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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):163-169
白色念珠菌(Candida albicans)是念珠菌属中
致病力最强的一种革兰氏阳性条件致病菌[1],常常
侵犯人体皮肤、黏膜,并导致内脏或全身感染。近
年来,随着大量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用,
收稿日期 :2015-01-14
基金项目 :国家青年科学基金项目(31300002),运城学院博士启动基金项目(YQ-2011043)
作者简介 :曹建斌,男,硕士,讲师,研究方向 :分子生物学 ;E-mail :caojianbin2006@126.com
通讯作者 :李新,男,博士,副教授,研究方向 :极端微生物学 ;E-mail :lixin-eva@163.com
耐盐芽孢杆菌 LAY 的分类鉴定及其抗白色念珠菌
活性研究
曹建斌 于慧瑛 李新
(运城学院生命科学系,运城 044000)
摘 要 : 旨在从运城盐湖黑泥样品中分离获得一株耐盐细菌 LAY,对其进行分类鉴定及抗菌特性研究。基于 16S rRNA 基因
序列对菌株进行分类鉴定。以白色念珠菌为指示菌,采用杯碟法对菌株 LAY 发酵上清液进行抗菌活性检测,研究不同因素对其抗
菌活性的影响 ;采用扫描电镜和透射电镜观察其抗菌效果,并对菌株基因组进行功能基因的 PCR 筛查。系统发育分析表明,菌株
LAY 为 Bacillus 属成员,为耐盐细菌。电镜观察发现,菌株 LAY 发酵上清液可导致白色念珠菌细胞结构出现明显异常。抗菌稳定
性研究表明,菌株 LAY 发酵上清液活性较为稳定,表现出良好的对温度、pH、NaCl 和紫外光的耐受性。功能基因筛查发现菌株
LAY 基因组中含有聚酮合酶(PKS)基因,表明该菌具有产聚酮类化合物的潜力。结果表明,盐湖环境中的极端微生物资源可作
为抗菌活性物质的潜在新来源。
关键词 : 耐盐细菌 ;Bacillus ;Candida albicans ;抗菌活性 ;功能基因
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.023
Identification of Bacillus sp. LAY and Its Antimicrobial Activity
Against Candida albicans
Cao Jianbin Yu Huiying Li Xin
(College of Life Sciences,Yuncheng University,Yuncheng 044000)
Abstract: The goal of this work is to identify a halotolerant bacterium LAY isolated from Yuncheng Salt Lake and study its antimicrobial
properties. The strain LAY was identified by 16S rRNA gene sequence analysis. Using Candida albicans as the indicator, the antimicrobial
activity of the fermentation broth of strain LAY was detected by cylinder plate method, and meanwhile the effects of different factors on the
activities were studied. Morphological and ultra-structural changes of treated cells were observed by scanning electron microscopy(SEM)
and transmission electron microscopy(TEM). PCR screening of functional genes were also carried out. The results of phylogenetic analysis
indicated that it was a halotolerant bacterium, and characterized as the genus of Bacillus, and named as Bacillus sp. LAY. The observation by
electron spectroscopy discovered that morphological and ultra-structural changes of C. albicans after treatment by fermentation broth of Bacillus
sp. LAY were significant. Antimicrobial properties of the strain LAY indicated that the activity of fermentation broth was stable, and showed
excellent tolerance towards temperature, pH, NaCl and ultraviolet. Using specific primers, a gene for polyketide synthase(PKS)was detected
by PCR technique, indicating that the strain LAY possessed the potential of producing polyketide. In conclusion, results from the study showed
that extremophiles from salt lake might be developed as a potential new source of antimicrobial active substances.
Key words: halotolerant bacteria ;Bacillus ;Candida albicans ;antimicrobial activity ;functional gene
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9164
以及器官移植术的开展,使该菌导致的感染发病率
逐渐增高,甚至危及生命[2]。因此寻找和开发具有
抗白色念珠菌活性的新化合物,已成为医学和微生
物学研究领域的重要课题。
运城盐湖是个典型的内陆咸水湖,由于湖水及
其周围土壤的含盐度较高,生活在这类环境中的动
植物较为稀少,但却蕴藏着丰富的嗜 / 耐盐微生物
资源[3]。这类微生物对环境的适应能力较强,在
长期的进化中逐步形成了独特的种群特点和代谢机
制,并产生了许多具有特殊功能的天然活性物质[4],
在食品、医药、环境保护等领域具有重要的开发利
用价值[5,6]。近年来,人们虽对盐湖微生物资源开
展了大量的研究,但将其应用于抗菌活性筛选的报
道却十分有限,仅有少量的嗜 / 耐盐细菌次生代谢
产物被分离纯化,如 Halobacillus litoralis YS3106 产
生 的 3 种 具 有 抗 菌 作 用 的 环 肽[7] 和 Pelagiobacter
variabilis 产生的具有抗肿瘤活性的一组吩嗪类化合
物[8]。由此可见,盐湖微生物所蕴含的抗菌代谢产
物资源还远未被人们所发掘。
本研究从运城盐湖中分离获得一株对白色念珠
菌具有明显抗菌活性的菌株 LAY,采用 16S rRNA
基因序列分析对其进行分类鉴定,并对其发酵液抗
菌活性进行初步研究。此外,在活性研究的基础上,
对菌株 LAY 基因组进行聚酮合酶(PKS)基因和非
核糖体肽合成酶(NRPS)基因的筛查研究,旨在为
其在农业生防或医药领域的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 菌株 LAY 分离自运城盐湖黑泥样品,
白色念珠菌(C. albicans)由本实验室保存。
1.1.2 培养基 PDA 培养基 :马铃薯 200 g,葡萄糖
20 g,琼脂 15-20 g,蒸馏水 1 000 mL,37℃(培养
菌株 LAY)。YPD 培养基 :酵母浸粉 20 g,蛋白胨
10 g, 葡 萄 糖 10 g, 琼 脂 20 g, 蒸 馏 水 1 000 mL,
28℃(活化培养白色念珠菌)。
1.2 方法
1.2.1 菌株 LAY 的 16S rRNA 基因序列分析及系统
进化树构建 提取菌株 LAY 基因组 DNA,采用细
菌通用引物进行 16S rRNA 基因的 PCR 扩增。正向
引物(27f):5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,反
向引物(1540r):5-TACCTTGTTACGACTT-3。PCR
扩增条件 :95℃ 5 min ;95℃ 45 s,52℃ 45 s,72℃
2 min,35 个 循 环 ;72℃ 10 min。PCR 产 物 由 北 京
三博远志公司进行测序。测序结果在 NCBI 数据库
中进行 Blast 搜索,选择同源性较高的相关序列,
利用 Clustal W1.8 软件进行多重序列比对后,采用
MEGA5.0 软件构建菌株 LAY 的系统进化树。
1.2.2 白色念珠菌的活化及菌株 LAY 发酵上清液的
制备 从斜面上挑取适量的白色念珠菌菌苔,接入
已灭菌的 YPD 培养基,28℃下振荡培养 2 d。菌株
LAY 于 37℃振荡培养 3 d,发酵液经 12 000 r/min 离
心 10 min,上清液用于抗菌活性检测。
1.2.3 抗菌活性检测
1.2.3.1 热 稳 定 性 将 5 mL 上 清 液 分 别 置 于 30、
40、50、60、70、80、90 和 100℃ 下 处 理 30 min,
以白色念珠菌为指示菌,未处理的发酵上清为对照,
采用杯碟法测定抑菌圈直径,检测其热稳定性。
1.2.3.2 pH 稳定性 取发酵上清液,将其 pH 值分
别 调 为 4、5、6、7、8、9、10、11 和 12 的 溶 液,
后均定容至 5 mL,静置 2 h。采用杯碟法检测其酸
碱稳定性。
1.2.3.3 NaCl 稳定性 取 1 mL 上清液,加入 NaCl
溶 液, 分 别 调 节 盐 浓 度 为 3%、6%、9%、12%、
15% 和 18%,静置 2 h。采用杯碟法测定其对 NaCl
的稳定性。
1.2.3.4 紫外光照稳定性 取 5 mL 菌株 LAY 发酵上
清液置于紫外灯下,分别于 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、
4.5 和 5 h 取样,以白色念珠菌为指示菌,未处理的
发酵上清为对照,采用杯碟法测定其光照稳定性。
1.2.4 电镜观察 取 1 mL 活化的白色念珠菌悬液
(108 CFU/mL),加入 2 mL 发酵上清液,28℃,120
r/min 振荡培养 24 h,离心收集细胞,用磷酸缓冲液
(pH7.4)冲洗,加入 2.5%(V/V)的戊二醛溶液进
行固定。细胞样品经处理后,分别在扫描电镜(JSH-
35CF,日本)和透射电镜(DXB2-12,上海)下进行
观察。
1.2.5 菌 株 LAY 生 长 曲 线 与 抗 生 素 产 生 量 的 关
系 以 1% 的接种量将菌株 LAY 接种于 PDA 培养
基中,于 37℃下振荡培养。在培养 2 h 后,每隔 2 h
2015,31(9) 165曹建斌等:耐盐芽孢杆菌 LAY的分类鉴定及其抗白色念珠菌活性研究
测 OD600 值,以 PDA 培养基做空白对照。同时,取
1 mL 菌液,于 12 000 r/min 离心 10 min,取上清液,
用于抗菌活性检测。
1.2.6 功能基因的 PCR 筛查及序列分析 采用 Zhu
等[9]设计的特异引物,对菌株 LAY 基因组进行聚
酮合酶(PKS)和非核糖体肽合成酶(NRPS)基因
的 PCR 筛查。PCR 产物通过 1% 的琼脂糖凝胶电
泳检测后,进行回收纯化、酶连及转化。挑取阳性
克隆由北京三博远志生物公司进行测序。将获得的
基因序列提交到 GenBank 中获得基因登录号。采用
DNAman 软件将获得的基因序列转换为氨基酸序列,
在 GenBank 数据库中进行 Blast 比对分析,选取同源
性较高的相关序列,采用 MEGA5.0 软件进行系统发
育分析。
2 结果
2.1 菌株LAY的分类鉴定
2.1.1 部分生理生化特征 如图 1 所示,菌株 LAY
在 0-25.0% 的盐浓度范围内均能生长,最适生长浓
度为 5%,确定其为耐盐细菌 ;菌株生长的最适 pH
1.0
A B C
0.8
0.6
0.4
A
55
0
nm
0.2
0
0 5
NaCl⎃ᓖ/%15 252010
1.0
0.8
0.6
0.4
A
55
0
nm
0.2
0
20 25
温度/ć35 4540 5030
1.0
1.2
0.8
0.6
0.4
A
55
0
nm
0.2
0
5 6 7
pH
9 11108
图 1 NaCl 浓度(A)、pH(B)和温度(C)对菌株 LAY 生长特性的影响
Bacillus amyloliquefaciens strain LD5GQ853414Bacillus amyloliquefaciens strain HS10GU323370Bacillus methylotrophicus strain zzx25KJ009400Bacillus methylotrophicus strain L07JN700123
Bacillus subtilis strain MB8KM013814Bacillus subtilis strain IARI-NIAW1-13KF054916
Bacillus vallismortis strain 263XY1KF818642
Bacillus sp. LAYJF796142
0.0005
56
85
46
71
49
和温度分别为 pH7.0 和 35℃。
2.1.2 系统进化树构建 采用 PCR 扩增菌株 LAY
的 16S rRNA 基因,获得大小为 1 449 bp 的片段。采
用邻接法构建的系统进化树。结果(图 2)显示,
菌株 LAY 与 Bacillus 属内各种的同源性均在 98.0%
以上,确定其为 Bacillus 属成员,命名为 Bacillus sp.
图 2 基于 16S rRNA 基因序列构建的菌株 LAY 的系统发育树
LAY。
2.2 菌株LAY发酵液抗白色念珠菌活性研究
2.2.1 抗菌活性检测 采用杯碟法检测菌株 LAY 发
酵上清液的抗菌活性,结果(图 3)表明该菌可产生
胞外抗菌物质,对白色念珠菌具有明显的抑制作用。
2.2.2 抗菌稳定性研究 热稳定性(图 4-A)结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9166
表明,在 70℃以下,抗菌活性较为稳定 ;80℃时,
抗菌活性最佳 ;温度高于 90℃,抗菌活性开始有
所下降。在 pH11 时,上清液对白色念珠菌的抗菌
活性最强。pH 为 4-10 时,抗菌活性比较稳定。在
pH12 时,抗菌活性明显下降。结果(图 4-B)表明,
菌株 LAY 发酵液的抗菌活性对酸碱的耐受性较好。
盐稳定性结果(图 4-C)表明,菌株 LAY 抗菌活性
在盐度为 0-3% 时最高。但随着盐度的升高,抗菌
活性不断下降,当盐浓度超过 15% 时,抗菌活性基
本消失。此外,研究发现,菌株 LAY 发酵上清液具
有良好的对紫外光的稳定性(图 4-D)。
2.3 电镜观察
采用扫描电镜观察菌株 LAY 上清液对白色念珠
菌的抗菌作用,如图 5 所示。正常白色念珠菌细胞
形状规则,呈圆球形,表面较为光滑,直径约为 2-4
μm(图 5-A)。经上清液处理后的细胞形态发生明显
变化,细胞表面粗糙并出现裂纹,且部分细胞发生
破裂(图 5-B)。
透射电镜观察发现,正常细胞内结构规则,细
胞质分布均匀,细胞壁厚度约为 150-200 nm,且细
胞质中含有丰富的电子致密物质(图 6-A)。经处理
后的细胞发生明显改变,胞内结构紊乱,部分细胞
胞壁疑似消失(图 6-B)或增厚(图 6-C)。此外,
发现细胞质与细胞壁的界限变得模糊,且无法直接
观察到细胞核的存在(图 6-C)。
图 3 菌株 LAY 发酵液抗菌活性检测
30A
25
20
15
10
5
0
30
ᣁ㧼സⴤᖴ/mm
40 50 60ᓖć70 80 90 100
18
B
15
12
9
6
3
0
4
ᣁ㧼സⴤᖴ/mm
5 6 10 11
pH
7 8 9 12
D 25
20
15
10
5
0
30
ᣁ㧼സⴤᖴ/mm
40 50 60ᓖć70 80 90 100
35C
30
25
15
10
20
5
0
0
ᣁ㧼സⴤᖴ/mm
3 96
NaCl/%
12 15 18
A :温度 ;B :pH ;C :NaCl 浓度 ;D :紫外线照射
图 4 菌株 LAY 发酵上清液的抗菌特性
2015,31(9) 167曹建斌等:耐盐芽孢杆菌 LAY的分类鉴定及其抗白色念珠菌活性研究
2.4 菌株LAY生长曲线与抗生素产生量的关系
如图 7 所示,菌株 LAY 在培养开始后即进入
对数生长期,30 h 后达到峰值,并随后进入稳定期
(30-46 h)。由于菌株 LAY 产生抗菌物质的量与抑
菌圈直径的大小成正比,抗菌物质在菌株培养 18 h
后开始产生,32 h 后产生量最高,后趋于稳定。
2 μm 2 μm
A B
A :正常白色念珠菌细胞 ;B :菌株 LAY 上清液处理后的细胞
图 5 扫描电镜观察
A
B
500 nm
500 nm
200 nm
C
A :正常白色念珠菌细胞 ;B,C :LAY 上清液处理后的细胞
图 6 透射电镜观察
0
0 10 20 30ᰦ䰤h 40 50 051015
25
20
30
0.2
A
60
0
nm ᣁ㧼സⴤᖴ/mm
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
㧼փ⭏䮯ᣇ㧼⢙䍘ӗ⭏
图 7 菌株 LAY 生长曲线与抗生素产生量的关系
2.5 功能基因的PCR筛查与分析
对菌株 LAY 基因组进行聚酮合酶(PKS)和
非核糖体肽合成酶(NRPS)基因 PCR 筛查,结果
发现该菌株基因组中不存在 NRPS 基因,但发现了
PKS 基因的存在。经测序后,获得一条 666 bp 的
PKS 基因片段,提交到 GenBank 中获得基因登录
号为 KM000039。将获得的基因片段转换为氨基酸
序列(AIO09649),进行 Blastx 比对,发现该序列
与 GenBank 中已有序列的最高相似度为 99%。系统
发育分析表明,菌株 LAY 的 PKS 基因序列编码的
氨基酸序列为酮缩合酶(KS)基因的高度保守序列
(图 8)。
3 讨论
作为一类重要的药源性微生物资源,芽孢杆菌
具有产丰富次生代谢产物的巨大潜力,它们易于繁
殖,分布广泛,适应环境能力强,在工业、农业、
医学等领域具有广阔的开发利用价值[10]。近年来,
随着陆地微生物资源的日益匮乏和细菌耐药性问题
的不断出现,寻找新种属或特殊性状的微生物来开
拓微生物筛选的新资源显得尤为迫切。因此,从极
端环境中寻找和发现具有抗菌活性的特殊菌株就成
为研究者关注的新热点[11]。多年来,本课题组针对
运城盐湖的微生物资源,开展了大量的调查研究工
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9168
作,筛选并获得了一批具有明显抗菌活性的盐湖芽
孢杆菌菌株。本研究针对其中一株具有抗白色念珠
菌活性的耐盐细菌菌株 LAY 进行研究,通过基因序
列分析发现其为 Bacillus 属成员。
由微生物产生的聚酮类化合物(Polyketide)和
非核糖体肽类化合物(Non-ribosomal peptide)是天
然化合物的两大重要家族,它们大多具有良好的生
物学活性,被广泛用于医用或农用抗生素、免疫抑
制剂和抗癌药等[12]。目前已报道的聚酮类化合物和
非核糖体肽类化合物可达数万种,主要来源于各种
细菌、放线菌和真菌[13]。对此,本研究采用 PCR
技术主要开展了菌株 LAY 基因组中的 PKS 基因和
NRPS 基因的分子筛查,结果发现 Bacillus sp. LAY
也具有产聚酮类化合物的潜力。近年来,在耐盐细
菌的许多常见种群中,如 Aeromonas,Burkholderia,
Photobacterium,Pseudomonas 等,均发现了具有抗菌
活性菌株的存在[14-16],但对其次级代谢产物的报道
却相对较少。
本研究表明,菌株 LAY 发酵上清液对白色念
珠菌具有明显的抗菌活性。同时,对其发酵上清液
进行各种处理后,发现其抗菌活性表现出对紫外光
照、热、环境酸碱度等良好的稳定性,因此可能具
有广阔的应用潜力。细胞壁是真菌细胞外的重要结
构,在维持细胞的生长和正常的生理功能上发挥重
要作用。由于哺乳动物无细胞壁,因而作用于真菌
细胞壁的药物具有高效、低毒的特点。通过电镜观
察,发现经菌株 LAY 发酵上清液处理后的真菌细胞
出现破裂或变形。Leite 等[17]报道该现象主要是由
于化合物导致细胞渗透性发生变化引起的,而这可
能源于抗菌物质的作用靶点为真菌细胞膜或细胞壁。
该结果表明,菌株 LAY 可能产生了某种可破坏真菌
细胞壁的抗菌物质。
通过长期的自然选择与进化,生长在盐(碱)
湖、海水等盐域环境中的微生物形成了独特的环境
适应机制,极有可能会产生某些具有独特化学结构
或生物学活性的代谢产物,因此可作为发现新型天
然化合物的潜在资源。随着科学研究的广泛开展,
来源于极端环境中的抗菌活性微生物也将被不断发
现和鉴定。在本研究结果的基础上,今后将着重针
对菌株 LAY 所产代谢产物进行分离纯化及结构解析
等相关工作,为其在农业生防或医药领域的应用奠
定基础。
4 结论
本研究从运城盐湖黑泥样品中筛选获得一株对
白色念珠菌具有明显抗菌活性的菌株 LAY,通过
16S rRNA 基因序列分析鉴定其为 Bacillus 属成员。
抗菌活性研究结果表明,菌株 LAY 发酵上清液活性
较为稳定,表现出良好的耐热性、抗酸碱及耐盐性
等。抗菌上清液处理白色念珠菌后,可导致其细胞
结构出现明显异常。通过功能基因的 PCR 筛查,发
现 Bacillus sp. LAY 基因组中含有聚酮合酶(PKS)
基因,表明该菌可产聚酮类化合物的。综合上述研
究表明,盐域环境中的嗜 / 耐盐微生物资源可能是
获得新型抗菌活性物质的重要资源。
Polyketide synthase Bacillus amyloliquefaciensWP 032874975
0.001
Type I keto synthase Bacillus sp. LAYAIO09649Polyketide synthase Bacillus subtilisAIW37500Polyketide synthase Bacillus amyloliquefaciensWP 017417814
Polyketide synthase Bacillus amyloliquefaciensWP 054793653Polyketide synthase of type I Bacillus amyloliquefaciensWP 020954018
Polyketide synthase of type I Hybrid NRPS/PKS baeN Bacillus amyloliquefaciensWP 015417513Polyketide synthase Bacillus sp. UNC69MFWP 032871528
BaeN Bacillus sp.916WP 007409849
图 8 基于氨基酸序列的 PKS 基因的系统进化树
2015,31(9) 169曹建斌等:耐盐芽孢杆菌 LAY的分类鉴定及其抗白色念珠菌活性研究
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)