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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):50-58
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术作为
分子生物学研究中发展迅速的一种新兴基因阻断技
术，目前已成为生物领域的研究热点。它是一种进
化上保守的作用机制，广泛存在于动物、植物和微
生物中，包括真菌中的基因压制（Gene quelling）现
象、植物中的共抑制（Co-suppression）现象和动物
中的基因干扰现象［1］。这些现象的产生主要是通过
反义 RNA 与正义 RNA 形成的 dsRNA（Double-stra-
nded RNA，dsRNA）分子，在细胞内被切割成 21-
23 bp 大小的 siRNA（Small interference RNA），特异
性降解与之同源的单个内源靶基因的 mRNA，从而
阻断基因表达，产生基因沉默［2，3］。近几年发展的
RNAi 技术能够高效特异的沉默功能基因，使生物
体产生相应的功能缺陷表型，以此确定基因的功能。
随着多种真菌如构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、粗
糙脉孢菌（Neurospora crassa）、大丽轮枝菌（Vertic-
illium dahliae）和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）等
基因组测序计划的完成，真菌基因功能的鉴定迫在
眉睫［4］。RNAi 技术以其特异、高效、广泛性优势，
被迅速应用到真菌基因功能的研究领域中，逐渐成
收稿日期 ：2014-11-17
基金项目 ：重庆市自然科学基金项目（cstc2012jjA80021），重庆市教委项目（KJ120604），重庆师范大学重点项目（2011XLZ09），重庆师范
大学博士启动金（12XLB002）
作者简介 ：苏子敬，男，硕士研究生，研究方向 ：植物内生菌 ；E-mail ：253197105@qq.com
通讯作者 ：谢成建，男，博士，副教授，研究方向 ：植物病理学 ；E-mail ：xcj614@163.com
RNAi 技术及其在真菌基因功能研究中的应用
苏子敬  李巧玲  黄程  谢成建  杨星勇
（重庆师范大学生命科学学院，重庆 4013321）
摘 要 ： RNA 干扰是指在进化过程中由高度保守的外源或内源双链 RNA（dsRNA）引发的转录后水平基因沉默的现象。
RNAi 技术作为一种高效、特异的基因阻断技术，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域，成为 2l 世纪
的研究热点之一。简要综述了 RNAi 的发现过程，作用机制，作用特点及其在真菌基因功能研究中的应用前景，为相关研究奠定
理论基础。
关键词 ： RNA 干扰 ；基因沉默 ；真菌 ；基因功能
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.008
RNAi Technology and Its Application in Fungal Gene
Functional Studies
Su Zijing Li Qiaoling Huang Cheng Xie Chengjian Yang Xingyong
（College of Life Sciences，Chongqing Normal University，Chongqing 401331）
Abstract ： RNA interference (RNAi) is a phenomenon of post-transcriptional gene silencing triggered by highly conserved exogenous or
endogenous double-strand RNA (dsRNA) during the evolution. RNAi, as an efficient and specific gene blocking technology, is widely applied
to gene functional studies and the areas of treating infectious diseases and malignant tumors. RNAi has become one of the hotspots in the 21st
century. This paper reviewed the several aspects of RNAi, including the history of discovering it, mechanism, characteristics, and the application
prospects in fungal gene functional analysis, which may provide the theoretical basis for related researches.
Key words ： RNA interference ；gene silencing ；fungi ；gene function
2015,31(8) 51苏子敬等：RNAi 技术及其在真菌基因功能研究中的应用
为一种具有潜力的基因功能研究技术。
1 RNAi 的发现
20 世纪 90 年代初，Jorgensen 研究组将一个强
启动子控制的色素合成相关基因——查耳酮合成酶
基因（chs）转入牵牛花中，试图用转基因技术手段
使紫色矮牵牛花的花朵更加艳丽，结果并未获得预
期的深紫色花朵，反而得到了斑驳状花朵及白色的
花。深入的研究证明，被转入该植物中的 chs 基因
与牵牛花中与该基因同源的色素基因的表达均受到
了抑制，这种外源基因和自身同源基因均受到抑制
的现象被命名为共抑制（co-suppression）现象［5，6］。
该现象同样出现于真菌转基因研究中。1994
年， 当 Cogoni 等［7］ 把 外 源 同 源 基 因 转 入 脉 孢 菌
（Neurospora）时，该基因及 Neurospora 自身的同源
基因的表达均显著性的下降，当时把这种在真菌中
发现的类似于共抑制的现象称为“基因压制”（Gene
quelling）现象，但当时并未明确其机制。
1995 年，美国康乃尔大学的 Guo 和 Kemphues
博 士 等［8］ 发 现 由 正 义 RNA 和 反 义 RNA 形 成 的
dsRNA 均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫
（Caenorhabditis elegans）中 par-l 基因的表达。这一
发现有力地冲击了只有反义 RNA 形成的 dsRNA 才
能有效地干扰具有同源序列的内源基因的表达这一
传统观念。然而由于当时理论水平和实验依据的限
制，这一现象并没有得到合理的解释。
1996 年，Cogoni 等［9］经过深入的研究证实真
菌中的 gene quelling 与植物中的基因沉默机理基本
相同。
1998 年，华盛顿卡耐基研究院的科学家 Fire［10］
和麻省大学医学院的科学家 Mello 首次证实了 Guo
等发现的由正义 RNA 抑制同源基因表达的现象是
由于在体外转录制备的 RNA 中污染了 dsRNA 而引
发，并将这种现象命名为 RNA 干扰（RNAi）。由于
RNAi 的作用，功能基因无法表达而使其相对应的
表型不能显现，导致基因功能的缺失或减弱，因此
又将此作用机制称之为基因沉默（Gene silencing）。
Fire 和 Mello 的研究首次证明 RNAi 作用存在于生物
界中，并因此获得 2006 年诺贝尔生理学和医学奖［11］。
目 前 研 究 发 现， 很 早 以 前 RNAi 就 普 遍 存 在
于小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥和真菌等生物之
中。在整个生物界进化过程中，它既是一种古老的
生物学现象，又是一种保守的自我保护机制，因此
又被称为“基因组的免疫系统”。这种免疫机制的
存在不仅能避免生物体的基因组受到诸如病毒基因
的外源基因分子的干扰和袭击，而且，也能通过实
时定量地调控各阶段基因的表达来控制和调节细胞
分化［12，13］。
2 RNAi 的分子机制
RNAi 一经发现便引起了研究者们的高度重视，
如今已成为一种高效的“基因沉默”技术，并在此
技术基础之上衍生出了 TALAN 技术和 CRISPR 技
术。该技术广泛应用于生物的基因功能鉴定和功能
基因表达调控领域的研究，并且对 dsRNA 介导的基
因沉默的分子机制的研究一直是生物学研究的热点。
经研究证明，RNAi 的分子作用机制在包括动植物
的高等真核生物细胞中与真菌细胞中不尽相同。在
动植物细胞中，依据 dsRNA 分子的来源，存在两种
不同但又相关的 RNAi 途径 ：siRNA 途径和 miRNA
（microRNA）途径。siRNA 是由外源 RNA 或外源载
体等导入细胞后产生的一系列小 RNA，它能与靶
mRNA 完全互补并使其降解［14，15］；miRNA 是一类
由含颈环结构的前体 RNA 经过 Dicer 酶酶切而形成
的非编码小 RNA，它与靶 mRNA 的 3- 非编码区结
合，抑制靶 mRNA 降解和翻译表达，从而导致特定
基因的沉默，而且大多数 miRNA 参与了生长与发育，
生理代谢或压力应激过程［4，16，17］。在真菌细胞中，
gene quelling 属于进化上保守的 siRNA 途径，即典
型的 RNAi 途径，而 miRNA 途径尚未被发现［1，18］。
另外，在粗糙脉胞菌中发现了第二种真菌基因沉默
现象即减数分裂沉默（Meiotic silencing by unpaired
DNA，MSUD），在第一次减数分裂前期，一段 DNA
在亲本一方正常，另一方不存在，或在亲本双方不
同从而产生了未配对的 DNA，使同源染色体不能正
常配对，导致减数分裂异常，未配对的 DNA 就发生
了沉默。这种现象发生在染色体配对到子囊孢子形
成时期，MSUD 参与了生长发育周期，因此，可能
与 miRNA 起源于同一种古老的沉默机制［4，15］。典
型 RNAi 的分子机制作用途径大致可分为起始阶段、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.852
效应阶段和扩增阶段 3 个阶段。
2.1 起始阶段
dsRNA 分为分子间双链和分子内双链。分子间
双链是由分开的两个独立 RNA 分子互补形成，而分
子内双链是由一个 RNA 分子回折，自身互补而形成。
当细胞中的 dsRNA 扩增达到一定量时，外源或内源
性 的 dsRNA 被 一 种 dsRNA 特 异 的 核 酸 酶 RnaseIII
家族中的 Dicer 酶特异识别，并将其逐步切割成长约
21-23 nt 的 dsRNA 片 段（siRNA）。siRNA 是 RNAi
作用赖以发生的重要中间效应分子，具有独特的特
征性结构，其两条单链末端分别为 5-PO3 和 3-OH，
该 siRNA 与所作用的靶 mRNA 具有高度的核苷酸序
列同源性。此外，由于每条 siRNA 单链的 3 末端
均有 2-3 个突出的非配对的碱基残基（图 1）［19-21］，
所以其化学性质相对稳定，无须像反义核苷酸那样
通过大量的化学修饰来提高半衰期，这也是细胞赖
以区分真正的 siRNA 和其他小 dsRNA 的结构基础。
dsRNA，新合成的 dsRNA 又可被降解成若干 siRNA，
这 种 新 产 生 的 siRNA（ 次 级 siRNA，secondary
siRNA） 又 可 形 成 更 多 的 RISC 复 合 物 并 作 用 于
mRNA，使 mRNA 降解。这个过程使 RNAi 效应得
到放大［26，27］。
3 RNAi 的特点
3.1 RNAi的高度特异性
siRNA 与靶基因的 mRNA 在序列上严格遵循
碱基互补配对原则，研究发现，即使发生一个碱基
的错配，目的 mRNA 的沉默效率也会大大降低［28］。
这种高精确度的序列特异性的识别能使 dsRNA 专一
地降解与之同源的 mRNA，从而精确沉默目的基因。
3.2 RNAi的高效性
细胞内的 RNAi 途径存在级联放大效应，极少
量的 dsRNA 经起始阶段——效应阶段——扩增阶段
的循环就能产生强烈的 RNAi 效应。靶 mRNA 被降
解之后，细胞内的核糖核酸聚合酶继续催促 dsRNA
的合成并反复利用该 dsRNA 进行基因沉默，以维持
高效、特异靶向的干扰作用。RNAi 对基因表达的抑
制率可达 90% 以上，这种高效的抑制效率是传统基
因沉默实验技术所欠缺的［29，30］。
3.3 RNAi的遗传性和传播性
目前已有大量的资料证实，在低等生物中 RNAi
可以传代，例如，在秀丽线虫（C. elegans）中通过
生殖细胞可以传递好几代。另外，RNAi 效应可以在
细胞和组织间扩散，dsRNA 可在生物体的不同组织
间传递和维持［26，31］。
3.4 RNAi的不完全性
RNAi 对基因表达水平的抑制是不完全的，只是
引起了部分下调，利用基因表达水平减弱这种不完
全的沉默效应，可以对关键基因或致死基因的功能
进行详细分析［32，33］。同时，可根据基因沉默效率的
不同程度来研究不同基因表达水平所引起的表型变
化等更为详细的信息。且对于不同的基因其最低抑
制率是不同的，例如根据抑制效率的多少，结合具
体表型的变化来分析研究药物靶标［1，34］。
3.5 RNAi的可调控性
RNAi 是可以在不同组织和不同阶段进行实时
P-5˃ OH-3˃3 -˃OH 5 -˃P
图 1 siRNA 的结构［19-21］
2.2 效应阶段
siRNA 可 与 细 胞 质 中 特 定 的 酶 形 成 RNA 诱
导 的 沉 默 复 合 物（RNA-induced silencing complex，
RISC），siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋
酶是该复合体中的必备成分［22］。在 RISC 的作用下，
siRNA 解链成为单链，由其中的反义链特异识别目
的 mRNA 并与之结合。一经结合，细胞内的核酸内
切酶就在靶 mRNA 的近中点位置切割目的 mRNA，
被切割的 mRNA 片段被核酸外切酶降解后无法正常
编码成相应的蛋白质，从而导致功能缺失［23，24］。
2.3 扩增阶段
siRNA 的反义链与靶 mRNA 的上游部分序列互
补［25］。在依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶（RNA-depen-
dent RNA polymerase，RdRP） 的 作 用 下， 经 初 级
阶段产生的 siRNA 分子在细胞内能以自身反义链
为扩增引物，以目标 mRNA 为模板，复制出新的
2015,31(8) 53苏子敬等：RNAi 技术及其在真菌基因功能研究中的应用
调控的。已有研究报道称以可诱导型启动子或组织
特异型启动子为骨架构建 RNAi 载体，可以实现时
间特异性和组织特异性的基因沉默，从而调控 RNAi
作用的产生［35］。例如，Carneiro 等［36］利用可诱导
乙醇脱氢酶 alcA 启动子调控报告基因多聚半乳糖醛
酸内切酶基因 epg1 的 RNA 沉默，由于选择的碳源
的差异，EPG 的表达能被不同程度的上调或下调。
3.6 RNAi的序列专一性
RNAi 具有序列专一性的特点，而不具有基因座
专一性特点［31，37］，该序列专一性可应用于基因家
族的沉默表达。当靶基因所在的基因家族中存在一
个或几个保守区域时，针对该保守区域设计的 RNAi
载体便可诱导整个基因家族的沉默。尤其是当存在
基因冗余现象而掩盖了基因缺失突变体的表型时，
采用 RNAi 技术可以避免基因互补［32］。
4 RNAi 在真菌基因功能研究中的应用
在生物体生长发育过程中，抑制或沉默特定基
因的表达技术通常用来研究该基因在该生理过程中
的作用。目前，基因敲除和反义 RNA 技术已成为基
因功能研究中最常用且很成熟的基因阻断技术。然
而基因敲除技术，如通过同源重组进行敲除，操作
复杂，一次只能完成一个基因的敲除，若靶基因是
生长必需基因，则对该基因的敲除会导致个体的早
期死亡而无法进行相关研究。同时，反义 RNA 技术
抑制基因表达的效率较低，不利于目标基因的研究。
与基因敲除和反义 RNA 技术相比，RNAi 作为一种
高效、特异的基因阻断技术，具有特异性、高效性、
作用迅速性、高稳定性、操作相对简便、一次可研
究多个基因等多方面的优势。目前 RNAi 正广泛地
应用于功能基因组研究［38，39］，并显示出非常广阔的
应用前景。
随着分子生物学技术的不断发展，镰刀菌（F.
oxysporum）、稻瘟病菌及大丽轮枝菌等 40 多种真菌
的基因组测序工作已完成，GenBank 中积累了大量功
能未知的真菌 DNA 序列［31，34］。鉴定与明确这些基
因的功能及生物学特性已成为当前研究中的热点问
题和前进方向［40］。而功能基因的分析迫切需要一种
高效、高通量技术来鉴定基因功能。RNAi 技术可特
异性地使特定基因沉默，其表现性状类似于基因功
能缺失产生的表型［41］，从而产生定向突变［42］。因此，
RNAi 技术以其快速、有效、能批量分析等优势，成
为研究真菌基因功能的有效工具，在研究真菌的致
病性及其营养生长方面尤为普遍［43］，如对炭疽杆菌
（Colletotrichum graminicola）［44］、 柄 锈 菌（Puccinia
triticina）［45］、 绿 僵 菌（Metarhizium anisopliae）［46］
和扩展青霉（Penicillium expansum）［47］等致病性的
研究，以及对深绿木霉（Trichoderma atroviride）［48］
菌丝生长的研究。
4.1 RNAi发夹结构表达载体在真菌基因功能研究
中的应用
目前广泛应用于真菌基因功能研究的一种 RNAi
的方法是根据目的基因的反向重复序列结构构建可
以诱发 RNAi 的发夹结构载体，即 hpRNA（Hairpin
RNA）表达载体。该表达载体导入真菌细胞后，在
通用启动子 Ptrpc 作用下，反向重复序列会形成发夹
结构的两臂，两臂之间由间隔序列相连，转录形成
发夹结构的 dsRNA，dsRNA 被 Dicer 酶识别与加工
后诱发目的基因沉默［15］。hpRNA 表达载体于 2002
年首次应用于新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）
的 RNAi 研究中，以 GFP 作为间隔构建 RNAi 发夹
结构表达载体，结果显示表现完全突变表型的转化
子占总转化子的 7%-10%［49］。
为了更为高效地利用 hpRNA 表达载体研究真
菌基因功能，发展了两臂之间由真菌的内含子相连
以载体 pSilent-1（图 2）为基础的发夹结构表达载
体，即 ihpRNA 表达载体。pSilent-1 载体自身含有
潮霉素抗性基因（Hygromycin resistant cassette）、多
克隆位点和内含子间隔区，从而大大简化了载体构
建程序，成为发夹结构表达载体构建的有效骨架。
Nakayashiki 等［34］ 用 ihpRNA 表达载体研究丝状真
菌稻瘟病菌 MPG1 基因的功能，较普通的基因沉默
技术，该沉默效率明显提高，高达 70%-90%，完
全突变表型占 10%-50%。2007 年，Krajaejun 等［50］
发展了以 pFANTAi4 载体为骨架的 ihpRNA 表达载
体，载体构建利用 Gateway 技术，简便、快捷、成
功率高、对原始载体和目的片段的限制少，避免
了困难和繁琐的“酶切 - 连接”步骤，简化了克
隆步骤，而且沉默效率同样很高。目前，ihpRNA
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表达载体在真菌基因功能研究中已经得到了广泛
应用，并且技术已经成熟。如在荚膜组织胞浆菌
（Histoplasma capsulatum）［51］、 白 腐 真 菌 黄 孢 原 毛
平 革 菌（Phanerochaete chrysosporium）［32］、 亚 麻 锈
菌（Melampsora lini）［52］、 产 黄 青 霉（Penicillium
chrysogenum）［53］ 和 长 孢 黄 萎 病 菌（Verticillium
longisporum）［54］等许多真菌中都进行了基因功能的
研究。
的 37 个相关基因，他们将编码增强型绿色荧光蛋
白（eGFP）的基因与靶基因融合后插入两个启动
子之间，使其形成转录嵌合体，并通过荧光信号的
减弱程度来检测双干涉对突变菌株的沉默效率。另
外，Nguyen 等［56］ 采用“building blocks method”将
人工合成的由 GH10 和 GH11 两个家族 10 个 40 bp
大小的内切木聚糖酶目的基因形成的 400 bp 序列插
入到反向双启动子系统 PSD1G（pSD1-eGFP）载体
的 EcoR V 位点构成 PSD1G-SDXYL 沉默载体，从而
使同源内切木聚糖酶家族基因同时发生沉默，研究
结果表明内切木聚糖酶有利于稻瘟病菌在感病叶片
中纵向穿透和水平侵染，而且在致病过程中是作为
一个群体来发挥作用的。同时也证明了对于多基因
同时沉默这种载体比 hpRNA 表达载体更有效。对单
基因沉默，有研究报道其效率相对低些，可能是由
于 dsRNA 形成率较低［15］。但是，Mu 等［57］在对灵
芝（Ganoderma lucidum）的 URA3 基因进行研究时，
证明了反向双启动子系统沉默载体的沉默效率要比
发夹结构沉默率高，可达 81.9%。另外，他们通过
对 URA3 和 laccase 以及一个报告基因的共沉默，说
明了反向双启动子系统沉默筛选率可能更高。因此，
反向双启动子系统 RNAi 载体更适用于高通量的真
菌基因功能的研究。
AmpR
pSilent-1
7 056 bp
Ttrpc
hph
Ptrpc
PtrpcTtrpc
Apa I
Kpn I
Stu I
Sph I
Bgl II
Hind III
SnaB I
Xho I
Spe I
IT
AmpR ：氨苄青霉素抗性基因 ；HPH ：潮霉素抗性基因 ；IT ：角质酶内含子 2
图 2 沉默载体 pSilent-1 图谱
4.2 反向双启动子系统RNAi载体在真菌基因功能
研究中的应用
针对大量单个基因或家族基因的基因功能的研
究，若要构建 hpRNA 表达载体，需要确定目的基
因的方向，工作量大又耗时，而反向双启动子系统
RNAi 载体的构建只需将目的基因非定性插入两个启
动子之间，载体导入细胞后，靶基因就会在两个反
向双启动子的作用下分别进行转录形成正义 RNA 链
和反义 RNA 链，然后形成 dsRNA，从而引起靶基因
的沉默。这种载体非常适用于家族基因的沉默。
Nguyen 等［55］利用含有 TrpC 启动子（The trypt-
ophan synthetase）和 gpdA 启动子（Glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase）两个方向相反的双启动子
结构的 pSD1（pSilent-Daul1）载体（图 3）研究了
稻瘟病菌（M. oryzae）中所有涉及钙离子信号通路
AmpR
pSilent-Daul1
5.6 kb
GeneticinR
Pgpd Ptrpc
Xba I*
Spe I*
BamH I
Sma I*
Ava I
Pst I
EcoR I
EcoR V*
Hind III*
星号 ：酶切位点在载体中唯一 ；PtrpC ：构巢曲霉 trpC 启动子 ；Pgpd ：构巢
曲霉 gpd 启动子 ；AmpR ：氨苄青霉素抗性基因
图 3 沉默载体 pSilent-Dual1 图谱
2015,31(8) 55苏子敬等：RNAi 技术及其在真菌基因功能研究中的应用
4.3 siRNA或dsRNA直接导入真菌细胞应用于真菌
基因功能的研究
人工合成 siRNA 介导的 RNAi 在哺乳动物中的
应用非常普遍，但是其在真菌中的应用报道却很少
见。Khatri 等［58］在研究构巢曲霉的鸟氨酸脱羧酶
ODC 基因时利用 23 nt 的 siRNA duplex 处理萌发的
孢子引起孢子萌发和芽管生长明显减少，且培养 18
h 后沉默水平最高，并持续到培养 48 h。而在哺乳
动物中，人工合成 siRNA 介导的 RNAi 在数小时或 1-2
d 内明显激活并且可持续好多天［1］。但不可否认该
研究为真菌细胞 RNAi 提供了一种简单、快捷的方
法。Moazeni 等［37］采用修改后的 PEG/LiAc 方法将
不同浓度的 19 nt siRNA 导入白色念珠菌（Candida
albicans）细胞，来抑制 EFG1 基因的表达，结果显
示随着 siRNA 浓度的降低抑制作用也减弱，1 μmol/L
的 siRNA 能够有效抑制 EFG1 基因的表达，其菌丝
形成量明显减少，且降低了芽管的生长率，而采用
100 nmol/L siRNA 时得到了满意的结果。
Whisson 等［59］通过脂质体介导原生质体转染的
方法将 150-300 bp 大小的 dsRNA 直接导入致病疫霉
菌（Phytophthora infestans）细胞，一种类似真菌的
卵圆菌，促使 inf1、edc14 基因发生沉默，结果在转
染 12-15 d 后，由于原来的 dsRNA 不再完整但在基
因沉默过程中会发生级联放大效应，从而使 mRNA
表达水平明显降低。
上述 3 种研究真菌基因功能的方法，前两种方
法最常用，而将人工合成的 siRNA 或 dsRNA 直接导
入真菌细胞的 RNAi 方法虽然方便、快捷，但在多
数真菌中不能起到有效的沉默作用［15］。
5 展望
RNA 技术自 1998 年揭示以来，在植物、真菌、
线虫等生物领域中取得了巨大成功，现已成为生命
科学的研究热点之一。在显示出极大潜力的同时，
在研究中也发现一些问题 ：（1）RNAi 机制研究中 ：
RISC 组成成分如何，RISC 与 siRNA 具体如何结合，
靶向 mRNA 裂解过程中，除 ATPase、解旋酶外，有
没有其他大分子的参与，它们之间是如何相互作用
的，与 RNAi 相关的基因有哪些、相关基因如何调
控这一过程等问题尚需阐明。（2）siRNA 表达载体
的设计 ：由于一些 mRNA 序列在翻译之前可能掩藏
在高度折叠的区域，或者与蛋白结合成牢固的复合
体，从而干扰 siRNA 的特异性识别，导致 siRNA 并
不能成功接近靶 mRNA，完成降解过程。（3）如何
保证导入的 siRNA 的稳定性，避免细胞内 RNase 的
降解，仍是一个需解决的问题。（4）RNAi 只需要
靶基因的一小段序列，对于序列信息了解较少的真
菌来说是一个优势，但可能会引起部分同源的非靶
基因的沉默［1，56］。沉默突变体无法通过重新导入靶
基因形成恢复突变体。（5）RNAi 载体在基因组中的
随机插入可能会引起一些关键基因的插入突变从而
影响表型，Nakayashiki 等［34］在沉默稻瘟病菌 PKS-
like 基因时，引起黑色素合成基因 PKS 的插入突变，
导致菌落颜色发生改变。因此需要筛选大量的沉默
突变子才能准确分析断定靶基因的功能。（6）RNAi
技术常在细胞水平进行研究，其对整个生物体的作
用效果尚不明确，并且作用于 mRNA 的不同靶位时，
RNAi 的效应机制存在差异。因此，应用 RNAi 技术
需考虑其可行性，安全性和稳定性等问题。
尽管对 RNAi 的作用机制及应用还不是很清楚，
但必须承认 RNAi 作为一种高效、特异性强的基因
阻断技术，在功能基因组学上具有无穷的魅力，现
已证明 RNAi 技术是一种无价的研究工具，在后基
因组时代，可以更为快捷、有效地进行基因组功能
研究，分析基因的功能。而且，这种技术将支持功
能基因组学去发现和鉴定更多参与疾病和病害过程
的新基因，为人类在基因研究领域开辟新路径。植
物病原菌真菌是引起农作物病害的最大群体，是全
球粮食安全的一个常见又主要的威胁，给全世界的
农作物产量和市场化带来了严重损失［60］，研究其致
病基因，RNAi 技术具有其他技术无可比拟的优势。
对于 GenBank 中积累的大量未知的真菌基因，RNAi
技术可作为鉴定其功能的一种重要方法。另外，许
多 真 菌 如 粗 糙 脉 胞 菌、 酿 酒 酵 母（Saccharomyces
cerevisiae）、 粟 酒 裂 殖 酵 母（Schizosaccharomyces
pombe）和构巢曲霉等可作为模式生物应用于多种领
域［4］。相信通过对真菌 RNAi 机制进行不断地深入
研究，RNAi 技术必将会更加完善和成熟，从而更好
地探讨真菌与宿主间的相互作用，为疾病和病害防
治提供新的策略［60］，同时也会加快分子微生物学领
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.856
域甚或整个生物学领域的研究步伐，显示出其广阔
的应用前景。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）