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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
收稿日期 ：2014-05-30
基金项目 ：国家科技支撑计划（2012BAD17B02，2012 BAD17B03），广东省自然科学基金项目（S2013040014562）
作者简介 ：庞欢瑛，女，博士，讲师，研究方向 ：水产经济动物病害 ；E-mail ：phying1218@163.com
通讯作者 ：简纪常，男，博士，教授，研究方向 ：水产经济动物免疫学及病害控制 ；E-mail ：jianjc@gmail.com
二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydr-
ogenase，DLDH）又称硫辛酰胺脱氢酶或二氢硫辛
溶藻弧菌 dldh 基因突变株的构建及其生物学功能研究
庞欢瑛1，2，3  陈立明1，2，3  黄郁葱1，2，3  简纪常1，2，3   
鲁义善1，2，3  吴灶和2，3，4
（1. 广东海洋大学 水产学院，湛江 524088 ；2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088 ；3. 广东省教育厅水
产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088 ；4. 仲恺农业工程学院，广州 510225）
摘 要： 为揭示二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH）在溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）致病中的作用，
以 pRE112 自杀质粒为载体，应用插入失活突变法构建 dldh 基因插入突变株，比较分析了野生株 ZJ03 与缺失株 ZJ03Δdldh 在生长、
泳动能力、酶活性、生物膜形成、致病性的表现。结果表明，dldh 基因的突变，使溶藻弧菌生长的迟缓期延长、泳动能力显著减
弱（P<0.05），酶活性显著降低（P <0.05），生物膜生成显著减少（P <0.05），对石斑鱼（Epinephelus coioides）的致病性也明显减弱
（P <0.05）。本研究为从细菌能量代谢角度研究弧菌的致病机制提供理论依据。
关键词 ： 溶藻弧菌 dldh 缺失株 生物特性
Construction and Characterization of a Mutant of Vibrio alginolyticus
ZJ03 Δdldh Strain
Pang Huanying1，2，3 Chen Liming 1，2，3 Huang Yucong 1，2，3 Jian Jichang1，2，3 Lu Yishan1，2，3 Wu Zaohe2，3，4
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088 ；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology
and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088 ；3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals
of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088 ；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，
Guangzhou 510225）
Abstract: Vibrio alginolyticus, a gram-negative bacterium has been described to be among the most common and economically important
aquatic pathogen of fish and shellfish. Dihydrolipoamide dehydrogenase （DLDH）is homodimeric flavoproteins that catalyse the NAD+
dependent reoxidation of dihydrolipoamide in a number of multienzyme complexes. This enzyme classically involved in energy metabolism. To
identify DLDH’s role during infection, dldh gene deletion strain （ZJ03Δdldh）were constructed using the insertion mutation method. With the
pRE112 suicide plasmid as the carrier, the Overlap PCR and homologous recombination technology were used to construct the mutant strains.
Furthermore, the changes of the physiology and pathogenicity of ZJ03Δdldh mutant strains compared with the strain ZJ03, such as growth,
swarming ability, biofilm and LD50 were investigated. The growth curve showed that the mutant grew slowly in lag phase compared to the wild-
type strain, and the swarming ability, enzyme activity and biofilm formation of ZJ03Δdldh mutant strains showed significant reduced（P<0.05）.
The fish lethal test showed that the virulence of the ZJ03Δdldh mutant strains was 102 times lower than the ZJ03 strain. In conclusion, the
ZJ03Δdldh mutant strains were constructed successfully, and this study showed that enzymes classically involved in energy metabolism may play
an important role in pathogenic mechanism of V. alginolyticus.
Key words: Vibrio alginolyticus dldh mutant Biological characteristics
酸脱氢酶，它广泛存在于各种生物中，主要分布在
生物的线粒体或质膜中［1］。DLDH 是 3 种 a 丙酮酸
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期162
脱氢酶复合体不可或缺的组成部分，它与谷光甘肽
还原酶、汞还原酶［2］、硫氧还蛋白和锥虫胱甘肽还
原酶（Trypanothione reductase）［3］同属黄素蛋白氧
化还原酶家族［4］，在能量代谢中起重要作用。然
而，近年来的研究发现 DLDH 不仅行使氧化还原酶
的功能，在细菌感染过程中也起重要作用。在猪链
球 菌（Streptococcus suis） 中，DLDH 为 膜 蛋 白， 是
介导细菌粘附的重要成分之一［5］，参与感染的发
生。在鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）中，
DLDH 是毒力决定因子之一［6］。DLDH 在肺炎链球
菌（Streptococcus pneumoniae）中与几种糖类的运输
有关，dldh 的缺失导致肺炎链球菌不能输入和利用
半乳糖、绵子糖和水苏糖，而且几乎丧失感染动物
的能力［7］。由此可见 DLDH 虽然不编码毒力因子，
但在细菌感染中起重要作用。
溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种革兰氏
阴性短杆菌，广泛存在于海水中，是水生动物弧菌
病的主要病原菌之一［8-10］，给水产养殖业造成巨大
经济损失。此外，该菌可导致人类的腹泻、中耳炎
以及败血症等多种疾病［11-12］，严重危害人类健康。
与其他病原菌一样，弧菌的致病性主要取决于
其与宿主之间的相互作用。弧菌通过黏附侵袭，在
宿主体内增殖，产生毒素等过程，造成宿主正常功
能紊乱而引起死亡等。目前对溶藻弧菌致病机制的
研究主要集中在毒力因子的研究上，但是现已证明，
一些弧菌的毒力相关基因被敲除后，细菌仍然具有
感染力［13］。可见，弧菌的感染是由复杂的调控机制
控制的，不仅仅取决于毒力因子。本研究以溶藻弧
菌强毒株 ZJ03 为对象，通过基因重组技术构建 dldh
基因插入缺失突变株，并通过与野生株的对比研究，
探讨 DLDH 的生物学功能的改变，为从能量代谢角
度研究弧菌的致病机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 溶藻弧菌野生株 ZJ03，由本
试验室从广东省湛江港海域患病红笛鲷（Lutjanus
erythopterus） 鱼 体 中 分 离 并 保 存［14］；大 肠 杆 菌
MC1061（λpir） 和 S17-1（λpir） 自 杀 质 粒 pRE112
由中国科学院水生生物研究所谢海侠老师惠赠。
1.1.2 试 剂 TIANamp Bacteria DNA Kit 购 自 北 京
天根生化科技有限公司。Ex Taq DNA 聚合酶、T4
DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司。Easy Pfu DNA 聚合
酶、Easy PureTM Quick Gel Extraction Kit、Easy PureTM
Plasmid MiniPrep Kit t 购自北京全式金生物技术有限
公司。所有的引物合成和序列分析均由上海生工生
物技术服务有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 溶藻弧菌总 DNA 的提取 将溶藻弧菌 ZJ03
菌株涂布于 TSA 平板，挑选单菌落接种于 TSB（2%
NaCl）培养基，28℃振荡培养 18 h。取 1 mL 菌液于
离心管中，10 000 r/min 离心 5 min 收集菌体，参照
试剂盒说明书提取基因组 DNA，-20℃保存备用。
1.2.2 溶 藻 弧 菌 dldh 基 因 片 段 的 克 隆 根 据
GenBank 上登录的溶藻弧菌 dldh 基因序列（登录号
为 AGK62253）设计 1 对引物 ：上游引物 P1 ：CGG-
GGTACCTTTGGGACTCTACTGACGCTCT（下划线为
Kpn I 位点），下游引物 P2 ：CGAGCTCCGCTTCTTTT-
TCAGTCTTACCAAC（下划线为 Sac I 位点），以提取
的溶藻弧菌总 DNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增包
含部分 NADH 及 FAD 结合区域的片段，预计片段长
度为 615 bp。反应条件为 ：94℃预变性 4 min ；94℃
40 s，65℃ 40 s，72℃ 60 s，共 31 个循环，再 72℃
延伸 10 min。PCR 产物经 1 % 琼脂糖凝胶电泳检验
后，用 DNA 胶回收试剂盒切胶回收。
1.2.3 自杀质粒 PRE112 的提取 使用全士金公司
的 Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit 试剂盒提取 pRE112
质粒，-20℃保存。
1.2.4 酶切及产物纯化回收、连接 将回收扩增
片段及提取质粒，利用限制性内切酶 Kpn I 和 Sac I
分别进行酶切。将酶切回收后的 dldh 缺失片段与
pRE112 质粒载体通过 T4 连接酶连接构建重组自杀
质 粒 pRE-Δdldh， 并 转 化 入 E. coli MC1061 感 受 态
细胞。
1.2.5 溶藻弧菌突变株的构建 （1）分别培养含
有 pRE- △ dldh 质粒的大肠杆菌 S17-1 和野生型溶藻
弧菌 ZJ03 至 OD600 达到 0.5。（2）分别取 200 μL 大
肠杆菌 S17-1 和 50 μL 溶藻弧菌混匀，6 000 r/min 离
心 5 min，彻底去上清，加入 60 μL TSB 液体培养
2014年第10期 163庞欢瑛等：溶藻弧菌 dldh基因突变株的构建及其生物学功能研究
基重悬菌体，将细菌按 30 μL/spot 接种于无抗性的
TSA 固体培养基平板上，置于 28℃恒温培养箱过夜
培养。（3）将 TSA 平板上的菌落用 TSB 液体培养基
冲洗下来，并稀释接种于含有氯霉素（Cm 终浓度
为 25 μg/mL）的平板上，28℃培养箱静置培养 48 h。
（4）挑取单菌落，以 dldh 片段引物 P1、P2，氯霉素
基 因 引 物 Cm1（GGCCCTAA TACCTGTGACGGAAG-
AT）、Cm2（CGGGCCCTATCACTTATTCAGGCGT）以
及 Cm1、P2 进 行 PCR， 反 应 条 件 为 ：94 ℃ 预 变 性
4 min ；94℃ 40 s，61℃ 40 s，63℃ 40s，72℃ 60 s，
共 31 个循环，再 72℃延伸 10 min，筛选插入突变
株并命名为 ZJ03 △ dldh。
1.2.6 突变株的遗传稳定性检验 将插入突变株
△ dldh 在 TSA 培养基上连续传代培养 40 代，利用
引物 Cm1、Cm2 和 Cm1、P2，PCR 检测突变株第 40
代的插入片段的遗传稳定性。
1.2.7 突变株与野生株生长曲线的比较 将插入
突 变 株 ZJ03 △ dldh 与 野 生 株 ZJ03 分 别 接 种 于 新
鲜 TSB 培养基，28℃过夜培养，将吸光值调至 0.5
（OD600），按照 1∶100 的比例分别接种到含有新鲜
培养基的干净试管中（各 18 支），28℃震荡培养，
每隔 1 h 将对应试管取出测定 OD600 值。以时间为横
坐标，以吸光值为纵坐标，绘制生长曲线，试验重
复 3 次。
1.2.8 细菌泳动检测 挑取野生株溶藻弧菌及插入
突变株 ZJ03 △ dldh 的单菌落，接种于含琼脂 0.3%
的 TSA 的平板上。28℃恒温培养箱过夜培养，测定
泳动圈直径，试验重复 3 次。
1.2.9 酶活测定 二氢硫辛酰胺脱氢酶活性测定参
照文献 ［15］进行，具体方法如下。
（1）分别培养野生株溶藻弧菌及插入突变株
△ dldh 至 OD600 为 0.5，然后分别进行超声波破碎，
取等量上清。（2）按照以下混合反应液，首先在
试管中加入 50 mmol/L、pH7.0 的磷酸盐缓冲液 2.7
mL，于 37 ℃水浴保温 10 min，依次加入 0.6 mmol/L
硫辛酰胺 0.1 mL、1 mmol/L NADH 0.1 mL 和蛋白液 0.1
mL，立即混匀，使用紫外分光光度计于 340 nm 处
检测吸光值，每 5 min 读数 1 次，连续测定 15 min。
每组试验重复 3 次，取平均值。二氢硫辛酰胺脱氢
酶活性单位定义为 ：在上述反应条件下每 min 氧化
1 μmol NADH 所需的酶量，为一个酶活性单位（U）。
试验重复 3 次。
1.2.10 生物膜检测 生物膜检测方法参照文献［16］。
将溶藻弧菌野生株及突变株单菌落划线接种于 TSA
平板上，28℃恒温培养过夜。用 2 mL 新鲜液体 TSB
培养基冲洗平板，调 OD600 至 0.5。用新鲜液体培养
基将菌液以 1∶20 的比例稀释，然后接种到 96 孔板
中，每孔 300 μL，每菌种设 6 个平行。阴性对照为
等量 TSB 液体培养基。将 96 孔板置于 28℃恒温培
养箱，静置培养 48 h。无菌去离子水洗涤 96 孔板，
每孔加 300 μL，每次洗涤轻敲并倒置晾干，连续 3
次。每孔加 150 μL 甲醇，进行 20 min 固定，室温晾
干，倒置 30 min。每孔加 150 μL 结晶紫草酸铵染液
室温染色 15 min，自来水小心冲洗，直至流水澄清，
室温晾干。每孔小心加入 150 μL 95% 的酒精，室温
放置 30 min，测定 OD570。试验重复 3 次。
1.2.11 半致死率（LD50）检测 利用斜带石斑鱼
考察 ZJ03 和 ZJ03Δdldh 的致病力，具体操作如下 ：
分别接种 ZJ03 和 Δdldh 的单菌落至 TSB 液体培养
基中 28℃，200 r/min 摇床培养 18 h，10 000×g 离
心 5 min，收集菌液沉淀，用 pH7.2 的 PBS 清洗沉
淀 3 次。 用 PBS 调 OD600 至 0.5， 菌 液 的 浓 度 约 为
108 CFU/mL。将两株细菌菌液分别用 PBS 稀释至 0、
104、105、106、107、108 CFU/mL，每个浓度注射 20 尾，
每尾鱼腹腔注射 0.1 mL。记录 15 d 内鱼体死亡数目。
观察死鱼症状，并分离死鱼体内的细菌于 TSA 平板
上培养，PCR 检测 16S rDNA，测序后确认死于溶藻
弧菌感染。参照改进寇氏法计算半数致死量 ：
lgLD50=Xk － d（∑ Pi － 0.5）
其中，Xk 为最大对数剂量，d 为相邻的两组对
数剂量之差数，Pi 为死亡率，i 为组号。
2 结果
2.1 插入突变株的构建
利用引物 P1、P2 克隆 dldh 基因 615 bp 片段（图
1-A），将其插入自杀质粒载体 pRE112 中，并通过
同源重组插入溶藻弧菌基因组 DNA 中。利用引物
Cm1、Cm2 通过菌落 PCR 检测，可以在溶藻弧菌中
扩出 936 bp 的氯霉素条带（图 1-B），而利用 Cm1、
P2 引物可以扩增得到长度为 1 596 bp 的目的条带，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期164
说明插入突变株构建成功（图 1-C）。
体浓度 OD600 均在 2.7 左右（图 3）。从生长曲线可
以看出，dldh 基因的突变对细菌生长的影响主要表
现在迟缓期，进入指数期后生长情况与野生株差别
不大。
（A）M ：DNA Marker DL 2000 ；1-3 ：PCR products of insertional ；（B）M ：
DNA Marker DL 2000 ；1-3 ：Cm PCR products ；（C）M ：DNA Marker DL 2000 ；
1-3 ：Mutant type
图 1 插入突变株 ZJ03 △ dldh 构建过程
2.2 插入失活突变株遗传稳定性检测
将突变株 ZJ03 △ dldh 在 TSA 平板上连续传代
培养 40 代，利用引物 Cm1、Cm2 和 Cm1、P2 检测突
变株的遗传稳定性。结果表明，突变株在培养 40 代
后仍能能扩出 936 bp 氯霉素条带（图 2-A）和 1 596
bp 的插入片段（图 2-B），表明插入片段可以在溶藻
弧菌中稳定遗传。
2.3 生长曲线的测定
通过对溶藻弧菌野生株及插入突变株△ dldh 在
TSB 培养基中的生长曲线进行比较可以看出，dldh
基因的突变对溶藻弧菌的生长具有一定的影响。在
迟缓期，野生株经过 5 h 生长后 OD600 达 0.5，而突
变株 OD600 达 0.5 时需要 7 h ；在指数期，野生株经
过 10 h 生长后 OD600 达 2，而突变株 OD600 达 2 时需
要 11 h ；在稳定期，两株细菌在经过 27 h 生长后菌
（A）M ：DNA Marker DL 2000 ；1-3 ：Cm PCR products ；（B）M ：DNA
Marker DL 2000 ；1-3 ：Mutant type PCR products
图 2 ZJ03 △ dldh 的遗传稳定性分析
图 3 野生株和突变株的生长曲线
2000
bp
M 1 2 3
615
bp
bp
bp
1000
750
500
250
100
2000
bp
M 1 2 3
9361000
750
500
250
100
2000
bp M
A
B
C 1 2 3
1596
1000
750
500
250
100
2000
bp
MA 1 2 3 4 5
936
bp
bp
1000
750
500
250
100
2000
bp
MB 1 2 3
1596
1000
750
500
250
100
3.0
2.0
1.0
0.5
1.5
O
D
60
0
2.5
0
0 5 10 15ᰦ䰤h 20 25 30
Δdldh䟾⭏Ṛ
2.4 细菌泳动试验
将野生溶藻弧菌 ZJ03 与突变株 ZJ03 △ dldh 接
种于泳动平板上，其泳动结果如图 4 所示。野生株
泳动圈为 3.51±0.15，突变株为 2.11±0.22，根据泳
动圈直径统计分析可知 dldh 缺失后溶藻弧菌的泳动
能力显著降低（P<0.05）。
2.5 酶活测定
通过酶活性测定发现，突变株 ZJ03 △ dldh 单
位活性为（0.091±0.005）U/mg，而野生株单位酶活
2014年第10期 165庞欢瑛等：溶藻弧菌 dldh基因突变株的构建及其生物学功能研究
性为（0.316 ±0.008）U/mg，可见敲除株酶活性显
著降低（P<0.05），dldh 的突变会影响溶藻弧菌的二
氢硫辛酰胺脱氢酶活性。
2.6 生物膜检测
通过检测发现，溶藻弧菌野生株与突变株的生
物膜形成能力如图 5 所示。两株弧菌的生物膜形成
有显著差异（P<0.05），说明 dldh 的缺失会影响溶
藻弧菌生物膜的形成。
dldh 插入失活突变株，将 dldh 内部包含部分 NADH
及 FAD 结合区域的片段克隆到自杀载体 pRE112 上，
通过接合转移，利用同源重组将载体质粒整合于溶
藻弧菌染色体上，构建插入失活突变株 ZJ03Δdldh，
并对其相关的生物学变化进行了比较研究。
dldh 作为能量代谢关键酶类，对生物的生长
起着重要的作用。在对肺炎链球菌的研究中发现，
dldh 的缺失使细菌在棉子糖和水苏糖为唯一碳源的
培养基上的生长显著下降［18］。在本研究中 dldh 基
因的突变对细菌生长的影响主要表现在迟缓期的延
长上，这可能是由于 dldh 的缺失造成初始期的能量
代谢障碍所致 ［7］。
端生鞭毛以及众多的周生鞭毛都会影响弧菌的
泳动力。而细菌的鞭毛泳动能力与黏附力和侵袭力
相关［19］。在猪链球菌的研究中发现，dldh 在猪链球
菌黏附细胞的过程中发挥重要作用［5］。在布氏锥体
虫中，研究者发现 dldh 基因在鞭毛区域大量分布［20］。
在本研究中，ZJ03Δdldh 的泳动力显著减弱，表明
dldh 与溶藻弧菌的泳动能力相关联。
生物膜的形成是细菌定植在宿主细胞膜表面，
从而导致耐药性和免疫防御的一种多细胞行为［21］。
弧菌生物膜的形成与一些特定的结构（纤毛、鞭毛
和胞外多糖等）以及复杂的调控系统息息相关［22］。
对叶缘焦枯病菌（Xylella fastidiosa）体外生物膜形
成过程研究发现，dldh 基因的表达量显著提高［23］。
在本研究中，我们发现 ZJ03Δdldh 缺失株和野生株
的生物膜形成差异显著（P<0.05），提示 dldh 参与
了溶藻弧菌生物膜的形成过程。
对肺炎链球菌研究表明 dldh 的缺失使 DLDH 酶
活性完全丧失［18］，本研究也发现溶藻弧菌 dldh 的
NADH 及 FAD 结合区域突变后显著影响细菌 DLDH
酶活性（P<0.05）。此外，dldh 缺失的肺炎链球菌还
丧失了对小鼠的感染力［18］，本研究发现溶藻弧菌
dldh 的缺失显著影响细菌的致病性，表现为对斜带
石斑鱼的 LD50 下降约 100 倍。总之，本研究初步表
图 4 野生株和突变株的泳动能力
2.7 LD50检测结果
将 ZJ03 和 ZJ03Δdldh 分别注射斜带石斑鱼，攻
毒结果如表 1 所示。由试验结果可知，dldh 的缺失
使野生型溶藻弧菌的毒力下降约两个数量级。LD50
检测结果表明，dldh 影响了溶藻弧菌的致病力。毒
力下降的原因可能是由于缺失株在鱼体内的能量代
谢受阻，对鱼体内环境的适应性降低，增值能力减弱，
从而导致感染力下降。
3 讨论
突变株的构建方法主要有一次同源重组和二次
同源重组方法［17］。本试验采用一步同源重组法构建
图 5 野生株和突变株的生物膜
ZJ03
△dldh
ᰦ䰤h
䟾⭏Ṛ
Δdldh
0.25
0.15
0.05
0.10O
D
57
0
0
0 10 20 30 40 50
0.20
表 1 不同菌株的 LD50
Characteristics LD50 （CFU/fish）
ZJ03 2.25×105
Δdldh 2.35×107**
** ：P<0.01
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期166
明 dldh 作为能量代谢基因在溶藻弧菌的致病中起一
定作用，但后续仍需要补充更多的致病相关试验来
阐明其致病机理。
4 结论
本研究成功构建 dldh 基因插入突变株 ZJ03Δdl-
dh。与野生株的对比研究表明，该突变株生长的迟
缓期延长、泳动能力显著减弱（P<0.05），酶活性显
著降低（P<0.05），生物膜生成显著减少（P<0.05），
对石斑鱼的致病性也明显减弱（P<0.05）。
参 考 文 献
［1］Moran JF, Sun Z, Sarath G, et al. Molecular cloning, functional
characterization, and subcellular localization of soybean nodule
dihydrolipoamide reductase［J］. Plant Physiology, 2002, 28 （1）：
300- 313.
［2］Fox B, Walsh CT. Mercuric reductase. Purification and characteriza-
tion of a transposon -encoded flavoprotein containing an oxidation-
reduction-active disulfide［J］. The Journal of Biological Chemistry,
1982, 257（5）：2498-2503.
［3］Shames SL, Fairlamb AH, Cerami A, et al. Purification and
characterization of trypanothione reductase from Crithidia
fasciculata, a newly discovered member of the family of disulfide-
containing flavoprotein reductases［J］. Biochemistry, 1986, 25（12）：
3519-3526.
［4］Williams CH Jr, Zanetti G, Arscott LD, et al. Lipoamide
dehydrogenase, glutathione reductase, thioredoxin reductase, and
thioredoxin ［J］. The Journal of Biological Chemistry, 1967, 242
（22）：5226-5231.
［5］张静 , 孙建和 . 猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及
其粘附相关功能初探［J］. 上海交通大学学报 ：农业科学版 ,
2012, 29（2）：34-40.
［6］Hudson P, Gorton TS, Papazisi L, et al. Identification of a virulence-
associated determinant, dihydrolipoamide dehydrogenase （lpd）, in
Mycoplasma gallisepticum through in vivo screening of transposon
mutants ［J］. Infection and Immunity, 2006, 74（2）：931-939.
［7］Tyx RE, Roche-Hakansson H, Hakansson AP. Role of dihydrolipoa-
mide dehydrogenase in regulation of raffinose transport in Streptoco-
ccus pneumoniae［J］. Journal of Bacteriology, 2011, 193（14）：
3512-3524.
［8］Sadok K, Mejdi S, Nourhen S, et al. Phenotypic characterization
and RAPD fingerprinting of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio
alginolyticus isolated during Tunisian fish farm outbreaks［J］.
Folia Microbiol （Praha）, 2013, 58（1）：17-26.
［9］Chang CC, Yeh MS, Lin HK, et al. The effect of Vibrio alginolyticus
infection on caspase-3 expression and activity in white shrimp
Litopenaeus vannamei［J］. Fish and Shellfish Immunology, 2008,
25（5）：672-678.
［10］Ben Kahla-Nakbi A, Chaieb K, Bakhrouf A. Investigation of several
virulence properties among Vibrio alginolyticus strains isolated
from diseased cultured fish in Tunisia［J］. Diseases of Aquatic
Organisms, 2009, 86（1）：21-28.
［11］Campanelli A, Sanchez-Politta S, Saurat JH. Cutaneous ulceration
after an octopus bite ：infection due to Vibrio alginolyticus,
an emerging pathogen［J］. Annales de Dermatologie et de
Venereologie, 2008, 135（3）：225-227.
［12］Sganga G, Cozza V, Spanu T, et al. Global climate change and
wound care ：case study of an off-season Vibrio alginolyticus
infection in a healthy man ［J］. Ostomy Wound Manage, 2009, 55
（4）：60-62.
［13］Le Roux F, Binesse J, Saulnier D, et al. Construction of a Vibrio
splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a
novel counterselectable suicide vector［J］. Applied and Environ-
mental Microbiology , 2007 , 73（3）：777-784.
［14］Cai SH, Lu YS, Wu ZH, et al. Loop-mediated isothermal
amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus,
the causative agent of vibriosis in mariculture fish［J］. Letters in
Applied Microbiology, 2010, 50（5）：480-485.
［15］Yan LJ, Thangthaeng N, Forster MJ. Changes in dihydrolipoamide
dehydrogenase expression and activity during postnatal develop-
ment and aging in the rat brain ［J］. Mechanisms of Ageing and
Development, 2008, 129（5）：282-290.
［16］狄慧玲 , 陈偿 , 石磊 . 溶藻弧菌 OP/Tr 变体生物被膜形成能力
及其相关因素的比较研究［J］. 现代食品科技 , 2010, 26（11）：
1177-1180.
［17］李今煜 , 陈健铭 , 彭振坤 . 几种常用的基因敲除技术［J］. 武
夷科学 , 2008, 23（1）：187-190.
［18］Smith AW, Roche H, Trombe MC, et al. Characterization of the
dihydrolipoamide dehydrogenase from Streptococcus pneumoniae
and its role in pneumococcal infection. Molecular Microbiology,
2014年第10期 167庞欢瑛等：溶藻弧菌 dldh基因突变株的构建及其生物学功能研究
2002, 44（2）：431-448.
［19］Meadows PS. The attachment of bacteria to solid surfaces［J］.
Archiv für Mikrobiologie, 1971, 75（4）：374-381.
［20］Jackman SA. Dihydrolipoamide dehydrogenase in Trypanosoma
brucei ［D］. University of Bath （United Kingdom）, 2009.
［21］于丹 . 金黄色葡萄球菌 Al-2 群体感应以 icaR 依赖的方式减弱
生物膜形成［D］. 合肥 ：中国科学技术大学 , 2013.
［22］Yildiz FH, Visick KL. Vibrio biofilms ：so much the same yet so
different ［J］. Trends in Microbiology, 2009, 17（3）：109-118.
［23］Souza AA, Takita MA, Coletta-Filho H D, et al. Gene expression
profile of the plant pathogen Xylella fastidiosa during biofilm
formation in vitro［J］. FEMS Microbiology Letters, 2004, 237（2）：
341-353.
（责任编辑 李楠）