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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):143-149
收稿日期 ：2015-01-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31402344），广东省自然科学基金项目（S2013040014562）
作者简介 ：庞欢瑛，女，博士，讲师，研究方向 ：水产经济动物病害控制 ；E-mail ：phying1218 @163.com
通讯作者 ：丁燏，男，博士，教授，研究方向 ：水产经济动物病害控制 ；E-mail ：dingy @gdou.edu.cn
简纪常，男，博士，教授，研究方向 ：水产经济动物病害控制 ；E-mail ：jianjc @gmail.com
溶藻弧菌转运蛋白 TolB 的免疫原性与免疫保护性
庞欢瑛1，2  周泽军1，2  张燕飞1，2  李静1，2  邱明生1，2  丁燏1，2   
简纪常1，2  吴灶和2，3
（1. 广东海洋大学水产学院，湛江 524088 ；2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 广东省教育厅水产经济动物病害控制
重点实验室，湛江 524088 ；3. 仲恺农业工程学院，广州 510225）
摘 要 ： 旨在研究溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901 转运蛋白 TolB 作为疫苗候选抗原的可能性，根据已发表的全基因
组序列，设计特异性引物 PCR 扩增 tolB 的基因全长序列。序列分析显示，该基因（GenBank 登录号 JQ846501）全长 1 353 bp，共
编码 450 个氨基酸残基。BLAST 分析发现，溶藻弧菌 tolB 基因与其他已知弧菌的 tolB 具有较高的同源性，序列保守，可作为共同
抗原候选蛋白。用原核表达的 tolB 蛋白免疫 SPF 级小鼠，制备多克隆抗体，ELISA 效价达 1∶40 000。免疫印迹表明鼠抗 tolB 血清
能与诱导后的重组蛋白发生特异反应。为进一步研究 tolB 对石斑鱼（Epinephelus awoara）的免疫保护性，用 TolB 蛋白两次免疫石
斑鱼，ELISA 检测发现，免疫石斑鱼血清的抗体效价在第 4 周达到峰值（1∶2 048）。攻毒实验结果表明 TolB 对石斑鱼的免疫保护
率为 76%。结果表明，溶藻弧菌转运蛋白 TolB 具有较好的免疫原性和免疫保护性，可作为弧菌亚单位疫苗的候选抗原。
关键词 ： 溶藻弧菌 ；tolB 基因 ；免疫原性 ；免疫保护
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.021
Immunogenicity and Immunoprotection of Translocation Protein B
（TolB）in Vibrio alginolyticus
Pang Huanying1，2 Zhou Zejun1，2 Zhang Yanfei1，2 Li Jing1，2 Qiu Mingsheng1，2 Ding Yu1，2
Jian Jichang1，2 Wu Zaohe2，3
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088 ；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology
and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher
Education Institutions，Zhanjiang 524088 ；3. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）
Abstract: To investigate the possibility of translocation protein B（TolB）from Vibrio alginolyticus HY9901 as a candidate antigen for
vaccine production, the full length tolB gene was amplified by PCR and designed specific primers according to the whole genome sequence of V.
alginolyticus published in GenBank. Sequence analysis revealed that tolB gene was 1 353 bp and encoded a putative protein of 450 amino acids
（GenBank accession number ：JQ846501）. BLAST analysis showed that the tolB of V. alginolyticus had high genetic relationship with other
known Vibrio, its sequence was conservative, and might be a common antigen candidate protein. The TolB protein of prokaryotic expression was
injected into SPF mice to prepare polyclonal antibody, and its titer of ELISA reached 1∶40 000. Western blot indicated that TolB serum reacted
specifically with the induced recombinant protein. Further the TolB protein was used as an antigen to immunize grouper（Epinephelus awoara）
twice, and ELISA detection found that the antibody titer of the immunized grouper increased to the highest（up to 1∶2 048）in the fourth
week. Challenge assay test showed that the immunoprotection rate of TolB to E. awoara was 76%. Therefore the TolB of V. alginolyticus has solid
immunogenicity and immunoprotection, and it can be used as a candidate antigen for vaccine of Vibrio subunits.
Key words: Vibrio alginolyticus ；tolB gene ；immunogenicity ；immunoprotection
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7144
溶藻弧菌是一种嗜盐嗜温性、兼性厌氧的革兰
氏阴性短杆菌，广泛分布于世界各地，是水生动物
弧菌病的主要病原菌之一［1-3］。近年来，随着养殖
环境的持续恶化，溶藻弧菌病不断暴发，给水产养
殖业造成巨大经济损失。此外，该菌可导致人类的
食物中毒等多种疾病［4，5］，严重危害人类健康。
长期以来，针对弧菌病的防治仍然以化学药物
及抗生素为主，但由此导致的药物残留及细菌耐药
问题也日趋严重，因此寻找免疫原性更强，保护力
更高，毒副作用更低的基因工程亚单位疫苗渐受关
注［6，7］。目前利用疫苗预防弧菌病的研究已取得进展，
灭活菌体、脂多糖、鞭毛蛋白等菌体成分被证明具
有良好的免疫原性［8-10］，一些亚单位疫苗、减毒疫
苗、DNA 疫苗也显示了良好的免疫保护［7，8，11］。但
在实际生产应用中发现，一种疫苗难以防治溶藻弧
菌种内众多血清型的感染，更不用说防治其他弧
菌的感染，因此只有制备跨科属种而不仅仅是种内
保护作用的疫苗才能满足海水养殖弧菌病防制治的
需要。
Tol-Pal（Translocation-Peptidoglycan associated
lipoprotein）系统是革兰氏阴性菌高度保守的膜蛋
白系统之一，主要由 5 个相互接触的蛋白组成，分
别 是 转 运 蛋 白 TolB 蛋 白（Translocation protein B）、
Pal 蛋白、TolA 蛋白、TolR 蛋白和 TolQ 蛋白，其中
TolA 蛋白、TolQ 蛋白和 TolR 蛋白组成了细菌的内
膜蛋白复合体，而 TolB 蛋白和 Pal 蛋白则组成了细
菌外膜复合体［12］。Tol-Pal 系统确切功能目前尚不
十分清楚，一般认为该系统对于维持革兰氏阴性菌
细胞膜的完整性和稳定性非常重要［13］，此外，一些
研究认为该系统其也参与细菌的致病过程。在大肠
杆菌内，Tol-Pal 系统的主要功能是将 A 类大肠杆菌
毒素输送至胞外并转运至敏感的宿主靶细胞内，最
后导致细胞的死亡［14］。在霍乱弧菌（Vibrio cholera）
中，Tol-Pal 系统负责转运霍乱毒素进入宿主细胞，
从而发挥其毒力［15］。在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella
enterica serovar Typhimurium）中，Tol-Pal 系统提高其
耐受胆盐的能力，保证其顺利地侵染宿主［16］。Tol-
Pal 系统中的 TolB 位于细胞膜表面，广泛与外界接
触，而且又是病原菌转运毒素的必要装置，推测其
极可能是一种共同抗原。但纵观国内外，目前鲜见
关于溶藻弧菌 Tol-Pal 系统的免疫原性和免疫保护性
的相关研究报道。本试验在项目组已完成 TolB 体外
异源表达［17］的基础上，进一步研究 TolB 蛋白的免
疫原性和对石斑鱼的免疫保护性，以期为高效亚单
位疫苗的制备奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 载体和菌株 溶藻弧菌强毒株 HY9901，由
本 实 验 室 自 广 东 湛 江 海 域 患 病 红 笛 鲷（Lutjanus
sanguineus）鱼体中分离并保存［18］；大肠杆菌 BL21
（DE3）和表达载体 pET-28a（+）由本实验室保存 ；
克隆载体 pMD18-T 购自 TaKaRa 公司。
1.1.2 实验动物 SPF 级 8 周昆明小鼠（22.5±2.5）
g 购自广东医学院实验动物中心，在温度 18-22℃，
相对湿度 50%-60% 条件下，饲养一周后进行实验。
健 康 石 斑 鱼（Epinephelus awoara） 体 重（15±2）g
购自湛江某鱼场，在水温 20℃下，每日投喂小杂鱼，
室内暂养一周后用于实验。
1.1.3 主要试剂 Ex Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa
公 司 ；BamH I 和 Sal I 等 限 制 性 核 酸 内 切 酶、T4
DNA 连接酶等购自 NEB 公司 ；预染蛋白 Marker 为
Fermentas 公司产品 ；细菌基因组 DNA 提取试剂盒、
DNA 胶回收试剂盒购自天根公司 ；其余试剂均为进
口或国产分析纯 ；PCR 引物合成和序列测定均由上
海生工生物技术服务有限公司完成 ；抗生素使用浓
度为：氨苄西林（Amp）100 μg/mL、卡那霉素（Kan）
50 μg/mL。
1.2 方法
1.2.1 溶藻弧菌 HY9901 总 DNA 的提取和 tolB 基因
的扩增 将溶藻弧菌 HY9901 菌株涂布于大豆酪蛋
白琼脂培养基（TSA）平板上，挑选单菌落接种于
TSB（5% NaCl）培养基，28℃振荡培养 12 h 以上。
取 适 量 菌 液 于 Ependoff 离 心 管 中，10 000 r/min 离
心 1 min 收集菌体，参照试剂盒说明书提取基因组
DNA。根据 GenBank 上登录的溶藻弧菌全基因序列
（ACCESSION ：NZ_AAPS00000000）设计一对引物，
上游引物 P1 为：5-ATGATTAGACGCCTTTTACTA-3，
下 游 引 物 P2 为 ：5-CTACAAAAACGGTGACCA-3。
PCR 反 应 条 件 为 ：94℃ 预 变 性 4 min ；94℃ 30 s，
2015,31(7) 145庞欢瑛等 ：溶藻弧菌转运蛋白 TolB 的免疫原性与免疫保护性
55℃ 30 s，72℃ 90 s， 共 35 个 循 环 ；72℃ 延 伸 10
min。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检验后切胶回
收，然后克隆至 pMD18-T 载体，菌落 PCR 鉴定后将
阳性克隆送至上海生工生物技术服务有限公司测序。
1.2.2 原 核 表 达 载 体 构 建 与 表 达 纯 化 按 照 文
献［17］进行。将 tolB 基因与原核表达载体 pET-
28a 连接后转化至大肠杆菌 BL21 感受态细胞，IPTG
诱导表达后使用 HisTrap HP 亲和柱纯化目的蛋白，
-20℃保存。
1.2.3 TolB 蛋白免疫小鼠 将纯化的融合蛋白皮下
多点注射免疫 SPF 级昆明小鼠。每只小鼠免疫 200
μg 融合蛋白，以注射 PBS 为对照。每隔 7 d 加强
免疫一次，共免疫 4 次。首次注射的抗原为蛋白或
PBS 与完全佐剂混匀制备，后 3 次注射的抗原均采
用蛋白或 PBS 与不完全佐剂混匀制备。末次加强免
疫后 1 周眼球取血，离心分离血清，测定效价后冷
冻保存备用。
1.2.4 石斑鱼的免疫和攻毒 石斑鱼 100 尾随机分
成对照组和注射组，每组 50 尾。对照组分别注射
100 μL PBS，免疫组注射 100 μL TolB 蛋白（1 000
μg/mL）。在首次免疫后第 3 周，对免疫组石斑鱼进
行第 2 次免疫，方法同第 1 次。首次免疫后，每周
取样一次，每组取 3 尾鱼，尾静脉采血 0.5 mL，室
温下静置 2 h 后 4℃过夜，12 000 r/min 离心 10 min，
分离血清，-80℃保存，ELISA 测定抗体效价。免疫
后第 4 周，进行攻毒试验，每尾鱼肌肉注射 0.2 mL
溶藻弧菌 HY9901（6.0×108 cfu/mL），每天观察鱼
的动态，记录死亡情况，对部分发病及死亡鱼进行
病理检查和病原菌分离，并计算其相对免疫保护力
（RPS）： ݽ⯛㓴↫ӑ⦷ሩ➗㓴↫ӑ⦷RPS=1 − ×100%
1.2.5 特异性检测和抗血清效价测定 将诱导表达
后的融合蛋白和溶藻弧菌 HY9901 的全菌蛋白进行
SDS-PAGE 电泳后，进行转印，5% 脱脂牛奶 4℃封
闭过夜。用鼠抗血清与之反应，二抗为 HRP 标记
的羊抗鼠 IgG。各步骤之间用含体积分数 0.1% 的
Tween 20 的 磷 酸 缓 冲 液（TTBS） 洗 膜 4 次， 每 次
10 min。最后用 DAB 显色液显色至有清晰的目的条
带出现，用无菌水终止反应，将膜置于滤纸上自然
干燥。
利用纯化的融合蛋白为抗原包被 96 孔板，根
据预实验确定最适抗原浓度为每孔 10 μg /100 μL。
待测鼠抗血清或石斑鱼抗血清为一抗，第 1 孔稀释
100 倍或 64 倍，以后倍比稀释。注射 PBS 后的血清
作阴性对照，HRP 标记的羊抗鼠 IgG 或者兔抗石斑
鱼 IgM 为二抗，四甲基联苯胺（TMB）溶液显色后
酶标仪测定抗体效价。
2 结果
2.1 tolB基因的克隆和序列分析
PCR 扩增得到一条约 1.3 kb 的特异条带（图
1-A），克隆至 pMD18-T 载体，菌落 PCR 也扩增出 1.3
kp 的条带（图 1-B）。测序表明，tolB 基因含有一个
1 353 bp 的开放读码框（ORF），编码 450 个氨基酸
（图 2），预测分子量约为 49.7 kD，等电点为 9.49。
将该基因提交至 GenBank，其登录号为 JQ846501。
2000
bp
M 1 2
1000
1353
bp
750
500
250
100
3 4 5 6 M
1353
bp
2000
bp
1000
750
500
250
100
A
B
M ：DL2000 DNA Marker ；1-6 ：tolB PCR 产物
图 1 tolB 基因的克隆（A）和菌落 PCR（B）
对 tolB 基因所推导的氨基酸序列进行 N 端信号
肽结构的预测发现，在第 22-23 位氨基酸为信号肽；
并发现该蛋白第 24-43 位氨基酸为跨膜区（图 2）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7146
蛋白质亚细胞定位预测结果显示，TolB 位于胞外基
质中可能性最大，为 66.7%，其次为细胞质和囊泡，
可能性均为 11.1%。InterProScan Sequence Search 程
序预测结构域发现该蛋白含有 1 个 N-terminal 结构
域（24-122 aa），3 个 PD40-like β-螺旋结构域（223-
248、256-292 和 300-336 aa）。
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
541
481
421
361
301
241
181
121
61
1
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1353
600
540
480
420
360
300
240
180
120
60
终止子以星号表示，方框代表信号肽，下划线处为跨膜区
图 2 溶藻弧菌 HY9901 tolB 基因核苷酸及其编码的氨基酸
序列
55
kD
M 1 2 3
40
35
53
kD
25
15
M ：预染蛋白分子量标准 ；1 ：阴性对照 ；2 ：TolB 融合蛋白 ；
3 ：溶藻弧菌全菌蛋白
图 3 TolB 的免疫印迹
清不仅能与融合蛋白发生反应（图 3 第 2 泳道），而
且能与天然的溶藻弧菌全菌蛋白发生反应（图 3 第
3 泳道），在 53 kD 处有印迹带，注射 PBS 后的血清
不能与 53 kD 带发生反应（图 3 第 1 泳道）。
16
12
8
4
0
2 3 4ᰦ䰤/week5 6 7ᣇփ᭸ԧ/log2 ݽ⯛㓴ሩ➗㓴 ** *****
* ：0.01图 4 间接 ELISA 法测定的免疫鱼抗体效价
BLAST 分析发现溶藻弧菌 TolB 基因与其他已知
物种的 TolB 具有较高的同源性，其中 TolB 氨基酸
序列与副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的 TolB
氨基酸序列的同源性最高达 94%，多序列相似性比
较表明 TolB 是高度保守的（表 1）。
2.2 TolB蛋白的免疫原性分析
TolB 免疫小鼠后，ELISA 检测鼠抗血清效价在
1∶40 000 以上。Western blot 分析发现，TolB 抗血
表 1 溶藻弧菌 HY9901 tolB 基因推导氨基酸序列与其他弧
菌相应序列同源性比较
菌株 数据库代号 氨基酸序列同源性 /%
V.parahaemolyticus NP_797439 94
V.harveyi ZP_01985132 92
V.vulnificus NP_935068 86
V.mimicus ZP_06033685 82
2.3 血清抗体效价变化
TolB 免疫后的石斑鱼，分别在第 2、3、4、5、
6 和 7 周采血和收集血清，用间接 ELISA 法测定抗
体效价。结果（图 4）表明，石斑鱼在免疫后都发
生特异免疫反应，所有免疫组与非免疫对照组间都
存在显著差异（P<0.05），在第 2 周即可检测到抗体
的产生，在第 4 周抗体水平达到峰值（1∶2 048），
2015,31(7) 147庞欢瑛等 ：溶藻弧菌转运蛋白 TolB 的免疫原性与免疫保护性
在第 7 周实验结束时，所有免疫组的抗体效价均维
持在 1∶64 以上。
2.4 石斑鱼的免疫保护分析
TolB 蛋白免疫石斑鱼后第 4 周，进行攻毒实验。
结果（图 5）表明，对照组鱼在感染第 3 天开始死
亡，并且出现了明显症状，如运动和摄食能力下降，
出现腹水和体表溃疡等，从肝、肾中重新分离到了
溶藻弧菌，确认死于攻击引起的感染。在感染后 2 周
内，对照组的石斑鱼全部死亡 ；免疫组的死亡率为
24%，相对免疫保护力为 76%。
溶藻弧菌 TolB 在致病过程中可能参与毒素的转运。
但是 TolB 蛋白能否引起宿主良好的免疫反应，从而
作为疫苗的有效成分，尚不得而知。为解决以上问题，
笔者将用纯化的融合蛋白免疫 SPF 级小鼠，获得了
高效价的抗血清，ELISA 检测效价达 1∶40 000，表
明在弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂的协助下，融
合蛋白在小鼠中能够引发很强的体液免疫应答。更
重要的是，鼠抗 TolB 的血清不仅与融合蛋白发生免
疫反应，而且也能与天然溶藻弧菌的全菌蛋白发生
免疫反应，提示溶藻弧菌转运蛋白 TolB 是它的主要
抗原之一，具备了成为疫苗候选成分的基本条件。
很多研究表明，外膜蛋白具有良好的免疫原
性［23-25］，而且有些外膜蛋白还是很好的共同抗原，
是研制基因工程疫苗的良好材料。如 Li 等［26］发现
外膜蛋白 OmpK 广泛存在于弧菌中，对溶藻弧菌、
哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌均具有高免
疫保护率。在本研究中，通过基因序列的比对发现，
溶藻弧菌 Tol-Pal 系统中的 TolB 基因与其他已知物
种的 TolB 具有较高的同源性，其中与副溶血弧菌
的 TolB 氨基酸序列的同源性最高达 94%，多序列相
似性比较表明 TolB 是高度保守的，可能是弧菌的交
叉保护抗原。为验证 TolB 的保护性，笔者将在大肠
杆菌中表达并纯化的 TolB 蛋白免疫石斑鱼。结果发
现，免疫石斑鱼血清中也产生了较高水平的特异性
抗体，进一步验证了 TolB 强的免疫原性 ；对溶藻弧
菌强毒株攻毒感染的免疫保护率为 76%，表明 TolB
可以作为一个有效候选亚单位疫苗成分，达到免疫
防治的目的。但是，从免疫鱼中获得的血清抗体效
价（1∶1 024）低于免疫小鼠获得的血清抗体效价
（1∶40 000）。这种血清抗体效价的差异在其他一些
鱼类中也存在［27，28］。出现这种差异的原因可能是因
为鱼类与小鼠相比，免疫系统相对不完善，免疫应
答能力比小鼠弱。另外，免疫剂量、免疫佐剂以及
免疫途径等，都可能导致免疫应答水平和免疫保护
效果的不同。今后在 TolB 免疫剂量、免疫佐剂的选
择、免疫途径以及采用不同弧菌进行攻毒等方面需
更进一步地开展研究，以期提高该蛋白的免疫应答
和免疫保护力，为进一步制备高效亚单位疫苗奠定
基础，为海水鱼类弧菌病的防治提供有效的途径。
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15ᰦ䰤/dݽ⯛؍ᣔ⦷/% ሩ➗㓴ݽ⯛㓴
图 5 免疫后用溶藻弧菌 HY9901 攻毒的存活率
3 讨论
对 Tol-Pal 系统的报道最早始于其对 A 类大肠
杆菌毒素的转运作用［13］，后续研究发现其功能涉及
维持革兰氏阴性菌的外膜完整性和稳定性、发挥毒
力、细胞分裂、细菌耐药性等方面［19］。对鼠伤寒沙
门氏菌（Salmonella Typhimurium）Tol-Pal 系统的研
究表明，tolA 基因的缺失可导致其毒力下降［20］，对
大肠杆菌（Escherichia coli）细胞分裂的研究发现，
分裂末期中隔附近聚集了大量 Tol 蛋白系统［21］，对
福氏志贺菌（Shigella flexneri）耐药性研究发现 Pal-
Tol 膜蛋白系统的表达产物 TolA 蛋白，TolQ 蛋白和
TolB 蛋白可能与其多药耐药性存在一定的关系［22］。
但是有关 Tol-Pal 系统相关蛋白的免疫原性和免疫保
护性功能尚未知晓。本研究通过基因序列比对发现，
氨基酸序列中存在 3 个 PD40-likeβ-螺旋结构域。相
关研究表明，该结构域通过识别转运大肠杆菌素等
致病性蛋白质毒素［14］，参与细菌的致病过程，因此
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7148
4 结论
本研究从溶藻弧菌 HY9901 成功克隆得到 To-
lB 的基因全长序列。该基因（GenBank 登录号 JQ84-
6501）全长 1 353 bp，共编码 450 个氨基酸残基。
BLAST 比对发现溶藻弧菌 TolB 基因与其他已知弧菌
的 TolB 具有较高的同源性。用原核表达的 TolB 蛋
白免疫 SPF 级小鼠，制备多克隆抗体，ELISA 效价
达 1∶40 000。免疫印迹表明鼠抗 TolB 血清能与诱
导后的重组蛋白发生特异反应。用 TolB 蛋白两次免
疫石斑鱼，ELISA 检测表明抗体效价在第 4 周达到
峰值（1∶2 048）。攻毒实验结果表明 TolB 对石斑鱼
的免疫保护率为 76%。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）