量的毛
囊形成［10］，而转基因过表达 LEF1 则促进大量新生
毛囊形成［11］。LEF1 在毛囊发育和毛发生长中可能
起着关键的作用。
本研究基于 LEF1的生物活性特点，构建毛囊特
异性表达 LEF1 和稳定表达红色荧光蛋白标记的载
体，转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞，筛选稳定
表达红色荧光蛋白的转基因细胞克隆，为通过核移植
和克隆技术获得高产绒量转基因绒山羊提供条件。
1 材料与方法
1． 1 相关质粒
以 pDsRed2-1 为框架，在 DsRed2 基因上游加
入 CMV启动子的质粒载体 pCDsRed2-1［12］;含有绒
山羊 LEF1 基因的 pMD19-TL;含有绒山羊 VEGF164
基因的 pMD19-TV 和含有 KAP6-1 启动子的
pMD19-TK［13］。以上质粒均为本实验室保存。
1． 2 相关试剂
LA Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、常用限制
性内切酶、DNA 分子量标准 DL2000、DNA分子量标
准 λ-EcoT14 Ⅰ digest、Universal Genomic DNA Ex-
traction Kit Ver． 3． 0 等购自宝生物工程(大连)有限
公司(TaKaRa) ;质粒提取试剂盒 AxyPrepTM Plasmid
Miniprep Kit、DNA 琼 脂 糖 凝 胶 回 收 试 剂 盒
AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 等购自爱思进生
物技术(杭州)有限公司;DMEM/F12 培养基、D-
PBS(geneticin sulphate)为 Gibco 产品;标准胎牛血
清(fetal bovine serum，FBS)为 Sigma 产品;G418 为
Hyclone 产品;去内毒素质粒中量提取试剂盒
(PureYieldTM Plasmid Midiprep System，#A2492)购自
Promega公司;脂质体 LipofectamineTM 2000(以下简
称 lipo2000，Cat． No． 11668-019)购自 Invitrigen 公
司。其余试剂均为国产分析纯。
1． 3 细胞系及培养条件
内蒙古白绒山羊(Capra hircus)原代胎儿成纤
维细胞为本实验室保存，所用培养基为含有 10%
FBS的 DMEM/F12，在 37℃、5%CO2、饱和湿度条件
下培养。
1． 4 中间载体 pMD19T-KL的构建
用 Hind Ⅲ 和 Pst Ⅰ 分别对 pMD19-TL 和
pMD19-TV进行酶切，pMD19-TL 中的 LEF1 基因片
段被切下，pMD19-TV 在多克隆位点处被切开。切
胶回收 LEF1 基因片段和线性化的 pMD19-TV 质粒
片段，纯化后由 T4 DNA 连接酶将 LEF1 基因顺序连
接到 VEGF164基因下游，得到重组质粒 pMD19-TVL。
提取质粒后酶切鉴定重组结果。
用 SalⅠ和 SacⅠ分别对 pMD19-TK 和 pMD19-
TVL进行酶切，pMD19-TK 中的 KAP6-1 启动子被切
下，pMD19-TVL中的 VEGF164基因被切下。切胶回收
KAP6-1启动子和 pMD19-TVL酶切后的质粒大片段，
纯化后由 T4 DNA 连接酶连接，得到重组质粒 pMD19-
TKL。提取质粒后鉴定重组结果，HindⅢ单酶切预期
产生 4． 8 kb 的条带，Hind Ⅲ、XbaⅠ双酶切预期产生
2. 7 kb载体片段和 2． 1 kb的插入片段。
1． 5 毛囊特异性表达载体 pCDsRed-KL的构建
将 pCDsRed2-1 和 pMD19-TKL 分别以 SacⅠ、
Hind Ⅲ双酶切后电泳，切胶回收 pCDsRed2-1 载体
片段和 pMD19T-KL 的 KL 片段，纯化后用 T4 DNA
连接酶连接，构建表达载体 pCDsRed-KL(图 1) ，提
取质粒后进行酶切鉴定，Hind Ⅲ单酶切预期产生
7. 0 kb 的条带，SacⅠ、HindⅢ双酶切预期产生
4． 9 kb和 2． 1 kb 的条带，酶切鉴定正确后进行载体
测序。
图 1 载体 pCDsRed-KL结构图
1． 6 表达载体 pCDsRed-KL 转染绒山羊胎儿成纤
维细胞
扩大培养含有毛囊特异性表达载体 pCDsRed-
KL 的 E． coli DH5α 宿主菌，提取 pCDsRed-KL 质
粒，用紫外分光光度计测定质粒浓度和纯度。
转染前 1 天，以胰蛋白酶消化绒山羊胎儿成纤
241
2011 年第 3 期 李彬等:构建 LEF1 基因毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞
维细胞并计数，按照 6 × 104细胞 /孔密度接种六孔
培养板，用 2 mL 含有抗生素、含 10% FBS DMEM/
F12 培养基培养。转染前 1 h 换为 2 mL 无抗生素、
无 FBS 的 DMEM/F12 培养基。转染时，取 4． 0 μg
质粒 pCDsRed-KL至 1． 5 mL Eppendorf管中，用无血
清、无抗生素 DMEM/F12调整至终体积为 250 μL;另
取 1个 1． 5 mL Eppendorf管中加入 Lipo2000 8 μL，同
样以无血清 DMEM/F12 调整至终体积为 250 μL，混
匀静置 5 min;将上述配好的质粒和 Lipo2000 轻轻混
匀，室温下静置 15 min。将混合物 500 μL 加入六孔
培养板细胞中，摇动培养板混匀，在 37℃、5% CO2、
饱和湿度条件下培养，6 h 后换为含有抗生素、含
10%FBS DMEM/F12 培养基培养，继续培养至 48 h
后观察荧光。
转染细胞培养 48 h 后经胰蛋白酶消化，取少
量消化下的细胞用血球计数板在荧光显微镜和相
差显微镜下观察，统计发红色荧光细胞数和细胞
总数的比值，得到转染效率值。将消化下的细胞接
种于 100 mm培养皿中，待培养 24 h 后更换新鲜的
含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养液，加入终浓度为
800 μg /mL的 G418 开始筛选，隔 1 d换液 1 次，筛选
一周形成大量同时具有新霉素抗性和红色荧光的多
克隆细胞群，换为含有 300 μg /mL G418 维持浓度的
培养液中扩大培养后冻存。
1． 7 转基因绒山羊胎儿成纤维细胞克隆 PCR鉴定
选取扩大培养成功后稳定表达红色荧光的转基
因细胞克隆，提取细胞基因组 DNA 进行 PCR 鉴定。
以预期 pCDsRed-KL序列为模板设计特异性引物 P1:
5-CACACCCACACTGAGAGC-3，P2:5-CGATCTCG-
AACTCGTGGC-3起始和终止位置见图 2。PCR 反应
程序:94℃ 5 min;94℃ 1 min，67． 5℃ 1 min，72℃
2 min，35个循环;72℃ 10 min。预期片段长度 1. 9 kb。
图 2 转基因细胞鉴定用引物在序列中位置示意图
2 结果
2． 1 中间载体 pMD19-TKL 和毛囊特异性表达载
体 pCDsRed-KL的构建
用 Hind Ⅲ 和 Pst Ⅰ 分别对 pMD19-TL 和
pMD19-TV进行酶切后连接，得到重组质粒 pMD19-
TVL。用 Sal Ⅰ 和 Sac Ⅰ 分别对 pMD19-TK 和
pMD19-TVL进行酶切后回收相应片段并连接，得到
重组质粒 pMD19-TKL。经 Hind Ⅲ单酶切和 Hind
Ⅲ、XbaⅠ双酶切鉴定载体构建正确(图 3) ，获得了
中间载体 pMD19-TKL。
M． λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker;1． pMD19T-KL 质粒;
2． pMD19T-KL /HindⅢ单酶切;3． pMD19T-KL /HindⅢ、
XbaⅠ双酶切
图 3 酶切鉴定 pMD19T-KL
pCDsRed2-1 和 pMD19-TKL 分别以 SacⅠ、Hind
Ⅲ双酶切，回收相应载体和基因片段后连接，得到毛
囊特异性表达载体 pCDsRed-KL。经 SacⅠ单酶切和
SacⅠ、HindⅢ双酶切鉴定(图 4)及序列测定，载体构
建正确，完全符合预期要求，获得了重组表达载体。
M． λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker;1． pCDsRed-KL 质;2．
pCDsRed-KL /HindⅢ单酶切;3． pCDsRed-KL /SacⅠ、
HindⅢ双酶切
图 4 酶切鉴定 pCDsRed-KL
2． 2 稳定转染 pCDsRed-KL 绒山羊胎儿成纤维细
胞筛选与鉴定
脂质体介导质粒 pCDsRed-KL 转染细胞 48 h
后观察荧光，转染效率约为 14． 0%。G418 连续筛
选两周后培养皿中出现了荧光密集的多克隆细胞群
(图 5)。
341
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
A． 相差(200X) ;B．荧光(200X)
图 5 G418 筛选后 2 周后转基因绒山羊胎儿
成纤维细胞多克隆细胞群
2． 3 转基因绒山羊胎儿成纤维细胞的 PCR鉴定
提取表达红色荧光的转基因细胞基因组 DNA，
PCR扩增重组序列片段。扩增结果(图 6)显示，在
预期的 1． 9 kb处检测到一条特异性条带，表明外源
KAP6-1 启动子和 LEF1 基因已经整合到绒山羊胎
儿成纤维细胞基因组中。
M． DL2000 Marker;1． pCDsRed-KL 质粒对照;2．以转基
因细胞基因组 DNA 为模板;3． 以未转染细胞基因组
DNA为模板
图 6 转基因细胞 PCR鉴定
3 讨论与结论
角蛋白关联蛋白(keratin associated proteins，
KAPs)是特异性地组成毛发纤维基质的一种组织特
异性蛋白，是包含许多同类成员的蛋白家族。其中
KAP6 是属于高甘氨酸、酪氨酸角蛋白家族(high
glycine / tyrosine gene family，HGT)。该角蛋白家族
是构成基质中间丝相关蛋白的重要组成成分，占羊
毛总蛋白质的 1% － 12%［14］。早期的绵羊研究结
果表明，KAP6 在毛囊细胞中特异性地表达，而在其
它组织中均不表达［14］。在绒山羊毛囊发育生长期
皮肤中 KAP6 高丰度表达［15］。KAP6 基因表达的这
些特点证明该基因启动子具有毛囊组织特异性。
LEF1 与毛囊发育及自我更新密切相关，但其调
控毛囊发育的机制仍不清楚。研究发现，随着毛囊
发育进程的变化，LEF1 在毛囊中的表达量也在变
化。当毛囊处于生长期时，LEF1 在毛髓质中的表达
强烈，呈现明显的核表达;随着毛囊逐渐向衰退期、
静止期发育，LEF1 的表达会逐渐下降，且逐渐由核
表达转变为细胞质表达［16］。当毛囊开始发育时，
Wnt通路被激活，LEF1 与细胞核内富集的 β-catenin
结合可能会激活与毛囊干细胞更新、增殖、分化有关
的基因表达，从而调控毛囊发育［17 － 19］。
本研究构建的毛囊特异性表达载体 pCDsRed-
KL，由于同时具有红色荧光蛋白 DsRed2 基因和新
霉素抗性 Neor基因作为双选择标记，不仅可以在转
染细胞期通过 Neor筛选出转基因阳性细胞，而且在
核移植时可以根据荧光信号选择稳定转染的细胞作
为核供体，从而为高效利用多克隆转基因细胞提供
了方便条件。
以毛囊特异性启动子 KAP6-1 为前导区，顺序连
接内蒙古白绒山羊 LEF1 基因，构建了具有红色荧光
蛋白和新霉素抗性双选择标记的真核表达载体 pCD-
sRed-KL，稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞，外源基因
整合到细胞基因组中。为进一步利用核移植和克隆
技术培育高产绒量绒山羊新品系提供了条件。
参 考 文 献
［1］Love JJ，Li X，Chung J，et al． The LEF-1 high-mobility group domain
undergoes a disorder-to-order transition upon formation of a complex
with cognate DNA． Biochemistry，2004，43(27) :8725-8734．
［2］Graham TA，Weaver C，Mao F，et al． Crystal structure of a β-cate-
nin /Tcf complex． Cell，2000，103(6) :885-896．
［3］Behrens J，von Kries JP，Kuhl M，et al． Functional interaction of be-
ta-catenin with the transcription factor LEF-1． Nature，1996，382:
638-642．
［4］ Clevers H． Wnt /β-catenin signaling in development and diseases．
Cell，2006，127(3) :469-480．
［5］Cotsarelis G，Sun TT，Lavker RM． Label-retaining cells residein the
bulge area of pilosebaceous unit:implicationsfor follicular stem cells，
hair cycle，and skin carcinogenesis． Cell，1990，61(7) :1329-1337．
［6］Morris RJ，Potten CS． Highly persistent label-retaining cells in the
hair follicles of and their fate following induction of anagen． Invest
Dermatol，1999，112:470-475．
［7］Zhou P，Byrne C，Jacobs J，et al． Lymphoid enhancer factor 1 directs
hair follicle patterning and epithelial cell fate． Genes Dev，1995，9:
441
2011 年第 3 期 李彬等:构建 LEF1 基因毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞
700-713．
［8］Merrill BJ，Gat U，DasGupta R，et al． Tcf3 and Lef1 regulate lineage
differentiation of multipotent stem cells in skin． Genes Dev，2001，
15:1688-1705．
［9］Fuchs E． Scratching the surface of skin development． Nature，2007，
445(7130) :834-842．
［10］van Genderen C，Okamura RM，Farinas I，et al． Development of sev-
eral organs that require inductive epithelial-mesenchymal interac-
tions is impaired in LEF-1-deficient mice． Genes Dev，1994，8:
2691-2703．
［11］Alonso L，Fuchs E． Stem cells in the skin:waste not，Wnt not．
Genes Dev，2003，17:1189-1200．
［12］郭旭东，奥旭东，宝明涛，等． IGF1 毛囊细胞特异表达载体的构
建以及转染绒山羊胎儿成纤维细胞的研究． 畜牧兽医学报，
2009，40(10) :1460-1467．
［13］郭旭东，毛舒燕，宝明涛，等． 绵羊角蛋白关联蛋白 KAP6-1 基
因 5端调控区的分子克隆及测序结果比较． 内蒙古大学学报，
2007，38(1) :292-296．
［14］McLaren RJ，Rogers GR，Davies KP，et al． Linkage mapping of wool
keratin and keratin associated protein genes in sheep． Mammalian
Genome，1997，8(12) :938-940．
［15］尹俊，扈庭茂，李金泉，等． 与绵羊 KAP6-1 相似的 6 个绒山羊
全长 cDNA 的克隆与序列分析． 遗传学报，2004，31(5) :
502-507．
［16］施迎春，张艺，陈伟，等．淋巴增强因子-1 在大鼠触须毛囊生长
周期中的表达．第三军医大学学报，2008，30(1) :43-45．
［17］Widelitz RB． Wnt signaling in skin organogenesis． Organogenesis，
2008，4(2) :123-133．
［18］Andl T，Reddy ST，Gaddapara T，et al． WNT signals are required for
the initiation of hair follicle development． Dev Cell，2002，2(5) :643-
653．
［19］许永安，付小兵．毛囊干细胞增殖与分化相关信号通路研究进
展．中国修复重建外科杂志，2010，24(2) :161-164．
(责任编辑 李楠
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 134 页)
［17］李莉，孙振兴，杨树德，等．用微卫星标记分析皱纹盘鲍群体的
遗传变异．遗传，2006，28(12) :1549-1554．
［18］庄志猛，孔杰，石拓，等．日本对虾野生和养殖群体遗传多样性
的 RAPD分析．自然科学进展，2001，11(3) :250-255．
［19］李健，高天翔，刘广东，等．中国对虾人工选育群体的同工酶分
析．海洋水产研究，2003，24(2) :1-8．
［20］Mulley JC，Latter BDH． Genetic variation and evolutionary relation-
ships within a group of thirteen species of penaeid prawns． Evolu-
tion，1980，34(5) :904-916．
［21］颜标，李思发，蔡完其．尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼及其正反杂交
后代的微卫星分析．水产学报，2007，31(3) :412-415．
［22］钟金城，赵素君，陈智华，等．牦牛品种的遗传多样性及其分类
研究．中国农业科学，2006，39(2) :389-397．
［23］熊小飞，夏军红，苏天凤，等．海南、深圳和北海斑节对虾群体遗
传多样性研究．水利渔业，2008，28(3) :30-38．
［24］姜永杰，周发林，黄建华，等．深圳海域斑节对虾野生种群线粒
体控制区序列的多态性研究．南方水产，2006，2(1) :54-57．
［25］周发林，江世贵，姜永杰，等．海南三亚斑节对虾野生种群 mtD-
NA 16S rRNA基因和控制区序列的多态性． 南方水产，2006，6
(2) :13-18．
［26］李玉龙．中国明对虾和日本囊对虾遗传多样性及对虾科系统学
初步研究［D］．青岛:中国海洋大学，2009:56-71．
(责任编辑 马鑫)
541