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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-11-21
基金项目 : 生物反应器工程国家重点实验室重点项目配套子课题（2060204）
作者简介 : 王克平 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 病原菌减毒及疫苗开发 ; E-mail: wangkeping68@126.com
通讯作者 : 张惠展 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 途径工程 ; E-mail: huizhzh@ecust.edu.cn
迟钝爱德华氏菌 RNA提取及痕量基因组 DNA
去除方法探究
王克平 叶江 张惠展
（华东理工大学生物工程学院 生物反应器工程国家重点实验室， 上海 200237）
摘 要： 迟钝爱德华氏菌 EIB202是一类细胞壁结构特殊的革兰氏阴性菌，高质量 RNA提取相对较难。为了从转录组水平
研究这类致病菌的致病机理， 需要摸索有效的 RNA提取及 RNA样品中痕量基因组 DNA去除方法。对常规 RNA提取步骤进行改进，
增加 PBS清洗、反复冻融及较高浓度溶菌酶处理等步骤；另外，利用小体系基因组 DNA去除系统，Mg2+与 Mn2+协同激活 DNase I
去除 RNA样品中基因组 DNA污染。利用优化方法提取的 RNA在质量及浓度（1 740 ng/μL）方面均有了显著改善，并建立了一套
完全去除 RNA样品中痕量基因组 DNA污染的程序。
关键词： 迟钝爱德华氏菌 RNA 基因组 DNA DNase I RT-PCR
RNA Isolation from Edwardsiella tarda and Removal of Contaminating
Genomic DNA in RNA Samples
Wang Keping Ye Jiang Zhang Huizhan
（Bioreactor Engineering, State Key Laboratory of East China University of Science and Technology of
Biological Engineering, Shanghai 200237）
Abstract: The RNA isolation of Edwardsiella tarda EIB202, a Gram-negative bacterium with specific cell wall, is relatively difficult. It
is necessary to explore the RNA isolation from Edwardsiella tarda and removal of contaminated genomic DNA in RNA samples for the purpose of
researching virulence mechanism at the transcription level. On the basis of conventional RNA extraction method, an improvement method which
added steps of washing with PBS, repeated freeze-thaw and processing with higher concentrations of lysozyme was used for the RNA isolation
from Edwardsiella tarda. Furthermore, the method of using Mg2+ and Mn2+ in a microvolume digestion procedure was applied for removal of
contaminated genomic DNA in RNA samples. High-quality RNA from Edwardsiella tarda was obtained using improved method. RNA purified by
the removal method was used for RT-PCR and none band of DNA contamination could be observed in agarose gel.
Key words: Edwardsiella tarda RNA Genomic DNA DNase I RT-PCR
随着生物技术的发展，Northern blot、RT-PCR、
RT-qPCR、基于转录谱分析的 DD-RTPCR 及基因芯
片等技术得到了广泛应用。然而，这些技术可靠性
的关键在于高质量 RNA 的获取，涉及 RNA 浓度与
分子完整性、基因组 DNA、蛋白、糖类及有机试剂
污染等方面。对于一般的革兰氏阴性菌，利用常规
的 RNA 试剂盒提取到的 RNA 便能符合基本试验要
求，但是对于像迟钝爱德华氏菌这类有着特殊细胞
壁结构的革兰氏阴性菌［1］，获得高质量的 RNA 有
一定难度。目前，对于细胞壁较难破碎菌体的 RNA
提取一般采用液氮研磨、酸洗玻璃珠破壁以及超声
波处理等方法［2］，但是这类方法操作过于剧烈，不
仅容易造成污染，而且在操作过程中很可能造成菌
体转录谱发生变化，给后续试验带来假象。因此，
有必要针对此类菌体的 RNA 提取开发一种较温和的
方法。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期180
由 RNA 提取试剂盒获得的 RNA 样品，即便经
过 DNase I 的柱上处理，琼脂糖凝胶电泳观察不到
基因组 DNA 条带，但仍然存在着痕量基因组 DNA
的污染，这种污染难以保证后续试验数据的可靠性。
对于真核生物，在 RT 试验中可以通过设计合适的
引物（跨越内含子）来排除这种污染。但在原核生
物情况下，类似 dNTP analog 的方法，不稳定，且重
复性不佳，因此最根本的办法还是完全消除基因组
DNA 的污染。近几年，关于去除 RNA 样品中基因
组 DNA 的方法很多［3-5］，但重复性较差，过程较繁
琐，效果不理想。本工作在上述研究的基础上，对
基因组 DNA 污染去除方法进行探究，目的在于寻找
一种简单、重复性好、适用于不同生物样品，便于
一般实验室操作的痕量基因组 DNA 污染去除方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 迟钝爱德华氏菌 EIB202 从患病的大比
目鱼分离到，由华东理工大学阿华所提供（菌株保
藏于 CCTCC，保藏号 ： M208068）。
1.1.2 试剂 逆转录酶 M-MLV （RNase H-）购自 Pro-
mega 公司（Code：M368A）； Recombinant DNase I （Ta-
KaRa、TIANGEN 以及 Roche 公司）；RNase-free H2O
购自 TaKaRa 公司（Code ：D9012）；DEPC 购自上海
赛百盛公司（进口分装）。
1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取 （1）常规 RNA 提取方法 ：参
照罗氏 RNA 抽提试剂盒提取方法，High pure RNA
Isolation Kit （Cat.No.11828665001）。（2）基于冻融预
处理 RNA 提取方法 ：根据迟钝爱德华氏菌生长曲
线，在合适的时间收集菌体（菌体量不宜大于 109
cells）后用 PBS 清洗 2 次，弃上清后保存于 -80℃ ；
RNA 提取前，将菌体由 -80℃转至室温，反复冻融
1-2次；加入200 μL， pH8.0的 10 mmol/L Tris缓冲液，
加入溶菌酶（终浓度 3 mg/mL），37℃孵育 10 min。
后续步骤参照罗氏 RNA 抽提试剂盒说明。
1.2.2 RNA 样品中基因组 DNA 的去除
（1）参照 TaKaRa Recombinant DNase I 操作方
法 ：采用 TaKaRa 公司的 Recombinant DNase I （RNa-
sefree）， 10×DNase I Buffer: 400 mmol/L Tris-HCl， 80
mmol/L MgCl2， 50 mmol/L DTT （pH7.5）。RNA 样 品
中基因组 DNA 去除过程参照 TaKaRa Recombinant
DNase I 使用说明（TaKaRa Code:D2270A）。
（2）参照 TIANGEN Recombinant DNase I 操作
方法 ：采用 TIANGEN 公司的 RNase-Free DNase I，
Buffer: RDD，RNA 样品中基因组 DNA 去除过程参
照 TIANGEN RNase-Free DNase I 使用说明（Code ：
RT411）。
（3）参照 Roche Recombinant DNase I 操作方法：
采用 Roche 公司的 DNase I recombinant （RNase-free），
10×DNase I Buffer : 400 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L
NaCl， 60 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L CaCl2 （pH7.9）。
RNA 样品中基因组 DNA 去除过程参照 Roche DNase
I Recombinant 使用说明（Code ：04716728001）。
（4）参照 Flohr 等［3］的方法 ：采用 Roche 公司
的 DNase I recombinant（RNase-free），首先将 RNA 逆
转录，得到 cDNA，对 cDNA 样品进行去除基因组
DNA 污染处理，10×DNase Ⅰ Buffer: 100 mmol/L Tris-
HCl，50 mmol/L MgCl2 （pH7.4）， 投 入 35 μL cDNA
及 10 U DNase I，反应体系为 60 μL，室温孵育 2 h。
基因组 DNA 去除详细过程参照 Flohr 等的方法。
（5）改进的基因组 DNA 处理方法 ：分别采用
TaKaRa，TIANGEN 和 Roche 公司的 DNase I（RNase-
free）， 使用相同的Buffer: 300 mmol/L NaCl， 20 mmol/L
Tris-HCL， 3 mmol/L MgCl2 和 3 mmol/L MnCl2（终浓
度），投入等量的 RNA 样品（2-5 μg 左右）及 DNase
I （10 U），反应体系为 10 μL，37℃孵育 30 min。
处理完的样品 75℃水浴 10 min，使 DNase I 失活。
若后续进行一般的 RT 试验，上述样品可直接做模
板使用 ；若后续试验对样品的纯度及离子浓度要求
较为苛刻，可先经热处理后通过苯酚 / 氯仿抽提、
乙醇沉淀或过柱处理，得到纯净的样品。
1.2.3 逆转录 PCR 验证基因组 DNA 去除 RpoD
是生理生化所必须的 sigma 因子，在整个生长周
期中较稳定表达，本试验中设计了 rpoD 的特异
性 引 物 RT-rpoD-F 和 RT-rpoD-R， 能 够 扩 增 出 一
204 bp 大小的片段。RT-rpoD-F ：5-CGAACAGTAC-
GAAAAAACCCG-3， RT-rpoD-R ：5-TCAACGCAC-
AGCTT CATGATC-3。以上述经 DNase Ⅰ处理好的
RNA 样品作为模板，不同 DNase Ⅰ处理的样品一式
2012年第6期 181王克平等 ：迟钝爱德华氏菌 RNA 提取及痕量基因组 DNA 去除方法探究
两份，一份加逆转录酶 M-MLV（RNase H-），一份不
加，作为阴性对照，以 9 聚体引物进行 cDNA 第一
条链的合成。逆转录程序 ：30℃，10 min， 42℃， 60
min， 70℃， 10 min， 4℃保存。然后，以上述 cDNA
溶液作为模板，使用 rpoD 特异性引物，Taq 酶
（TaKaRa）进行第二轮 PCR。PCR 程序 ：97℃预变
性 5 min，94℃变性 1 min， 60℃复性 1 min，72℃延
伸 40 s， 40 次循环，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。
2 结果
2.1 常规RNA提取法与基于冻融预处理RNA提取
法效果比较
两种方法提取到的 RNA 经 1% 琼脂糖凝胶电泳
（图 1），通过电泳条带亮度检查其完整性。用紫外
分光光度法测定 RNA 水溶液的 A260、A280、A230，并
计算 A260/A280、A260/A230 的比值。确定其纯度及浓度。
若获得的 RNA 样品 A260/A280 值介于 1.8-2.0，表明
RNA 样品无蛋白质及多糖等污染 ；A260/A230 值大于
2.0， 说明该样品不存在小分子物质及盐类物质。
在总 RNA 完整性方面较好。
1. 常规 RNA 提取结果 ; 2. 基于冻融预处理 RNA 提取结果
图 1 常规 RNA提取与基于冻融预处理 RNA提取结果
从图 1 及表 1 可以看出，针对于迟钝爱德华氏
菌这类特殊细胞壁菌体，参照罗氏 RNA 抽提试剂盒
提取方法得到的 RNA 不仅浓度较低，只有 18.4 ng/
μL，总提取量 0.92 μg。两种提取方法均在菌体生长
状态 OD600=1.0 时收集菌体 1 mL，而且样品中有蛋
白质及碳水化合物污染。而在罗氏 RNA 抽提方法基
础上经 PBS 清洗、冻融预处理以及高浓度溶菌酶处
理得到的 RNA 不仅浓度较高，可达 1 740 ng/μL，总
提取量达 87 μg 左右，而且样品中基本无蛋白、酚
类有机试剂及碳水化合物类污染。另外，通过图 1
可以看到改进的 RNA 提取方法其 23S rRNA 亮度大
致为 16S rRNA 的两倍，说明改进的 RNA 提取方法
表 1 两种 RNA提取操作下 RNA各项参数
RNA 样品 A260 A280 A230 A260/A280 A260/A230 浓度（ng/μL）
1 0.46 0.32 0.79 1.44 0.58 18.40
2 0.87 0.44 0.41 1.97 2.12 1740
1. 常规 RNA 提取法 ; 2. 基于冻融预处理 RNA 提取法，样品 2 经 50 倍稀
释后测量
2.2 痕量基因组DNA污染去除方法比较
为衡量经 DNase I 处理后的样品是否还有残留
基因组 DNA 污染，使用 rpoD 特异性引物对上述处
理样品进行 RT-PCR 扩增，每种样品进行一个无逆
转录酶的阴性对照，来确定扩增出的目的片段是来
自 cDNA 还是基因组 DNA，同时整个试验程序中设
立一个无模板对照（以水为模板）及阳性对照（以
基因组 DNA 为模板），来衡量该 PCR 体系的正常。
图 2 RT-PCR验证痕量基因组 DNA去除效果
由图 2 可以看出，按照 TaKaRa、TIANGEN 及
Roche 的 DNase I 去除步骤，以及参照 Flohr 等的方
法对经第一步反转的 cDNA 进行处理，在 PCR 40
个循环的严格检测条件下均无法完全去除痕量基因
组 DNA 污染。但在特殊 Buffer: 300 mmol/L NaCl， 20
mmol/L Tris-HCl， 2 mmol/L CaCl2，3 mmol/L MgCl2 以
及 3 mmol/L MnCl2（终浓度，10 μL 体系）条件下，
37℃ 孵育 30 min，上述 3 个公司的 DNase Ⅰ均能有
效地去除 RNA 样品中痕量基因组 DNA 污染。在此
优化的痕量基因组 DNA 去除系统里，较传统方法最
显著的两点在于反应 Buffer 里 Mg2+ 与 Mn2+ 的同时引
入及较小的反应体系。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期182
3 讨论
针对像迟钝爱德华氏菌这类有着特殊细胞壁结
构的革兰氏阴性菌，参照正常的 RNA 提取方法，并
不能得到高质量的 RNA。试验中除使用 Roche 公司
的 RNA 提取试剂盒，前期还曾经使用过 TIANGEN、
Exygen 以及艾德莱公司的试剂盒，发现若不经前期
PBS 清洗、反复冻融及较高浓度溶菌酶处理均得不
到良好的提取效果。
在 RNA 样品中基因组 DNA 污染去除方面，发
现 10 μL 反应体系，投入 2-5 μg 的 RNA 样品，10
U 的 DNase I （TaKaRa、TIANGEN 及 Roche）， 特
殊 Buffer 条件下，37℃孵育 30 min 均能将痕量基因
组 DNA 污染去除。与上述 4 种使用相同的 DNase I
却未能完全去除痕量基因组 DNA 污染的方法比较，
不难发现，DNase I 所处的反应环境是痕量基因组
DNA 能否完全去除的关键。另外，试验中发现接近
中性的 pH 环境，较小反应体系（≤ 20 μL）， Mn2+
的存在是痕量基因组 DNA 去除的必要条件，但是参
照 Wang 等［6］的方法经多次尝试均失败，原因不明
确。后续试验中通过 Na+， Mg2+，Ca2+ 等离子的添加，
成功将痕量基因组 DNA 去除。分析原因，接近中性
pH， Na+ 及 Ca2+ 的存在可能对于 DNase I 活性的维
持发挥着重要作用，并被 Mg2+ 或 Mn2+ 激活。在以
Mg2+ 作为辅因子的条件下，DNase I 随机剪切双链
DNA 的任意位点 ；在以 Mn2+ 作为辅因子的条件下，
DNase I 可在同一位点剪切 DNA 双链，形成平末端，
或 1-2 个核苷酸突出的黏末端［7］。这就是为什么
在基因组 DNA 去除试验中只添加 Mg2+，阴性对照
经常可以克隆出目的大小条带的一个重要原因。因
为，在只有 Mg2+ 作为辅因子存在的情况下，DNase
I 随机剪切的片段较大，PCR 过程中可产生 overlap
效应。但是，可能由于 Mn2+ 的激活效果不是很强，
而 Mg2+ 的添加一定程度上可产生协同作用。所以，
在 Buffer 中同时添加一定量的 Mg2+ 和 Mn2+ 有利于
痕量基因组 DNA 的去除。此外，在逆转录 PCR 操
作时要注重阴性以及无模板对照操作。在长期试验
中发现，在确保 PCR 体系添加试剂无污染的情况下，
采用国内多家引物合成公司生产的引物在以水为模
板情况下，能够扩增出理论大小条带，这在肠杆菌
科菌体操作中尤为明显。另外，参照许多痕量基因
组 DNA 污染去除方法，发现其 RT-PCR 执行循环数
大多在 30-35 个循环之间，在前期试验中也尝试过
RT-PCR 过程中执行 30-35 个循环，发现阴性对照
有时扩增不出条带，但是一旦循环数提高到 40 个循
环，阴性对照均能扩增出理论大小条带。
4 结论
本研究在常规 RNA 提取方法基础上增加了 PBS
清洗、反复冻融及较高浓度溶菌酶处理等步骤，改
进的 RNA 提取方法，操作简单，提取效果优良。利
用小体系基因组 DNA 去除系统，Mg2+ 与 Mn2+ 协同
激活DNase I成功去除RNA样品中基因组DNA污染，
RNA 样品中痕量基因组 DNA 污染的完全去除，为
后续 RT-PCR、RT-qPCR、转录组学分析等试验的进
行及得到数据的严谨性提供了有力保障。
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（责任编辑 李楠）