全 文 ：·综述与专论· 2013年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）是含铜的多酚氧化
酶（polyphenol oxidases，PPO），能通过 O2 作为电子
传递介质氧化多种酚类化合物，生成苯醌和水。因
其与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜
蓝蛋白在结构和功能上存在着许多相似之处，故同
属于蓝色多铜氧化酶家族。
漆酶按照来源分为 3 大类 ：植物漆酶、真菌漆
酶和细菌漆酶。最早发现的漆酶就属于植物漆酶的
一种——漆树漆酶。尽管漆酶大量存在于植物中，
但植物漆酶并未被广泛应用，主要是因为天然植物
提取物包含大量的氧化酶类，植物漆酶很难被检测
和纯化。目前研究和应用的最广泛的是担子菌亚门
（Basidiomycotina），尤其是白腐真菌所分泌的漆酶。
除此之外，还有子囊菌亚门（Ascomycotina）及半知
菌亚门（Deuteromycotina）。
收稿日期 ：2012-08-29
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（20906048）
作者简介 ：马莹莹，女，硕士研究生，研究方向 ：酶工程 ；E-mail ：mayingying198902@yahoo.com.cn
通讯作者 ：贾红华，男，副教授，研究方向 ：酶工程 ；E-mail ：hhjia@njut.edu.cn
细菌漆酶的研究及应用进展
马莹莹  贾红华  韦萍
（南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816）
摘 要 ： 漆酶作为一种绿色环保的多酚氧化酶类，目前被广泛地应用于染料降解、造纸等领域。细菌漆酶与真菌漆酶相比，
有更好的热稳定性和更宽的最适pH范围。因此，在工业应用方面更具优势与潜力。综述细菌漆酶的来源、分布、分子结构等基本信息，
以及目前细菌漆酶发酵生产水平，并对固定化细菌漆酶进行总结。此外，对细菌漆酶在染料废水、电化学应用及造纸等工业生产
方面的应用作简要的介绍。
关键词 ： 细菌漆酶 固定化 应用
Progress in Study and Application of Bacterial Laccase
Ma Yingying Jia Honghua Wei Ping
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816）
Abstract:  Laccase is widely used in decolorization of dyes, paper as a green polyphenol oxidases. Bacterial laccase has more advantages
and potential in the industrial application due to the high temperature and pH stability compared with fungi laccase. In this article, the
origination, distribution, molecular structure and fermentation of bacterial laccase were summarized. And the immobilization of bacterial laccase
were also mentioned. Meanwhile, the application of bacterial laccase in dyes wastewater, electrochemistry and paper were briefly introduced.
Key words:  Bacterial laccase Immobilization Application
近年来的研究发现，漆酶也同样广泛存在于细
菌中。由于与真菌漆酶结构不同，细菌漆酶在 Cu2+
抗性、糖基化、热稳定性和酶的最适 pH 范围广等
方面比真菌漆酶更有优势［1］。
随着分子生物学技术和结构生物学方向的快速
发展，对细菌漆酶的认识也逐渐深入。由于其与真
菌漆酶相比，结构更加简单，有望更容易大规模生产，
从而推动其应用。
1 细菌漆酶的生产
1.1 细菌漆酶的来源
1993 年，Givaudan［2］在生脂固氮螺菌（Azospirill-
um lipoferum）中发现了漆酶活性。该细菌漆酶是由
一个催化亚基和 1 或 2 条长链所组成的多聚体酶类，
它在细胞色素形成中扮演着重要的角色，而且能催
化利用植物酚类物质，充当电子传递者。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期42
Solano 等［3］从产黑色素细菌海单胞菌中分离得
到两种不同的 PPO，试验发现其作用底物跟络氨酸
酶和漆酶的底物特异性一致。Mellano 和 Cooksey［4］
从假单胞菌（Pseudomonas syringae）中分离得到一
种漆酶类似物——CopA ；Brown 等［5］ 从大肠杆菌
（Escherichia coli）中发现了 PcoA。这两种漆酶类似
物在结构上与多铜氧化酶同源，并表现出 Cu2+ 抗性。
2003 年，Endo 等［6］将从链霉菌中得到的 EpoA
在物理化学和生物化学两个方面进行了表征，而且
构建了重组子 rEpoA 在大肠杆菌中表达。其同源三
聚体相对分子量为 114 kD，底物专一性相对比较窄，
它不能氧化多种漆酶模式底物，如愈创木酚、丁香
醛连氮。
随后，黄俊等［7］报道 Klebsiella 细菌菌株具有
漆酶活性。试验验证，该细菌漆酶经 60℃处理或
pH 10 条件下透析 20 h 仍能保持一定的酶活。
2010 年，Tamaki 等［8］在溶杆菌属菌株 T-15 中
发现了一种能氧化尿酸的酶。该酶由 592 个氨基酸
组成，含有 4 个相同的铜离子结合位点，而且每个
亚基中含有 3 个铜离子。该酶的一级结构与海单胞
菌的多酚氧化酶有 33% 的一致性。
目前，研究得最透彻的细菌漆酶是枯草芽孢杆
菌（Bacillus subtilis）芽孢外衣蛋白 CotA。其结构与
多铜氧化酶相似，具有抗紫外和 H2O2 氧化的动能。
因为芽孢的特殊构造，CotA 具有极好的温度耐受
性，在 80℃下的半衰期为 2 h，其最适温度为 75℃。
2010 年，Mao 等［9］利用功能筛选的方法，从红树林
环境中筛选出一个表达产物具有漆酶活性的新基因
Lac591，其基因序列全长 1 500 bp ；Lac591 有 4 个
作为铜离子结合位点的组氨酸保守区域，且该基因
与嗜碱芽孢杆菌（Bacillus halodurans C-125）的漆酶
相比同源性为 52%。该酶在 pH7.0-10.0 范围内仍能
保留大于 80% 的酶活（愈创木酚为底物），最适反
应温度为 55℃。
2011 年，Fang 等［10］ 从 海 洋 微 生 物 中 获 得 一
段大小为 1.32 kb 的细菌漆酶基因，命名为 Lac15。
Lac15 有 439 个氨基酸，含有 3 个保守的 Cu2+ 结合
区 域。Lac15 在 pH5.5-9.0 和 温 度 15-45 ℃ 下 能 保
持稳定的活性。与真菌漆酶相比，Lac15 具有极好
的氯化物耐受性 ；在氯化物浓度不高于 700 mmol/L
时，Lac15 的活性提高了 2 倍，甚至在氯化物浓度为
1 000 mmol/L 时也能保持正常的活性。
此外，嗜热菌中的超嗜热菌（Aquifex aeolicus）、
嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）中也有报道存在
漆酶活性。
1.2 细菌漆酶的生产
与其他催化剂相比，酶的生产成本往往比较高，
通过优化培养基条件提高酶产量是重要的降低生产
成本的可行性方法，主要通过碳源和氮源的选择达
到提高细菌漆酶产量目的。
Jing 等［40］对淡紫灰链霉菌通过液体发酵培养
基的优化能同时提高漆酶和木质素过氧化酶的产量。
结果发现，培养基中 C/N 的摩尔比是提高漆酶产量
的关键因素，当其在 1.43-1.48 之间时，漆酶酶活最
高能达到 0.107 4 U/mL。
Niladevi 等［41］利用稻草对沙链霉菌进行固体发
酵产漆酶的研究发现，与咖啡浆相比，稻草更适合
于漆酶的生产。最优条件下其漆酶酶活能达到 55.4
U/g。
谢迎春等［42］从抗生素链霉菌中提取目的基因
phs，利用 pET-28a（+）质粒作为载体，以 E.coli 为
表达宿主高效表达吩恶嗪酮合成酶（PHS）。通过
对各种可能影响表达的因素进行研究发现，当培养
基 pH7.0、Cu2+ 浓 度 1.5 mmol/L、 诱 导 温 度 30 ℃、
IPTG 诱导浓度 1 mmol/L、菌体生长密度 OD600 达到
0.6 时，加入 IPTG 诱导 16 h 产 PHS 量最高，能达到
7 U/mL。
2 细菌漆酶的结构
细菌漆酶属于糖蛋白，一般以单体蛋白的形式
存在。不同来源的细菌漆酶其相对分子量差异很大，
其糖基化的程度也不一样。细菌漆酶一般由几种同
工酶或亚基组成，如生脂固氮螺菌就是由 3 个亚基
组成。
Katz 等在抗生素链霉菌（Streptomyces antibioti-
cus）的细胞抽提物中发现一种具有漆酶活性的物质，
即吩恶嗪酮合成酶（Phenoxazinone synthase，PHS）。
PHS 是一种球状蛋白，每个蛋白亚基大小为 75 ×
60 × 50 Å3。PHS 结构一般分为 3 个结构域 ：结构
域一含有 9 个 β 股，结构域二含有 11 个，结构域三
2013年第2期 43马莹莹等 ：细菌漆酶的研究及应用进展
包含 2 个短的螺旋片段。PHS 的 3D 结构与其他两
种多铜氧化酶（CotA 和 CueO）类似，只是 PHS 含
有 612 氨基酸，相对而言，其他两种则较小，分别
为 513 和 488 个氨基酸序列。Alex 等用分辨率达 2.30
Å 的 X-射线衍射仪对 PHS 晶体结构进行了成功的解
析，并发现一些特殊的特征［43］。其结构形成了一个
六聚的环，外径为 185 Å，中心有一个直径为 50 Å
的大空腔。六聚体亚基含有 5 个铜离子和 3 类铜结
合域，其中第 5 个铜离子为 PHS 所特有的，它位于
结构域 2 和结构域 3 的连接区域。其结构如图 1 所示。
单核的Ⅰ型铜离子位于结构域三，与 2 个 His
的 N 和 1 个 Cys 的 S 配 位 结 合， 其 中 共 价 键 Cu-
Scys 使酶呈现蓝色。Ⅱ型 Cu 和Ⅲ型 Cu 形成的三核
中心位于结构域一和结构域三的界面上，该三核中
心与高度保守的 4 个 His-X-His 花样的 8 个 His 配
位结合。Ⅲ型 Cu 结合 6 个，并且原子对之间还有
氧桥，具有强反磁性，导致其对电子顺磁共振效应
（EPR）的消失。Ⅱ型结合 2 个。第 3 个结构域除了
有 β-sandwich，还有 4 个 N 端的螺旋区，最后一个
螺旋位于 C-末端，由结构域一的 Cys85 和结构域二
的 Cys48 形 成 的 二 硫 键 来 稳 定。 第 2 对 二 硫 键
（Cys117-Cys204）存在于结构域一和结构域二之间。
3 固定化酶
由于天然漆酶在工业应用中容易失活，所以导
表 1 已报道的细菌漆酶和漆酶类似物
菌种 氨基酸长度 相对分子量（kD） 可能的功能
嗜热菌 超嗜热菌（Aquifex aeolicus，sufI） 527 59.3 细胞分裂蛋白［11］
嗜热栖热菌（Thermus thermophilus HB27） 462 53 —［12］
耐超高温热棒菌（Pyrobaculum aerophilum，pae1888） 477 52.9 —［13］
芽孢杆菌 芽孢杆菌（Bacillus sp.，mnxG） 1217 多聚体 孢子形成，氧化 Mn
2+［14］
球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus） — — 孢子形成，色素形成［15］
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，cotA） 511 65 芽孢色素形成，UV 和 H2O2 抗性
［16］
嗜碱芽孢杆菌（Bacilllus halodurans C-125） 500 56 Cu2+ 抗性［17］
蛋白菌 α 蛋白菌（α-proteobacterium SD 21） — 150，250 氧化 Mn2+［18］
γ 蛋白菌（γ-proteobacterium JB） — 120 氧化有毒化合物［19］
假单胞菌 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens GB-1） — 180，250 氧化 Mn2+［20］
嗜麦芽假单胞菌（Pseudomonas maltophila） — — 核苷氧化酶活性［21］
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida GB-1，cumA） 460 50 氧化 Mn2+［22］
假单胞菌（Pseudomonas sp.，cumA） — 50 氧化 Mn2+［23］
丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae，copA） 609 67.35 Cu2+ 抗性［24］
链霉菌 抗生素链霉菌（Streptomyces antibioticus） 642 67.5 合成吩恶嗪酮
［25］
灰色链霉菌（Streptomyces griseus epoA） 348 114 色素形成，胚胎形态发生［26］
淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae） 612 66.771 —［27］
天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor） — 32 —［28］
沙链霉菌（Streptomyces psammoticus） — 43 —［29］
深蓝链霉菌（Streptomyces cyaneus） — 75 —［30］
番薯链霉菌（Streptomyces ipomoea） 242 77 —［31］
其它 生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum） —
多聚体，48.9，
97.8，179.3
色素形成，氧化多酚化合物，电子传递［32］
大肠杆菌（Escherichia coli，yacK） 516 56.5 亚铁氧化酶，排出 Cu2+［33，34］
克雷伯氏菌（Klebsiella sp.） — 55 Cu2+ 抗性［7］
纤毛菌（Leptothrix discophora SS1） 1662 110 Mn2+ 脱毒［35］
海单胞菌（Marinomonas mediterranea，ppoA） 675 543 色素形成［36］
海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus iheynsis，cotA） 5913 59.08 孢子形成［37］
黄单孢菌（Xanthomonas campesteris copA） 635 69.5 Cu2+ 抗性［38］
苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti） — 95 色素形成［39］
— ：未报道
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期44
致成本高，大大限制了其应用。因此，提高漆酶的
稳定性和重复使用次数显得极为重要。
漆酶固定化技术作为一种常用的酶改造方法，
近年有一些报道。Niladevi 等［44］利用海藻酸铜成功
固定了 S. psammoticus 所产多铜氧化酶，通过 8 批次
连续脱除苯酚反应，固定化多铜氧化酶保持了较好
的稳定性。Singh 等［45］ 将 γ-proteobacterium JB 所产
漆酶固定到硝化纤维薄膜上，在 4-30℃条件下能稳
定保持 100% 酶活 3 个月。研究证明，固定化方法
能有效提高漆酶的稳定性和利用效率，其反应产物
也更易于纯化。
磁性高分子微球是近年来发展起来的一种新型
高分子材料，是指内部含有磁性金属或者金属化氧
化物，具有磁响应性的超细粉末。王颖等发明了一
种用磁性复合微球固定化漆酶的方法，该方法是以
金属螯合的磁性复合微球为载体，通过配位键结合
作用将漆酶固定在载体上。载体制备是先利用化学
沉淀法合成磁性四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子，以
该纳米粒子为核，利用溶胶 - 凝胶法制得核壳式磁
性二氧化硅（SiO2），再以 γ-氯丙基三甲氧基硅烷
为媒介，在磁性二氧化硅表面接枝一种含羰基或氨
基的聚合物，然后通过螯合一种过渡金属离子（如
Cu2+、Zn2+、Ni2+ 或 Co2+）利用金属螯合配体与蛋白
质表面供电子氨基酸间的相互作用，将漆酶固定在
该载体上。该方法制备的固定化漆酶跟一般方法比
较起来具有快速磁响应性能。
4 细菌漆酶的应用
4.1 染料废水
近来染料与印染工业的迅猛发展，随之而来的
染料的种类和数量也迅速增加。据美国《染料引索》
报道称，目前商品染料种类已达几万种，年生产量
超过 7×105 t。人工合成的染料通常含有复杂的芳香
环结构、品种繁多、化学稳定性高、生物可降解性低，
且多数染料及其代谢中间产物具有致突变性、致癌
性和其他毒性，这也是染料成为重要的环境污染物
的原因之一。
H608His
524
His
608
His
203
His
529
His
602
His
527
HOH
NN
1.99
2.92
1.98
3.63 3.86
2.02
2.022.002.00
2.04
2.042.06
N
N
N
NN
N
N
X
SH
N
N
N
NN
N
N
N
N
N
N
S
His
161
His
604
His
201
His
163
Cu1
Cu2 Cu3
Cu4
H524
Cu1
C603
M613
H602H604
Cu3
Cu2
Cu4
HOH
X
H527
H529
H163
H434
H440
H438
H161
H201
1.99
12.47 12.98
2.01
2.003.48
2.30
Cys
524
Met
613A B
C
图 1 PHS 铜离子结构图
2013年第2期 45马莹莹等 ：细菌漆酶的研究及应用进展
漆酶催化空气中的氧气直接氧化分解各种酚类
染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚 A 及芳香胺等，
在漆酶介导剂（HBT、ABTS 等）存在的情况下，漆
酶还可以催化降解与木质素相关的二苯基甲烷、N-
取代对苯基二胺、有机磷化合物（农药）、二噁英、
偶氮类和靛青类染料。用漆酶厌氧处理废水，可除
去废水中的木质素衍生物、单宁、酚醛化合物等有
毒物质。
叶茂等［46］研究发现，重组漆酶 Lac591 在金属
离子 Ca2+ 和小分子介质（ABTS 或 HBT）存 在 下，
处理染料 14 h 降解率能达到 11%（碱性蓝 3）、25%
（亚甲基蓝）、57%（溴酚蓝）、60%（结晶紫）、37%
（亮蓝 R）和 10%（酸性紫 7）。对靛红染料 Lac591
处理 60 min，其降解率即可达到 100%。此外，该酶
处理碱木质素 14 h 后，其降解率也可达 11%。
Held 等［47］利用矾土固定 Bacillus SF 的芽孢外
衣漆酶进行染料脱色。固定化芽孢漆酶蛋白在 60℃
的半衰期为 66-80 h，特别是在碱性条件下，与真菌
漆酶相比，细菌漆酶的热稳定性极高。在 pH9.5 的
条件下，固定化 Bacillus SF 芽孢漆酶蛋白的半衰期
为 67 h，利用固定化细菌漆酶对纺织染料进行脱色，
60℃处理 90 min 后，脱色率达 99%。
4.2 电化学领域
漆酶在催化底物的同时，氧分子一步 4 个电子
被还原生成水，在生物电子设备的研制中成为理想
的生物电极阴极催化剂。如检测化学物质的生物传
感器、体内医疗设备供电的植入式生物燃料电池、
疾病诊断等。漆酶电化学研究具有十分重要的意义，
除能快速灵敏地检测化学物质，在研究氧化还原蛋
白质的荷电界面空间取向的同时，还能有助于人们
了解蛋白质大分子的结构与理化性质的关系，以及
蛋白质在生命体内的代谢机制和生理作用。
Beneyton 等［48］首次将 cotA 固定到玻璃碳电极上，
制备成生物燃料电池。其电流的大小是直接跟 cotA
的催化效率（kcat/Km）相关的。经 cotA 修饰后的电
极最适反应温度是 45-50℃，而且能保持稳定的催
化活性至少 7 周。
4.3 造纸
造纸工业中，传统的化学制浆最大的缺陷是木
质素去除不彻底，而且残留的木质素会使纸张变成
褐色，所以之后还要进行漂白 ；而传统的氯法漂白
产生的废水不但污染环境，而且漂白后的纸张极易
反弹。
利用漆酶进行生物漂白不仅能避免环境问题，
还能提高纸张的质量和强度。但是漆酶的氧化还原
电位比较低，不能降解木质素结构中 90% 的非酚
型结构单元。因此，还需要加入一些小分子化合物
作为介导剂起到传递电子的作用。研究指出，一些
带有 N-OH 基团的 N-杂环物，如 1-羟基苯并三唑
（HBT）、2，2-联氮 - 二（3-乙基 - 苯并噻唑 -6- 磺酸）
二铵盐（ABTS）、紫尿酸（VIO）和 N-羟基乙酰苯
胺（NHA）等均为良好的小分子介质。
首 次 细 菌 漆 酶 应 用 于 造 纸 工 业 中 是 2003 年
Arias 等［49］利用 S.cyaneus CECT3335 所产漆酶，以
ABTS 为小分子介质，降解桉树中的木质素，与真
菌漆酶相比，其降解效率提高了 18.4%。最近，γ-
proteobacterium JB 所产漆酶也成功应用于纸浆的生
物降解中［50］。在最优条件下，同样是以 ABTS 为小
分子介质，纸浆的澄清度能提高 5.89%，卡伯值降
低 21.1%。
5 小结
现阶段，由于细菌漆酶在各方面的应用使得人
们对它的关注度越来越高，但对其研究还远远不够，
尤其国内关于细菌漆酶的报道很少。细菌漆酶的分
子结构和催化机理、如何通过物理和化学等手段进
一步提高细菌漆酶的利用率还有待深入研究。今后
可以考虑在以下几个方面进行研究 ：第一，细菌漆
酶的分子结构，以及不同细菌漆酶间不同的催化机
制，为高活性细菌漆酶在蛋白质水平上改造提供依
据 ；第二，筛选更高产漆酶的野生菌株，优化细菌
漆酶的生产，为其工业化应用打下基础 ；第三，尝
试更多的固定化载体固定细菌漆酶，减少酶活损失
的同时能最大限度保持酶的活性。
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（责任编辑 狄艳红）