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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-08
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30860191）
作者简介 : 傅海霞 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 基因工程 ; E-mail: fuhaixiayx@163.com
通讯作者 : 王志钢 , 男 , 教授 , 研究方向 : 哺乳动物生殖生物学与生物技术 ; E-mail: lswzg@imu.edu.cn
内蒙古白绒山羊 4E-BP1基因 cDNA克隆及
组织表达特异性分析
傅海霞 杨娇馥 梁燕 陈宇浩 王志钢
（内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021）
摘 要： 旨在克隆内蒙古白绒山羊 4E-BP1（真核细胞翻译起始因子 4E结合蛋白 1）基因并进行生物信息学及表达模式分析。
根据已报道物种 4E-BP1基因 cDNA序列，用 primer premier5软件设计引物，通过 RT-PCR从绒山羊胎儿成纤维细胞总 RNA中扩
增出 4E-BP1基因编码区 cDNA序列，对目的片段进行测序及表达模式分析。克隆到的内蒙古白绒山羊 4E-BP1基因 cDNA全长
357 bp，包含了完整的的 ORF，编码 118个氨基酸残基。核酸序列与牛、马、人、大鼠及小鼠的同源性分别为 98%、90%、90%、
88%和 87%。4E-BP1基因在绒山羊脑、心脏、睾丸及胰腺组织中均有表达。
关键词： 内蒙古白绒山羊 4E-BP1 组织特异性表达
Cloning and Tissue-specific Expression Pattern of 4E-BP1 Gene
cDNA in Inner Mongolia Cashmere Goat
Fu Haixia Yang Jiaofu Liang Yan Chen Yuhao Wang Zhigang
（College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）
Abstract: The present study aims at cloning the CDS fragment of 4E-BP1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1）
gene cDNA and analyzing its tissue-specific expression pattern in Inner Mongolia cashmere goat. 4E-BP1 gene cDNA was amplified by RT-PCR
from Inner Mongolia cashmere goat fetal fibroblasts. The nucleotide sequence was analyzed with bioinformatics. The tissue-specific expression
pattern of 4E-BP1 gene was analyzed by semi-quantitative RT-PCR. The cloned 4E-BP1 gene cDNA was 357 bp in length, including a complete
ORF encoding 118 amino acids. The full cDNA nucleotide sequence has a 98%, 90%, 90%, 88% and 87% identity with Bos taurus, Equus
caballus, Homo sapiens, Rattus norvegicus and Mus musculu. The 4E-BP1 gene was shown to express in brain, heart, testis and pancreas.
Key words: Inner Mongolia cashmere goat 4E-BP1 Tissue-specific expression
真核细胞翻译起始因子 4E 结合蛋白 1（eukar-
yotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，
4E-BP1）作为 eIF4E 的抑制蛋白，调节翻译起始
和蛋白质合成。eIF4E 为 mRNA 帽子结合蛋白，是
最重要的真核细胞翻译起始因子，能特异地识别
真核细胞 mRNA 5端的 7 甲基鸟苷酸帽子结构
m7 GPPPN 并启动翻译［1］。低磷酸化的 4E-BP1 与
eIF4E 有很高的亲和力，抑制 eIF4E 与 mRNA 5端
的 7 甲基鸟苷酸帽子结构结合，进而抑制翻译起始。
在生长因子、营养素等外界因素的作用下，细胞内
mTORC1（The mammalian target of rapamycin complex
1）被激活，磷酸化其下游的 4E-BP1，磷酸化的
4E-BP1 与 eIF4E 亲和力下降，释放出 eIF4E，促使
翻译起始复合物的形成，从而加速蛋白质的合成。
mTORC1 信号通路基本功能是感受营养状况进
而调控细胞生长，近年的研究已将 mTORC1 与干细
胞［2］，胚胎及幼体发育与生长［3］，进食、营养与肥
胖［4-6］，免疫细胞分化［7］，衰老［8］等动物生理和
病理过程联系在一起，mTOR 蛋白激酶作为在进化
上保守的协调器调节着基本的生物加工过程［9, 10］，
2012年第3期 91傅海霞等 ：内蒙古白绒山羊 4E-BP1 基因 cDNA 克隆及组织表达特异性分析
4E-BP1 作为 mTOR C1 的下游效应器在完成这些生
物加工过程中起着关键的作用。4E-BP1 基因及其
编码的蛋白已在一些动物中得到深入研究，牛的
4E-BP1 包含了 118 个氨基酸残基，人和马的则是
118 个，大鼠和小鼠为 117 个。4E-BP1 基因在个物
种之间是高度保守的，目前尚未有绒山羊 4E-BP1 基
因的研究报道。
内蒙古白绒山羊（Inner Mongolia Cashmere Goat）
是经过长期的自然选择和人工选育而形成的优良的
绒肉兼用型品种，但在种质资源鉴定方面尚缺少有
效的方法，对 4E-BP1 基因的核苷酸组成和特性的研
究不仅可以区别物种间的遗传差别和进化特征，而
且可为动物个体发育过程中基因表达和调控研究提
供良好的模式，将对优良绒山羊品系的保存和遗传
育种具有重要意义。本研究试图建立有效的克隆内
蒙古白绒山羊 4E-BP1 基因的 RT-PCR 体系及检测该
基因在绒山羊不同组织中表达情况的半定量RT-PCR
体系，获得绒山羊 4E-BP1 基因编码区 cDNA 序列及
表达模式数据。
1 材料与方法
1.1 材料
克隆载体 pMD19-T Vector，oligo（dT）18，RNase
Inhibitor，RNase Free dH2O，LA-Taq DNA polymerase、
T4 DNA 连接酶、限制性内切酶 EcoR Ⅰ、SalⅠ，DNA
分子量标准 DL 2000，总 RNA 抽提试剂盒（RNAiso
Reagent）等均购自宝生物工程（大连）有限公司
（TaKaRa）；氨苄青霉素购自 Sigma 公司 ；AxyPrepTM
DNA Gel Extraction Kit 50-prep 和 AxypPrepTM Plasmid
Miniprep Kit 50-prep 购自爱思进生物技术（杭州）有
限公司（AXYJEN）；感受态大肠杆菌 DH5α 由本实
验室制备。
1.2 方法
1.2.1 动物组织及细胞培养 内蒙古白绒山羊的脑、
心脏、睾丸和胰腺等组织采自内蒙古白绒山羊种羊
场屠宰后的羊体，现场采集后立即放入液氮冷冻，
带回实验室置 -80℃保存。内蒙古绒山羊胎儿成纤
维细胞培养采用单层培养方法。所用培养基为含有
10%FBS 的 DMEM/F12，37℃、5%CO2、饱和湿度条
件下培养。
1.2.2 总 RNA 的提取及 RT-PCR 第一链 cDNA 的合
成 按照 RNA 提取试剂盒（RNAiso Reagent）说明
书的操作方法提取内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞
及脑、心脏、睾丸及胰腺等组织的总 RNA，琼脂糖
凝胶电泳验证 RNA 完整性，保存于 -80℃备用。用
Oligo（dT）18 Primers 按照反转录酶 AMV 说明书的
方法反转录合成 cDNA 第一链。以内蒙古白绒山羊
胎儿成纤维细胞提取的总 RNA 合成的 cDNA（cDNA
１）为模板 PCR 扩增 4E-BP1 基因编码区全序列。
以绒山羊脑、心脏、睾丸及胰腺组织提取的总 RNA
合成的 cDNA（cDNA2）为模板，半定量 RT-PCR 检
测 4E-BP1 基因在个组织中的表达情况。
1.2.3 内蒙古白绒山羊 4E-BP1 基因的分子克隆 根
据 GenBank 中 牛 4E-BP1 基 因 mRNA 序 列， 利 用
Primer5.0 软件设计 PCR 特异性引物，上游引物 P1 ：
5-GCGAATTCACCATGTCCGGAGGTAGCA-3（5 端
加入 EcoR Ⅰ酶切位点和 GC 保护性碱基），下游引
物 P2 ：5-GCGTCGACGGCCCTTTAAATGTCCATCTC-
3（5端加入 Sal I 酶切位点和 GC 保护性碱基）。以
反转录合成的 cDNA1 为模板进行 PCR 扩增，10 μL
反应体系：模板 cDNA 1 μL；P1（10 μmol/L）0.4 μL；
P2（10 μmol/L）0.4 μL ；d3H2O 3.8 μL，反应程序 ：
94℃ 4 min ；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 16 s，32 个
循环 ；72℃ 10 min。PCR 反应产物经 1% 琼脂糖凝
胶电泳后用 AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit 50-prep
回收，直接与 pMD19-T 连接，转化感受态大肠杆菌
DH5α，接种于含 AMP+ 的 LB 培养基，37℃过夜培
养筛选重组菌落，提取质粒。重组质粒经 PCR 和酶
切（EcoR Ⅰ、SalⅠ）鉴定正确后送大连宝生物工
程有限公司测序。
1.2.4 生物信息学分析 测序得到的内蒙古白绒山
羊 4E-BP1 基因 cDNA 全序列用 NCBI 上的 BLAST
进行序列比对（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），
开放阅读框（ORF）预测采用 ORF Finder（www.
ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）。等电点及理论分子量
预测用 http ：//isoelectric.ovh.org/，分子进化树建立
使用 MEGA 软件。
1.2.5 组织特异性表达检测 收集内蒙古白绒山
羊脑、心脏、睾丸及胰腺组织材料，提取总 RNA，
以反转录得到的 cDNA 第一链为模板（cDNA2），
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期92
P1 和 P2 为引物扩增 4E-BP1 基因，预期片段长
度 357 bp。以山羊 β-actin 为内源对照，引物 P3 ：
5-TGGCACCACACCTTCTACAACGAGC-3 25mer ；
P4 ：5-CGTCCCCAGAGTCCATGACAATG-3 23mer，
预期片段长度 229 bp。半定量 RT-PCR 检测 4E-BP1
基因在不同组织中的 mRNA 丰度。
2 结果
2.1 4E-BP1基因克隆与序列测定
PCR 扩增产物经电泳鉴定后得到与预期片段大
小相符的特异性条带（图 1）。重组质粒（pMD19T-
4EBP1）经 PCR 和酶切双重鉴定正确（图 2）。因上游
引物和 pMD19-T 载体 T- 克隆位点之后都有 EcoR Ⅰ
酶切位点，因此当 EcoR Ⅰ单酶切时图2中出现了两
条带，表明4E-BP1cDNA片段正向插入pMD19T 载体
中，与预期相符。序列测定结果表明，扩增片段全
长 357 bp，包括了全部的 ORF。
2.2 4E-BP1基因序列及编码蛋白分析
测序得到的内蒙古白绒山羊 4E-BP1 基因 cDNA
核酸序列中 G+C 含量为 65.55%（图 3）。与牛（Bos
taurus）、 人（Homo sapiens）、 马（Equus caballus）、
大鼠（Rattus norvegicus）和小鼠（Mus musculus）的
同源性分别为 98%、90%、90%、88% 和 87%。相
应的氨基酸序列同源性分别为 98%、92%、94% 和
90%。内蒙古白绒山羊 4E-BP1 基因编码一个由 118
个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白理论分子质量
12.5 kD，等电点（pI）4.79，氨基酸组成中 Pro 含
量最高，为 13.6%。其中酸性氨基酸和碱性氨基酸
分别占 11.9% 和 10.2%。与已报道的 12 个物种的
4E-BP1 基因核苷酸序列构建进化树（图 4），表明内
蒙古白绒山羊与牛的亲缘关系最近。
2012年第3期 93傅海霞等 ：内蒙古白绒山羊 4E-BP1 基因 cDNA 克隆及组织表达特异性分析
2.3 组织特异性表达分析
组织半定量 RT-PCR 分析（图 5）表明，4E-BP1
基因在脑、心脏、睾丸和胰腺组织中均有表达，在
脑组织中的表达量较高。
要调控功能的超二级结构，C 端的 TOS 模序（motif）
和 N 端的 RAIP 模序。两个模序都参与了与 Raptor
的结合进而使得 4E-BP1 被磷酸化，但二者的作用不
同，TOS 起主要作用，RAIP 为附属。失去 RAIP 的
4E-BP1 仍能结合 eIF4E，起到抑制 cap 依赖性翻译
的作用［13］。人 4E-BP1 已报道的磷酸化位点有 7 个，
分别是 Thr37，Thr46，Ser65，Thr70，Ser83，Ser101
和 Ser112［1］。 在 生 长 因 子 的 刺 激 下，mTOR 使
4E-BP1 磷酸化的顺序首先是 Thr37 和 Thr46，然
后是 Thr70 和 Ser65，Thr70 和 Ser65 的磷酸化对于
eIF4E 的释放是最为重要的，Thr70 可以促进释放，
而 Ser65 可以防止二者重新结合［14］。上述结果显示
了 mTORC1 使得 4E-BP1 磷酸化对于 eIF4E 释放的
重要性和这种磷酸化过程的复杂性。
通过试验得到的内蒙古白绒山羊 4E-BP1 基因
cDNA 核苷酸序列和推导的氨基酸序列经 NCBI Blast
序列比对，与已报道的牛、马、人、大鼠及小鼠等
物种的 4E-BP1 基因具有高度的同源性，表明绒山羊
4E-BP1 基因被正确克隆。编码的蛋白经 NCBI CDD
预测具有 4E-BPs 超家族特征结构域，进一步证明
了绒山羊 4E-BP1 结构与功能的一致性。组织表达
检测表明，该基因在所检测的 4 种组织中均有表达，
表明该基因具有管家基因的特征，与其功能重要性
相符。
内蒙古白绒山羊是珍贵的地方畜种资源之一，
具有与当地自然环境相适应的生物学特性，耐热、
耐旱、耐粗饲，比绵羊、牛更能有效利用山地牧场
和贫脊草原，具有重要的经济价值。近年来由于草
A. 半定量 RT-PCR 检测 4E-BP1 基因在不同组织中的表达 ；
B. 用 β-actin 标准化后的 AKT 基因转录水平
图 5 内蒙古白绒山羊 4E-BP1基因在不同组织中的
mRNA丰度
3 讨论
哺乳动物中的 4E-BPs 由 4E-BP1，4E-BP2 和 4E-
BP3组成，它们都有一个eIF4E结合基序（YXXXXL¢，
¢ 代表任何疏水氨基酸残基）［11, 12］，研究较多的是
4E-BP1。近年来，很多研究表明 4E-BP1 与细胞生长、
增殖和肿瘤等有关。在 4E-BP1 中发现了两个具有重
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期94
场退化，种群数量增加，舍饲比例加大，导致其生
产性能降低，这其中肌体对营养和能量信号刺激的
敏感性起着重要的作用，但机制尚不清楚。4E-BP1
是蛋白质合成的负调节因子，在动物胚胎发育及个
体生长中起着重要的作用。对 4E-BP1 基因的研究不
仅可以区别物种间的遗传差异和进化特征，而且对
动物胚胎发育与个体生长过程中对外界影响因素的
反应机制研究具有重要意义。
4 结论
内蒙古白绒山羊 4E-BP1 基因 cDNA 编码区核
苷酸序列为 357 bp，包含了编码 118 个氨基酸残基
的全长 ORF。核苷酸序列与已报道哺乳动物 4E-BP1
基因核苷酸序列同源性在 87%-98% 之间。4E-BP1
基因在内蒙古白绒山羊的脑、心脏、睾丸及胰腺组
织中均有表达，mRNA 丰度在脑组织中较高。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）