全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2010 37 4 575 580
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–11–24；修回日期：2010–03–15
基金项目：国家科技支撑计划重点项目（2008BADA6B02）；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目（2004BS06012）
黄瓜枯萎病病原拮抗细菌DS-1 菌株鉴定及其生
防效果研究
张 璐1，丁延芹2，杜秉海2，魏 珉1,*，王秀峰1
（1山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；2山东农业大学生命科学学
院，山东泰安 271018）
摘 要：采用平板对峙法，从日光温室连作黄瓜根际土壤中筛选出对黄瓜枯萎病病原菌（Fusarium
oxysporum f. sp. cucumerinum）具有稳定拮抗作用的细菌菌株DS-1，通过形态观察、生理生化测定和16S rDNA
序列分析对该菌株进行了鉴定，并研究了对黄瓜种子萌发的影响和对苗期枯萎病的生防效果。结果表明：
菌株 DS-1 与已报道的 Brevibacillus brevis 16S rDNA 具有 100%同源性，结合形态特征和生理生化特性，
确定 DS-1 为短短芽孢杆菌。基因库中该菌株的序列登录号为 EF108303。DS-1 对黄瓜种子萌发具有促生
作用，苗期防治枯萎病的效果显著，防效达 84.92%。
关键词：黄瓜；黄瓜枯萎病病原菌；拮抗细菌；鉴定；Brevibacillus brevis
中图分类号：S 642.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）04-0575-06

Identification and Biocontrol Effects of Antagonistic Bacterium DS-1 Strain
Against Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum
ZHANG Lu1，DING Yan-qin2，DU Bing-hai2，WEI Min1,*，and WANG Xiu-feng1
（1College of Horticultural Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop Biology，
Tai’an，Shandong 271018，China；2College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract: The taxonomic status, growth promoting and biocontrol effects against Fusarium
oxysporum f. sp. cucumerinum of antagonistic bacterium DS-1 strain, screened by co-culture on PDA
plates from rhizospheric soil of continuously cropped cucumber in solar greenhouse, morphology,
physiological and biochemical characteristics, and 16S rDNA sequencing of the strain were determined,
the effects on cucumber seed germination and seedling fusarium wilt biocontrol were studied. The results
showed that: The 16S rDNA sequence of DS-1 strain shared 100% homology with Brevibacillus brevis
from GenBank. Based on the results of 16S rDNA sequencing, morphological and cultural observation as
well as physiological and biochemical determination, DS-1 strain was identified as Brevibacillus brevis,
with GenBank accession number EF108303. DS-1 strain promoted germination of cucumber seeds, with
significant biocontrol effects against fusarium wilt of cucumber seedlings by 84.92%.
Key words：cucumber；Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum；antagonistic bacterium；
identification；Brevibacillus brevis

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：minwei@sdau.edu.cn；Tel：0538-8246296）
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枯萎病是黄瓜生产中的主要土传病害，连作危害严重。对黄瓜枯萎病的防控，生产上多采取选
用抗病品种、嫁接、化学防治、土壤消毒和轮作换茬等措施，这些措施均取得了一定效果。此外，
还可以利用生物防治的方法。目前，人们已经从土壤中筛选出多种有益微生物，其中植物根际促生
菌（PGPR）作为具有防病潜力和应用价值的一类生防菌受到国内外学者关注（Kloepper，1994；胡
江春 等，2004），并用于土传病害的防治（Kloepper，1991；Weller & Thomashow，1993）。
DS-1 是本课题组从日光温室连作黄瓜根际土壤中筛选出的对枯萎病病原菌具有良好拮抗作用
的细菌菌株。对该菌株进行了鉴定，并研究其对黄瓜种子萌发的影响及对苗期枯萎病的生防效果，
以期为进一步研究其作用机理和开发应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2005 年 8 月至 2006 年 12 月在山东农业大学农业微生物实验室和园艺试验站日光温室内
完成。拮抗菌株 DS-1 分离筛选于山东寿光市孙集镇潘家庄日光温室连作黄瓜根际土壤；枯萎病病
原菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）由农业微生物实验室提供；黄瓜品种为‘新泰密刺’。
LB 培养基用于细菌分离、纯化和培养；PDA 培养基用于病原真菌培养和拮抗菌筛选；PD 培养
基用于真菌孢子悬液制备。
TaqDNA 聚合酶、dNTP、buffer 和 PCR 产物纯化试剂盒购自宝生物（大连）工程有限公司，琼
脂糖购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。
引物按文献（Weisburg et al.，1991；Watanabe et al.，2001）报道的扩增细菌 16S rDNA 的通用
引物设计，该引物可以扩增供试菌株几乎全部 16S rDNA 序列，由上海博亚生物技术有限公司合成。
Primer 1：5′ -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；Primer 2：5′ -TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
1.2 平板抑菌作用测定
采用平板对峙法（方中达，1998），将黄瓜枯萎病病原菌在 PDA 培养基斜面上活化，切成黄豆
粒大小的块状置于平板中央，28 ℃下培养 2 d。将拮抗菌株点种于病原菌菌片周围，每皿接种 3 ~ 5
个，设空白对照（不接种），28 ℃恒温下培养 24 ~ 48 h 后测量病原菌菌落半径，计算抑菌率。
1.3 黄瓜种子发芽试验
挑选饱满均匀的黄瓜种子，消毒，无菌水洗净，25 ℃下催芽 24 h备用。将拮抗细菌接入液体LB
培养基，28 ℃下培养 48 h，制成菌悬液（108 cfu · mL-1）。将黄瓜种子在菌悬液中浸泡 30 min，播种
在培养皿中的灭菌滤纸上，25 ℃培养 48 h，计算发芽率，测量胚芽、胚根长度。以无菌水浸泡的黄
瓜种子为对照。每处理 30 粒，3 次重复。
1.4 黄瓜苗期防病试验
将病原菌接入PD培养液，在 28 ℃、170 r · min-1条件下培养 8 d，用无菌双层纱布过滤，再用无
菌水稀释，制成 107 cfu · mL-1的孢子悬浮液。拮抗细菌接入液体LB后在相同条件下培养 4 d，用无
菌水稀释成 108 cfu · mL-1的菌体悬浮液。将消毒、催芽后的黄瓜种子播种在装有无菌土的塑料钵中，
子叶展平后分别实施如下处理：（1）接种病原菌孢子悬浮液 25 mL和清水 25 mL（对照）；（2）接种
病原菌孢子悬浮液 25 mL和DS-1 悬浮液 25 mL。采用根部切伤接种法（方中达，1998），每处理 10
钵，3 次重复。接种 1 周后开始观察幼苗发病情况。
4 期 张 璐等：黄瓜枯萎病病原拮抗细菌 DS-1 菌株鉴定及其生防效果研究 577
1.5 拮抗菌的常规鉴定
革兰氏染色、菌体形态、菌落形状观察参照杜秉海（1994）的方法；菌株生理生化反应参照东
秀珠和蔡妙英（2001）的方法。
1.6 拮抗菌株的分子鉴定
菌株经液体LB培养基 28 ℃下振荡培养至对数生长期，10 000 r · min-1离心，收集菌体。细菌基
因组DNA提取参照Ausubel 等（1995）的方法。
16S rDNA的PCR扩增参照东秀珠和蔡妙英（2001）的方法稍加修改。PCR反应体系为 100 μL：
10 × buffer 6 μL，MgCl2（25 mmol · L-1）4 μL, dNTP（10 mmol · L-1）5 μL，primer 1（5 pmol）10 μL，
primer 2（5 pmol）10 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶 1 μL，ddH2O 63 μL。PCR 反应条件：
95 ℃ 预变性 5 min；然后 94 ℃变性 1 min，56 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 延伸 1.5 min, 30 个循环；最后 72
℃ 延伸 10 min。PCR产物DNA快速回收采用试剂盒纯化，纯化PCR 产物提交上海博亚生物技术有
限公司测序。
将测得的 16S rDNA 序列输入 GenBank，应用 Blast 软件进行同源性搜索，并用 DNAMAN 软件
进行同源性比较，构建系统发育树。
所有统计分析采用 SPSS 13.0（包括 ANOVA 方差分析）完成。
2 结果与分析
2.1 DS-1 菌株的生防效果
2.1.1 平板抑菌作用
平板对峙法测定结果表明，菌株 DS-1 具有较强的拮抗作用，能显著抑制黄瓜枯萎病原菌的菌
落生长，F. o. c 菌落半径为 15.6 mm，与对照（24.8 mm）差异显著，抑菌率达到 37.0%，并可形成
明显的抑菌圈，抑菌带宽度 6.9 mm。菌株与病原菌落间存在抑菌带，说明对峙培养过程中拮抗菌可
能产生了某种抑制病原菌生长的物质。
2.1.2 对黄瓜种子发芽的影响
由表 1 可以看出，DS-1 菌株对黄瓜种子萌发没有负面影响，而且具有促生作用。经 DS-1 处理
的种子发芽率、胚根长度与对照差异不显著，但胚芽长度显著高于对照。与对照相比，DS-1 处理的
种子侧根多而发达。
表 1 DS-1 菌株对黄瓜种子发芽的影响
Table 1 Effects of DS-1 strain on cucumber seed germination
处理 Treatment 种子发芽率/% Germination rate 胚芽长度/cm Plumule length 胚根长度/cm Radicle length
对照 Control 91.1 a 2.85 b 4.37 a
DS-1 strain 93.3 a 4.13 a 4.39 a
注：小写字母表示 P = 0.05 水平下的差异显著性。
Note：Small letter indicates the significance of difference at P = 0.05 level.

2.1.3 对苗期枯萎病的防治效果
苗期防病试验结果表明，只接种枯萎病原菌而未经拮抗细菌处理的黄瓜幼苗，在 20 ~ 30 ℃温室
中培养 29 d 后，存活率仅为 40%；经拮抗细菌 DS-1 处理的幼苗存活率为 90%，防治效果达到 84.92%，
与对照相比差异显著。

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2.2 拮抗细菌DS-1 菌株的鉴定
2.2.1 形态特征
DS-1 的菌体为杆状，大小约 1.1 μm × 3.2 μm，有芽孢，椭圆形，孢囊膨大（图 1）。在 LB 培养
基上于 28 ℃下培养 24 h 后，菌落为圆形，半球凸状，边缘规则，表面光滑，湿润，有光泽，灰白
色，不透明，直径 1.5 mm 左右，粘性一般。
图 1 菌株 DS-1 的菌体细胞形态
Fig. 1 Cellular morphological character of DS-1 strain
2.2.2 生理生化特性
根据《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001），拮抗菌株 DS-1 的生理生化特性与
短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）的相应性状吻合（表 2）。
表 2 菌株 DS-1 的部分生理生化特性
Table 2 Some physiological and biochemical characteristics of DS-1 strain
测试项目
Items tested
特性
Characteristic
测试项目
Items tested
特性
Characteristic
革兰氏染色 Gram’s stain G+ 2% NaCl 生长 Growth at 2% NaCl -
严格好氧 Strict aerobic + 5% NaCl 生长 Growth at 5% NaCl -
接触酶 Catalase + pH 5.5 生长 Growth at pH 5.5 -
氧化酶 Oxidase + pH 9.0 生长 Growth at pH 9.0 -
硝酸盐还原 Nitrate reduction + 15 ℃生长 Growth at 15 ℃ -
V-P - 50 ℃生长 Growth at 50 ℃ -
柠檬酸盐利用 Citrate utilization - 产酸 Acidogenic：葡萄糖 Glucose +
明胶水解 Gelatin hydrolysis + 阿拉伯糖 Arabinose -
淀粉水解 Starch hydrolysis - 甘露醇 Mannitol +
DNA 水解 DNA hydrolysis + 木糖 Xylose -
注：“+”、“-”分别代表阳性和阴性反应。
Note：“+”，“-”present positive and negative reactions, respectively.

2.2.3 16S rDNA 序列分析
以 DS-1 基因组 DNA 为模板，经 PCR 扩增和电泳检测结果见图 2。DS-1 菌株获得大小约 1.5 kb
的特异性片段，与 16S rDNA 在所有细菌中都高度保守且长度恒定（约 1.5 kb）的报道（Jeng et al.，
2001）相吻合。采用双向测定法测得 DS-1 菌株的 16S rDNA 序列全长为 1 416 bp，GenBank 中的序
列登录号为 EF108303。
经 Blast 同源序列检索发现，在亲缘关系相近的前 100 个序列中，有 88 个为短芽孢杆菌属菌株，
DS-1 与它们都具有 97%以上的同源性，其中与 Brevibacillus brevis（AY591911）的同源性最高，达
100%。以 16S rDNA 同源性为基础，选取 10 个典型菌株的 16S rDNA 用 DNAMAN 软件进行系统
进化分析，结果如图 3。DS-1 与 Brevibacillus brevis（AY591911）单独构成一个分支，反映出两者
的亲缘关系最近。
4 期 张 璐等：黄瓜枯萎病病原拮抗细菌 DS-1 菌株鉴定及其生防效果研究 579
图 3 菌株 DS-1 的系统发育树状图
Fig. 3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of
strain DS-1
图 2 细菌 DS-1 的 PCR 产物电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of PCR amplification
of strain DS-1
3 讨论
3.1 拮抗细菌DS-1 菌株的分类地位
芽孢有无，初步将菌株 DS-1 归于产芽孢细菌，进而根据菌 本试验中，根据革兰氏染色结果和
体形态、菌落特征以及接触酶反应等生理生化特性将 DS-1 鉴定为短芽孢杆菌属，最后通过属内种
间的标志性理化特性以及对不同糖类的利用情况，基本推断菌株 DS-1 为短短芽孢杆菌（Brevibacillus
brevis）。在 16S rDNA 系统发育树中，菌株 DS-1 与 Brevibacillus brevis 同处一个分支，相似性达 100%，
说明两者的亲缘关系最近，这与通过生理生化法鉴定的结果一致。综合形态特征、生理生化特性和
16S rDNA 序列分析结果，可以确定 DS-1 为短短芽孢杆菌。
目前研究较多的植物根际促生菌主要有假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和
3.2 DS-1 的生防效果与作用
著抑制黄瓜枯萎病原菌生长，提高种子发芽率，促进幼芽生长，
提高
究表明，生防菌可通过竞争、抗生、寄生和交叉保护等机制抑制植
物病
短芽孢杆菌属（Brevibacillus）。短芽孢杆菌属（Brevibacillus）是新发现的菌种，可作为菌剂的有效
成分通过拌种、蘸根、种子包衣等方法加以利用，对植物具有促生、增产及拮抗病害的作用。用于
植物病害生物防治的短芽孢杆菌主要是短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis），该菌对葡萄孢菌
（Botrytis）、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）及其引起的病害具有
抑制作用和生防效果（Edwards & Seddon，2001；梁建根，2005）。
机理
本试验中，拮抗菌株 DS-1 能显
幼苗对枯萎病的抗性，减少发病率和病情指数，具有良好的生防效果。这在一定程度上说明其
作为生防菌利用的可能性。但是，引入植物根部的生防菌最终能否有效地抑制病害发生，促进植物
生长，很大程度上取决于该菌在不断伸展的植物根围的定殖能力，定殖能力强弱决定着生防的成功
与失败（张炳欣 等，2000）。
关于生防菌的作用机理，研
害，某些生防菌还可诱导植物系统抗性（徐刘平 等，2006；刘晓光 等，2007）。张昕（2005）
研究了短短芽孢杆菌 ZJY-1 在黄瓜根围的定殖规律，发现在整个生育期均可稳定、有效地定殖，并
随着盛花期和盛果期出现数量高峰。梁建根（2005）在研究短短芽孢杆菌 CH1 的系统诱导抗性时发
现，CH1 通过提高黄瓜植株体内酚类物质代谢的酶活性来激发酚类物质积累，从而诱导黄瓜对猝倒

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病产生抗性，保护酶活性提高与 CH1 诱导的黄瓜对猝倒病抗性之间可能存在一定相关性。本试验筛
选出的拮抗菌株 DS-1 在黄瓜根围的定殖情况，以及防控枯萎病的机理尚需进一步研究，其结果将
为实际应用提供理论依据。

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