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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
收稿日期 ： 2014-04-16
基金项目 ：国家科技支撑计划（2012BAD17B02），广东省自然科学基金项目（S2013040014562）
作者简介 ：庞欢瑛，女，博士，讲师，研究方向 ：水产经济动物病害 ；E-mail ：phying1218@163.com
通讯作者 ：简纪常，男，博士，教授，研究方向 ：水产经济动物免疫学及病害控制 ；E-mail ：jianjc@gmail.com
溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白 VscO 的基因
克隆及其生物信息学分析
庞欢瑛1，2，3 周泽军1，2，3 丁燏1，2，3 黄郁葱1，2，3
吴灶和2，3，4 简纪常1，2，3
（1. 广东海洋大学水产学院，湛江 524088 ；2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088 ；3. 广东省教育厅水产
经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088 ；4. 仲恺农业工程学院，广州 510225）
摘 要 ： 克隆了溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）ZJ03 株Ⅲ型分泌系统（T3SS）分子伴侣护航蛋白（Chaperone escort protein）
vscO 基因，并对其进行生物信息学分析。结果表明，vscO 基因全长 462 bp，编码 153 个氨基酸，理论分子量约为 18.43 kD，pI 值为 9.22。
细胞定位分析显示 vscO 基因位于外周质，不存在信号肽，无跨膜区。vscO 基因具有转录起始区 -35 区和 -10 区，以及翻译识别信
号 SD 序列（Shine-Dalgarno sequence）。该氨基酸序列含有多种活性位点，如蛋白激酶 C 磷酸化位点等。系统进化树发现溶藻弧菌
的 VscO 蛋白与副溶血弧菌聚为同一亚族。VscO 亚基三维结构模型显示其与副溶血弧菌 T3SS 的 YscO 蛋白有相似构型。信号通路
分析推测 VscO 位于 T3SS 的针状样结构上。蛋白网络互作图谱发现 VscO 与 10 种 T3SS 蛋白具有相邻关系。本研究结果将为溶藻
弧菌Ⅲ型分泌系统护航机制的研究奠定基础。
关键词 ： 溶藻弧菌 Ⅲ型分泌系统（T3SS） 分子伴侣护航 vscO 基因
Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of T3SS Chaperone
Escort Protein VscO from Vibrio alginolyticus
Pang Huanying1，2，3 Zhou Zejun1，2，3 Ding Yu 1，2，3 Huan Yucong1，2，3 Wu Zaohe2，3，4 Jian Jichang1，2，3
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088 ；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology
and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088 ；3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals
of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088 ；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou
510225）
Abstract: Primers for PCR cloning were designed according to the whole genome sequence of Vibrio alginolyticus published in GenBank.
The type III secretion system（T3SS）chaperone escort protein vscO gene of V.alginolyticus strain ZJ03 was amplified by PCR and cloned
into pMD18-T vector. Sequence analysis revealed that vscO gene is 462 bp and encodes a putative protein of 153 amino acids. The predicted
molecular weight（MW）of VscO was 18.43 kD with an estimated pI of 9.22. Using SignalP 4.0 and TMHMM Server 2.0 software, it was
predicted that the VscO protein was located in periplasm. It did not contain a signal peptide or a transmembranous region. The vscO gene with
transcription initiation region at -35 and -10 region, and a translation recognition signal sequence（SD Shine-Dalgarno sequence）. This protein
had some active sites, such as phosphorylation sites. To further analyze the evolutionary relationship among VscO, a molecular phylogenetic
tree was constructed using Mega 5.0 software. In this tree, the VscO protein showed high genetic relationship with Vibrio parahaemolyticus. The
three-dimensional structure of VscO was determined using SWISS-MODEL work-space and it had a similar structure with YscO protein of V.
parahaemolyticus. Signaling pathway analysis showed that VscO is located at the “needle” site of T3SS. Protein interaction map network found
that the relation between VscO and 10 kinds of T3SS proteins was neighbourhood. These results can provide a basis for further studies on the
chaperone escort machanism used by T3SS export pathway of Vibrio species.
Key words: Vibrio alginolyticus T3SS Chaperone escort vscO gene
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期156
溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种嗜盐嗜
温性革兰氏阴性短杆菌，广泛存在于海水中，是水
生动物弧菌病的主要病原菌之一，能引起鱼、虾、
贝等多种水产动物爆发大规模弧菌传染病［1-3］，给
水产养殖业造成巨大经济损失。此外，该菌可导致
人类的多种疾病，如腹泻、中耳炎以及败血症等［4，5］，
严重危害人类健康。
III 型分泌系统（Type III secretion system，T3SS）
是细菌保守存在的“针状样”毒力装置，与细菌的
致病机制密切相关［6，7］，是病原菌研究的热点之一。
该装置通过输出通路（Export pathway）将效应蛋白
注入宿主细胞，进一步诱导宿主细胞死亡［8，9］。研
究发现某些细菌的 T3SS 输出通路中存在分子伴侣护
航机制（Chaperone escort mechanism），即护航蛋白
和分子伴侣蛋白将效应蛋白护送至胞外的机制，该
机制在 T3SS 致病过程中起重要作用［10］。
本研究选取溶藻弧菌 T3SS 中分子伴侣护航蛋白
VscO 进行研究，对其进行基因克隆测序，并对其序
列特征、信号通路、三维结构、蛋白网络互作等进
行具体分析，以期为溶藻弧菌 T3SS 护航机制的研究
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和载体 溶藻弧菌强毒株 ZJ03，由本试
验室从广东省湛江港海域患病红笛鲷鱼体中分离并
保存［11］；克隆载体 pMD18-T 购自 TaKaRa 公司。
1.1.2 主要试剂 ExTaq DNA 聚合酶购自 TaKaRa
公司 ；细菌基因组 DNA 提取试剂盒、DNA 胶回收
试剂盒购自天根公司 ；其余试剂均为进口或国产分
析纯 ；引物合成和 DNA 测序均由上海生工生物技术
服务有限公司完成。抗生素浓度为氨苄西林（Ap）
100 μg/mL。
1.2 方法
1.2.1 溶藻弧菌 ZJ03 总 DNA 的提取 将溶藻弧菌
接种于 TSB（2% NaCl）培养基，28℃振荡培养 18 h。
取 1 mL 菌液于离心管中，10 000 r/min 离心 5 min 收
集菌体，参照试剂盒说明书提取细菌基因组 DNA，
-20℃保存备用。
1.2.2 vscO 基因的克隆 根据 GenBank 登录的溶藻
弧 菌 全 基 因 序 列（Accession ：NZ_AAPS00000000）
设计一对引物。上游引物 VscO1 为 ：ATGATAGAAC-
GTTTATTAGA，下游引物 VscO2 为 ：TTAGATAATG-
TCGACAGTG。 以 溶 藻 弧 菌 ZJ03 总 DNA 为 模 板，
PCR 反 应 条 件 为 ：94℃ 预 变 性 4 min ；94℃ 30 s，
50℃ 30 s，72℃ 30 s， 共 35 个 循 环，72℃ 延 伸 10
min。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检验后用 DNA
胶回收试剂盒切胶回收。
1.2.3 PCR 产物的测序 按照说明书操作步骤，将
PCR 产物与 pMD18-T 载体连接，然后转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞，在含 IPTG/X-Gal 的 Ap ＋ /LB 平
板上进行筛选，挑取阳性克隆送上海生工测序。
1.2.4 溶藻弧菌 ZJ03 VscO 生物信息学分析 采用
NCBI（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 进 行
序列同源性比对和相似性分析 ；使用 DNAMAN 进
行 氨 基 酸 同 源 比 对 分 析 ；运 用 ExPASy Proteomics
Server（http ：//ca.expasy.org）推导氨基酸序列、确
定 开 放 阅 读 框（ORF）、 分 子 量 计 算 值（Mw） 和
理 论 等 电 点（pI） 预 测 等 ；通 过 SignalP 4.0 Server
（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测信号肽
序列 ；应用 TMHMM Server 2.0（http ：//www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMM） 预 测 跨 膜 结 构 域 ；SoftBerry-
Psite（http ：//linux1.softberry.com/berry.phtml? Topic
= psite&group= programs & subgroup = proloc）预测氨
基酸序列中的功能位点分布 ；使用 Promoter 2.0 软件
分析启动子。PSORT II Prediction（http ：//psort.hgc.
jp/ form2.html）预测亚细胞定位。使用 Clastal 2.0 及
MEGA 5.0 软 件， 以 邻 位 相 连 法（neighbor-joining）
构建系统进化树。利用 SWISS-MODEL（http ：//www.
swissmodel. expasy.org/）程序进行三维结构构建［12］。
Kegg 软 件 分 析 涉 及 的 通 路（http ：//www.genome.
jp/kegg/）［13］。STRING 数 据 库 搜 索 蛋 白 网 络 互 作
（http ：//string.embl.de/）［14］。
2 结果
2.1 vscO基因的全长克隆
PCR 扩增得到一条约 500 bp 的特异条带（图
1-A）， 将 扩 增 产 物 连 接 到 pMD18-T 载 体， 菌 落
PCR 扩 增 出 约 500 bp 的 条 带（ 图 1-B）。 测 序 表
明，vscO 基因的开放阅读框（ORF）为 462 bp，编
2014年第6期 157庞欢瑛等 ：溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白 VscO 的基因克隆及其生物信息学分析
码 153 个氨基酸（图 2），在 GenBank 上的登录号为
KJ179947。
列进行 N 端信号肽结构的预测，发现其无明显的信
号肽切割位点，不存在信号肽。TMHMM Server 2.0
程序预测发现该蛋白无跨膜区。SoftBerry-Psite 程序
预测发现该氨基酸序列含有 2 个蛋白激酶 C 磷酸化
位点（71-73 aa，93-95 aa），1 个酪蛋白激酶 II 磷
酸 化 位 点（40-43 aa），1 个 酪 氨 酸 激 酶 磷 酸 化 位
点（132-138 aa），1 个内质网靶信号位点（139-142
aa），1 个微体 C 末端靶信号位点（57-59 aa）（图
2）。Promoter 2.0 软件分析发现 vscO 基因有转录起
始区 -35 区和 -10 区，以及翻译识别信号 SD 序列
（Shine-Dalgarno sequence）（图 2）。蛋白质亚细胞定
位预测结果显示，VscO 位于细胞核中可能性最大，
为 56.5%，其次为线粒体，可能性为 21.7%，而位于
线粒体和细胞支架的可能性分别为 17.4% 和 4.3%。
2.4 VscO的同源性及进化分析
BLAST 分 析 发 现 溶 藻 弧 菌 VscO 与 其 他 弧 菌
的 VscO 具有较高的同源性，其中与副溶血弧菌的
VscO 氨基酸序列的同源性最高达 86%，与塔斯曼弧
菌（Vibrio tasmaniensis）的同源性为 72%，与塔式
弧菌（Vibrio tubiashii）的同源性为 71%，与 Vibrio
caribbenthicus 的同源性为 70%，与 Vibrio azureus 的
2000
bp M 1 2 3
462
bp
1000
750
500
250
100
2000
bpM 1 2 3 4 5
462
1000
750
500
250
100
A
B
M ：DL 2000 DNA 分子量标准 ；1-7 ：vscO PCR 产物
图 1 vscO 基因的克隆（A）和菌落 PCR（B）
2.2 VscO的理化性质
利用 ExPASy 软件对溶藻弧菌 ZJ03 VscO 蛋白
进行分析，结果显示其原子总数为 2 631，分子结
构式为 C799H1334N248O249S1。理论分子量为 18.430 kD，
理论 pI 值为 9.22。不稳定系数 66.17，脂肪系数为
81.05，总平均亲水性为 -1.184，蛋白总体亲水性较高。
该蛋白不含有甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和半胱
氨酸（Cys），在 280 nm 处的摩尔消光系数为 9，970
（mol·cm-1）。酸性氨基酸残基（Asp + Glu）总数为
32 个，碱性氨基酸（Arg + Lys）总数为 36 个，N 末
端是甲硫氨酸（Met）。在酵母和大肠杆菌中表达的
半衰期分别大于 20 h 和 10 h，在哺乳动物网织红细
胞中体外培养表达的半衰期为 30 h。
2.3 VscO的序列分析
应用 Blast 程序搜索发现，vscO 基因在染色体
上的相对排列顺序如图 3 所示，箭头表示转录方
向。根据其他细菌的研究结果推测 SycN 是 VopN 的
分子伴侣，TyeA 是调节蛋白，VopN 是 T3SS 的效应
蛋 白，VscN 是 T3SS 中 ATP 酶，VscP 是 控 制 T3SS
针筒长度的“尺子”，VscQ 可以形成 T3SS 的内膜
基座［15， 16］。
利 用 SignalP 4.0 Server 程 序 对 VscO 氨 基 酸 序
439
379
319
259
199
139
79
19
42102 35
43
18
78
138
198
258
318
378
438
462
*
10 SD
* 代表终止子，浅灰色阴影部分为酪蛋白激酶 II 磷酸化位点，方框部分为蛋
白激酶 C 磷酸化位点，单下划线为内质网靶信号位点，粗体部分代表酪氨
酸激酶磷酸化位点，椭圆形代表微体 C-末端靶信号位点
图 2 vscO 基因核苷酸及其编码的氨基酸序列
SycN
Vibrio alginolyticus
TyeA vopN vscN vscO vscP vscQ
图 3 vscO 基因在染色体相对排列顺序
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期158
同源性最低为 65%。氨基酸序列同源性比较（图 4）
表明 VscO 在弧菌中是相对保守的。利用 Neighbor-
joining 法，将推导的 VscO 氨基酸序列与其他微生物
构建系统进化树（图 5）发现，溶藻弧菌的 VscO 蛋
白可明显地与副溶血弧菌聚为同一亚族，表明它们
之间有较近亲缘关系，这与传统的形态学和生化特
V. alginolyticus.
V. parahaemolytic
V. tasmaniensis
V. tubiashii
V. caribbenthicus
V. azureus
V. alginolyticus.
V. parahaemolytic
V. tasmaniensis
V. tubiashii
V. caribbenthicus
V. azureus
V. alginolyticus.
V. parahaemolytic
V. tasmaniensis
V. tubiashii
V. caribbenthicus
V. azureus
图 4 vscO 基因推导的氨基酸序列与其他物种同源性比较
Yersinia pestis NP_395175.1
Yersinia pseudotuberculosis YP_001874686.1
Yersinia enterocolitica YP_004424925.1
Photorhabdus luminescens AAO18043.1
Aeromonas hydrophila AAS91809.1
Aeromonas salmonicida YP_001144299.1
▲Vibrio alginolyticus KJ179947
Vibrio parahaemolyticus NP_798048.1
Vibrio harveyi ZP_01985128.1
Vibrio campbellii ZP_10158556.1
Achromobacter xylosoxidans ZP_17006319.1
Bordetella pertussis NP_880887.1
Bordetella bronchiseptica ZP_18980910.1
Bordetella parapertussis NP_884483.1 69100
100
100
100
0.1
100
98
99
65
60
100
图 5 VscO 系统进化树
征分类结果一致。
2.5 VscO的三维结构
将 VscO 氨基酸序列提交至 SWISS-MODEL 程
序，自动搜索同源蛋白作模板，得到 VscO 单亚基
三级结构模型。结果见图 6-A，与其同源蛋白副溶
血弧菌 YscO 非常相似（图 6-B），都具有两个 α-螺
旋，不存在 β-折叠，在两个 α-螺旋之间含有一个转角。
两者的差别是 YscO 的第一个 α-螺旋的长度比 VscO
略长。
2.6 VscO的信号通路分析
采用 Kegg 软件对 VscO 的信号通路进行预测分
析，以细菌 T3SS 的信号通路为模板绘制溶藻弧菌
VscO 信号通路，见图 7。由图推测 VscO 位于Ⅲ型
分泌系统的“针状样”结构上与 VscP 和 VscX 相邻。
2.7 VscO蛋白的网络互作分析
应 用 STRING 数 据 库 搜 索 VscO 与 其 他 T3SS
蛋白的网络互作，结果见图 8。目前已知 vscO 与
vopD、vscP、vopB、vscS、vscN、vscT 具 有 同 时 生 成
2014年第6期 159庞欢瑛等 ：溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白 VscO 的基因克隆及其生物信息学分析
（cooccurrence）、 相 邻（neighborhood） 的 关 系， 其
他关系还有待研究（textmining），而与 vscQ、vscR、
vscX 仅有相邻的关系，它们的其他关系还有待挖掘，
下一步将对这些基因进行克隆和序列分析，初步了
解它们的功能。
3 讨论
Ⅲ型分泌系统是溶藻弧菌重要的毒力因子之一，
与细菌的致病性密切相关。病原菌黏附到宿主细胞
表面后，通过 T3SS 直接将特异性效应蛋白注入宿主
细胞内，改变宿主的各种生理功能，破坏宿主的组
织结构，达到能在宿主体内生存和繁殖的目的［17］。
T3SS 分子伴侣护航蛋白是最近鉴定的一种 T3SS
功能蛋白，其作用一方面是护航分子伴侣到相应的
位置，使分子伴侣以正确的方式与效应蛋白结合 ；
另一方面，在护航结束后，重新将分子伴侣释放出
来以便下一轮的循环，从而保证分子伴侣的重复利
用和效应蛋白的输出效率［18］。分子伴侣护航蛋白与
分子伴侣结合，作用是稳定分子伴侣性质和重复利
用分子伴侣［19］。
目前，对 T3SS 分子伴侣蛋白的研究不多，只
报道了少数几种。例如 ：耶尔森氏菌的 SycD［20］，
福氏志贺氏菌的 IpgC［21］和 Spa13［22］，鼠伤寒沙门
氏 菌（Salmonella typhimurium） 的 FliJ 和 InvI， 耶
尔森菌的 YscO 均为此类蛋白［10］。小肠结肠炎耶尔
森氏菌（Yersinia enterocolitica）的 YscO 是分子伴侣
SycD 的护航蛋白，其功能是护航 SycD 分子伴侣，
帮助转位子蛋白 YopB 和 YopD 参与到宿主细胞膜上
T3SS 针孔的形成［23］。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella
typhimurium） 的 FliJ， 它 是 鞭 毛 分 子 伴 侣 护 航 蛋
白，功能是将空载的分子伴侣转运给小纤维丝帽类
亚基和鞭毛钩，使得鞭毛顺利组装［18］。InvI 也是鼠
伤寒沙门氏菌中分子伴侣 SicA 的护航蛋白。经过
InvI 的护航，分子伴侣 SicA 帮助其效应蛋白 SipC 通
过 T3SS 的分泌，参与到宿主细胞膜上 T3SS 针孔的
形成［10］。
目前，虽然溶藻弧菌 T3SS 护航蛋白已有少量研
A
B
图 6 溶藻弧菌 ZJ03 VscO（A）与副溶血弧菌 YscO（B）
三维结构比较
ATP
VscQL VscN
VscVURTS
VscJ
VscC
VscOPX
VopB, VopD
VopN
ᇯѫ㓶㜎
䍘㟌
ཆ㟌
㟌
㓶㧼㓶㜎䍘
图 7 VscO 蛋白的信号通路图
vscP
vscT
vscX
vopB
vopDvscR
vscN
vscS
vscO
vscQ
Neighborhood
Gene Fusion
Cooccurrence
Coexpression
Experiments
Databases
Textmining
[Homology]
（颜色标识见电子版）
图 8 VscO 蛋白与其他 T3SS 蛋白的网络互作图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期160
究，但主要集中在其免疫功能上［24］，有关其详细的
生物信息学研究仍鲜见报道。本研究对 T3SS 系统中
分子伴侣护航蛋白 VscO 进行克隆和生物信息学分
析。结果表明，vscO 基因全长 462 bp，编码 153 个
氨基酸，理论分子量为 18.43 kD，理论 pI 值为 9.22。
BLAST 分析发现溶藻弧菌 VscO 与副溶血弧菌（V.
parahaemolyticus）VscO 氨基酸序列的同源性最高达
86%。信号通路分析推测 VscO 位于 T3SS 的“针状样”
结构上，推测其主要功能是是分子伴侣的护航蛋白，
但是其与分子伴侣的互作区域目前尚未清楚。我们
下一步将对 VscO 进行基因敲除，然后对野生株和缺
失株的生理生化特性进行分析，再应用蛋白质组学
技术分析缺失株和野生株的胞外分泌蛋白，从中筛
选 VscO 相关的分子伴侣和效应蛋白，并明确 VscO
与分子伴侣的互作区域，为阐明 T3SS 的护航机制奠
定基础。
4 结论
本研究从溶藻弧菌 ZJ03 成功克隆 T3SS 系统中
分子伴侣护航蛋白 VscO 的全基因序列。该基因全
长 462 bp，编码 153 个氨基酸，理论分子量为 18.43
kD，理论 pI 值为 9.22。VscO 位于外周质，无信号
肽和跨膜区。该氨基酸序列含有 2 个蛋白激酶 C 磷
酸化位点，1 个酪蛋白激酶 II 磷酸化位点，1 个酪
氨酸激酶磷酸化位点，1 个内质网靶信号位点，1 个
微体 C 末端靶信号位点。vscO 基因具 -35 和 -10 转
录起始区，以及翻译识别信号 SD 序列（Shine-Dalga-
rno sequence）。同源性分析表明与副溶血弧菌亲缘
关系较近。亚基三维结构模型显示其与副溶血弧
菌 YscO 蛋白有相似构型。信号通路分析推测其位
于 T3SS 的针状样结构上。蛋白网络互作图谱表明
VscO 与 10 种 T3SS 蛋白具有相邻关系。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）