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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
近年来，由于病原微生物耐药性的日益增强和
新型感染性疾病的不断涌现，寻求和开发新的微生
物资源，对新型抗生素的发现和耐药性感染性疾病
的治疗具有重大的现实意义［1］。随着陆源微生物
资源的日趋枯竭，海洋将成为微生物资源的主要来
收稿日期 ：2012-12-28
基金项目 ：广东省科技攻关项目（2010B030800011）
作者简介 ：陈美群，女，硕士研究生，研究方向 ：海洋放线菌的筛选及其活性产物分析 ；E-mail ：cmq1986007@163.com
通讯作者 ：朱红惠，女，研究员，研究方向 ：海洋微生物资源开发与利用 ；E-mail ：zhuhonghui66@yahoo.com.cn
一株抗多重耐药菌海洋放线菌的筛选及其活性分析
陈美群1，2，3  冯广达2  邓名荣2  朱红惠2
（1. 中国科学院南海海洋研究所，广州 510301 ；2. 广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省华南应用微生物
重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070 ；
3. 中国科学院研究生院，北京 100049）
摘 要 ： 旨在从 71 株海洋放线菌中筛选活性较好的抗多重耐药菌菌株。采用平板打孔抑菌法筛选对多重耐药菌的抑制作
用 ；通过菌株形态学特征、生理生化特征和 16S rDNA 序列对菌株进行分类鉴定。结果显示，筛选到一株对多株多重耐药菌均有
较强抑制作用的海洋放线菌 MQ-86，菌株 MQ-86 的 M2
+ 培养基粗提物对普通的大肠杆菌（Escherichia coli）8739、金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231 和共耐 18 种主要抗生素的多重耐药性大肠杆菌（Escherichia
coli）480、大肠杆菌（Escherichia coli）460、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）206 都有较好的抑制效果。菌株 MQ-86 对多
株多重耐药菌均具有较强的抑制活性，经初步鉴定为小链霉菌（Streptomyces parvus）。
关键词 ： 海洋放线菌 抑菌活性 链霉菌属 抗耐药菌
Screening and Characterization of a Marine Actinomycete with
Antagonist Activities Against Multidrug Resistant Bacteria
Chen Meiqun1，2，3 Feng Guangda2 Deng Mingrong2 Zhu Honghui2
（1. South China Sea Institute of Oceanology，the Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301 ；2. Guangdong Institute of Microbiology，
Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，State Key Laboratory of Applied Microbiology（Ministry-
Guangdong Province Jointly Breeding Base），South China，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangzhou 510070 ；
3. Graduate School of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049）
Abstract:  It was to screening the antagonist activities against multidrug resistant bacteria from 71 marine actinomycetes. The inhibitory
effect of 71 marine actinomycetes were detected against multidrug resistant bacteria by disk diffusion method, the strain was identified by
morphological, physiological, biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. Results showed that strain MQ-86 showed
strong inhibitory effect against multidrug resistant bacteria. The fermentation crude extract of strain MQ-86 using M2
+ medium shows strong
inhibitory effect to Escherichia coli 8739, Staphylococcus aureus 6538, Candida albicans 10231, Escherichia coli 480, Escherichia coli 460
and Staphylococcus aureus 206. Strain MQ-86 has a strong inhibitory effect against multidrug resistant organisms, which was identified as
Streptomyces parvus.
Key words:  Marine actinomycetes Antibacterial activity Streptomyces Multidrug resistant bacteria
源［2］。高盐、高压、低营养的独特海洋环境，使海
洋微生物形成了不同于陆源微生物的代谢途径，产
生大量的化学结构新颖、抑菌效果较好、或有特殊
作用的生物活性物质［3，4］。已知微生物来源的生物
活性物质中，放线菌来源的生物活性物质约占 70%，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期120
其中以链霉菌属（Streptomyces）为主，约占 50%［5］。
海洋放线菌是新药开发和天然活性产物的重要来源，
有关海洋放线菌来源的新型生物活性物质的报道正
逐渐增多［6，7］，据 Lam［8］不完全统计在 2003-2005
年短短 3 年内就从海洋放线菌中分离到 23 个具有
较好开发潜力的新型药源活性物质，具有良好的抗
菌、抗肿瘤等活性。本研究从分离自南海沉积物的
71 株放线菌中筛选到一株产高活性抗菌物质的放线
菌 MQ-86，针对该菌株进行形态学、生理生化和分
子生物学鉴定，以阐明其分类地位。同时，对该菌
株的最佳抑菌活性培养基以及其活性代谢产物对多
株耐药菌的抑制效果进行初步的研究，旨在为下一
步从该菌株中分离新型活性代谢产物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 71 株放线菌菌株由广东省微生物
菌种保藏中心从南海沉积物样品中分离并保藏。
1.1.2 受试菌株 3 株普通菌：大肠杆菌（Escherichia
coli）8739、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231 由广东
省微生物菌种保藏中心提供 ；5 株耐药菌 ：大肠杆
菌（Escherichia coli）480（耐 11 种抗生素）、大肠杆
菌（Escherichia coli）460（耐 11 种抗生素）、金黄色
葡萄球菌（Staphylococcus aureus）206（耐 13 种抗生
素）、沙门氏菌（Salmonella sp.）47（耐 9 种抗生素）、
沙门氏菌（Salmonella sp.）31（耐 9 种抗生素）由
华南农业大学蒋红霞教授惠赠。
1.1.3 培养基［9，10］ ①高氏一号培养基 ：可溶性淀
粉 20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，
NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸馏水 1 000 mL，
pH7.2 ；②氯化钙（CL）培养基 ：CaCl2 45 g，酵母
提取物 40 g，葡萄糖 5 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.8 ；
③ GBP 培养基：葡萄糖 10 g，牛肉膏 3 g，蛋白胨 5 g，
蒸馏水 1 000 mL，pH7.2 ；④ M2
+ 培养基 ：大麦提取
物（Malt extract）10 g，葡萄糖 4 g，酵母提取物 4 g，
蒸馏水 1 000 mL，pH7.8 ；⑤营养肉汤培养基 ：蛋
白胨 10 g，牛肉膏 3 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1 000 mL，
pH7.2-7.6；⑥ PGY 培养基：蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，
葡萄糖 1 g，蒸馏水 1 000 mL，pH6.8-7.0。
1.2 方法
1.2.1 抗菌活性菌株的初筛 将 71 株海洋放线菌
接种于 100 mL 高氏一号培养基中 28℃振荡培养 7
d，发酵液在 8 000 r/min 条件下离心 20 min，上清液
用 8 层纱布过滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取后旋
转蒸发得代谢产物粗提物，用甲醇将代谢产物溶解
定容至 1 mL，得代谢产物粗提液。抑菌活性的筛选
采用琼脂平板打孔法［11］，以大肠杆菌（Escherichia
coli）8739、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231 为指示
菌。在每个培养皿内打孔 4 个，其中 3 个孔注入发
酵代谢产物粗提液 30 μL，另一个孔注入液体培养基
30 μL 作为空白对照，每个处理重复 3 次，待培养后
观察记录抑菌圈结果。
1.2.2 菌株 MQ-86 最佳抑菌活性培养基的筛选 将
放线菌 MQ-86 接种于高氏一号培养基、GBP 培养基、
氯化钙（CL）培养基和 M2
+ 培养基中，参考“1.2.1
方法”进行最佳抑菌活性培养基的筛选。
1.2.3 菌株 MQ-86 的抑菌活性研究 将菌株 MQ-86
接种到最佳发酵培养基（M2
+ 培养基）中，按“1.2.1
方法”得到代谢产物的粗提物，进行其抑菌活性的
分析。以 3 株普通菌 ：大肠杆菌（Escherichia coli）
8739、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、
白色念珠菌（Candida albicans）10231 和 5 株耐药菌：
大肠杆菌（Escherichia coli）480、大肠杆菌（Esche-
richia coli）460、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus au-
reus）206、沙门氏菌（Salmonella sp.）47、沙门氏菌
（Salmonella sp.）31 为受试菌。将受试菌原液用梯度
稀释法稀释，用血球计数板计数，制得不同浓度的
受试菌菌悬液。在营养肉汤琼脂平板上加 100 μL 不
同浓度的受试细菌菌悬液，涂布均匀，在 PGY 琼脂
平板上加 100 μL 不同浓度的白色念珠菌（Candida
albicans）10231 菌悬液，涂布均匀。待干后用打孔
器（直径 5 mm）在每个培养皿内打孔 4 个，其中 2
个孔注入 MQ-86 菌株的代谢产物粗提液 30 μL，一
个孔以氨苄青霉素 100 μg/mL 作阳性对照，另一个
孔以甲醇做阴性对照，每个处理重复 3 次。细菌于
37℃培养 24 h，白色念珠菌于 28℃培养 48 h，观察
记录抑菌结果并测量其抑菌圈直径。
2013年第7期 121陈美群等 ：一株抗多重耐药菌海洋放线菌的筛选及其活性分析
1.2.4 菌种鉴定 形态学和生理生化鉴定：参考《伯
杰细菌鉴定手册》［12］和《链霉菌鉴定手册》［13］。
分子生物学鉴定 ：对获得的纯培养物菌株使用
BIOMIGA 基因组抽提试剂盒提取总 DNA，然后用于
目的基因的扩增。放线菌 16S rDNA 部分序列的扩增
采用通用引物 27F/1492R［14］。扩增程序如下 ：94℃
5 min ；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30 个 循
环 ；72℃ 10 min。16S rDNA 扩 增 产 物 经 检 测、 纯
化后，送交测序公司测序，利用 NCBI 数据库进行
序列比对分析，获取相近典型菌株的 16S rDNA 序
列，然后用 CLUSTAL X 软件进行全序列比对，利用
MEGA3.0 中 的 邻 接 法（Neighbor-Joining）［15］ 建 立
16S rDNA 序列的系统发育树。
2 结果
2.1 抗菌活性海洋放线菌的初筛
在 71 株海洋放线菌的高氏一号发酵粗提物中没
有 1 株放线菌对大肠杆菌有抑制作用 ；有 4 株对白
色念珠菌有抑制作用，占总菌数的 5.63% ；有 20 株
对金黄色葡萄球菌有抑制作用，占总菌数的 28.17%
（表 1），其中菌株 MQ-86 对金黄色葡萄球菌的抑菌
圈直径大于 20 mm，抗菌效果最好。
表 1 71 株海洋放线菌的抑菌活性初筛
指示菌抑菌圈
直径（mm）
大肠杆菌
8739
金黄色葡萄球菌
6538
白色念珠菌
10231
株数 比例（%） 株数 比例（%） 株数 比例（%）
R>20 0 0 1 1.41 0 0
15100R=0 71 100 51 71.83 67 94.36
R 表示抑菌圈直径（mm）
2.2 海洋放线菌MQ-86 最佳抑菌活性培养基的筛选
不同培养基发酵产物粗提物的抑菌活性如表 2
所示。M2
+ 培养基的发酵产物粗提物具有较强的抑菌
活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌
都有很好的抑菌活性，尤其对白色念珠菌的抑菌效
果最强，抑菌圈直径达到了 29.33 mm。而 CL 培养
基的发酵产物粗提物却完全失去了抑菌活性，对大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌都没有抑菌
活性。高氏一号、GBP 培养基的发酵产物粗提物都
能对金黄色葡萄球菌产生抑菌活性，而对大肠杆菌、
白色念珠菌都没有任何抑制效果，其原因可能是不
同的发酵培养基组分改变了菌株 MQ-86 的代谢产物
种类或产量。由此可见，海洋放线菌 MQ-86 的最佳
抑菌活性培养基为 M2
+ 培养基。
表 2 菌株 MQ-86 不同培养基发酵粗提物的抑菌活性
培养基
抑菌圈直径（mm）
大肠杆菌 8739 金黄色葡萄球菌 6538 白色念珠菌 10231
高氏一号 - 15.33±1.20 -
CL 培养基 - - -
GBP 培养基 - 13.67±0.33 -
M2
+ 培养基 19±1.00 23.33±0.88 29.33±0.67
-：表示无抑菌活性
2.3 菌株MQ-86 最佳发酵培养基粗提物抑菌活性
分析结果
该菌株的 M2
+ 培养基发酵粗提物对不同浓度受
试菌的抑制效果如表 3、图 1 所示。菌株的发酵粗
提物对浓度为 105 个 /mL、106 个 /mL、107 个 /mL 的
普通的大肠杆菌 8739、金黄色葡萄球菌 6538、白色
念珠菌 10231 都有明显的抑制效果，随着受试菌浓
度的提高抑菌圈逐渐变小。菌株的 M2
+ 培养基发酵
粗提物对浓度为 105 个 /mL、106 个 /mL、107 个 /mL
的共耐 18 种抗生素的大肠杆菌 460、大肠杆菌 480、
金黄色葡萄球菌 206 都有明显的抑制作用，且对 107
个 /mL 高浓度的耐药菌仍有较好的抑制作用，但对
有耐药性的沙门氏菌 31、沙门氏菌 47 的抑制效果
较差，即使是对较低浓度（105 个 /mL）的沙门氏菌
31 和沙门氏菌 47，在样品孔附近仍有耐药菌生长，
不能产生完全透明的抑菌圈，菌株 MQ-86 的拮抗耐
药菌机理及其代谢产物活性具有较高的研究价值。
2.4 菌株MQ-86鉴定结果
菌株 MQ-86 在高氏一号培养基生长旺盛，28℃
培养 7 d 菌落直径达 3.0-4.0 mm ；菌落呈圆形、表
面凹凸不平、边缘白色、中间浅灰色、可溶色素呈
粉红色 ；基内菌丝和气生菌丝均很丰富，基内菌丝
无横隔、不断裂 ；气生菌丝柔曲、多分枝 ；孢子丝
直形、中长（图 2）。该菌株能够分解纤维素，水解
淀粉，还原硝酸盐，明胶液化缓慢，牛奶不凝固，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期122
不产生黑色素、酪氨酸酶和硫化氢，能利用阿拉伯糖、
木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和鼠李糖，不能利用棉
籽糖、甘露醇和肌醇。对菌株 MQ-86 的 16S rDNA
扩增测序，从 GenBank 中得到相关菌株的 16S rDNA
序列并构建系统发育树（图 3）。结果表明，该菌株
与小链霉菌 NR043833.1 处于同一分支、序列同源性
高达 99.89%。结合其形态学和生理生化特征，初步
鉴定为小链霉菌（Streptomyces parvus）MQ-86。
3 讨论
目前，抗生素类药物在临床上得到广泛的使用，
表 3 菌株 MQ-86 的 M2+ 培养基发酵粗提物对供试菌株的抑制效果
不同浓度受试菌（个 /mL）
抑菌圈直径（mm）
105 106 107
大肠杆菌 460（耐药菌） 23.17±2.20 20.33±1.17 16.67±0.88
大肠杆菌 480（耐药菌） 19.17±1.01 18.80±0.42 18.33±0.88
金黄色葡萄球菌 206（耐药菌） 27.50±0.50 25.33 ±0.17 24.33±0.33
沙门氏菌 31（耐药菌） - - -
沙门氏菌 47（耐药菌） - - -
大肠杆菌 8739（普通菌） 24.67±0.33 23.00±0.58 21.67±0.33
金黄色葡萄球菌 6538（普通菌） 25.50±0.29 24.75±0.43 22.33±0.44
白色念珠菌 10231（普通菌） 27.00±0.58 25.00±0.58 23.67±0.33
-：表示无抑菌活性
Methanol
MQ-86 extract MQ-86 extract
Amp
Methanol
MQ-86 extract MQ-86 extract
Amp
Methanol
MQ-86 extract MQ-86 extract
Amp
Methanol
MQ-86 extract MQ-86 extract
Amp
Escherichia coil 460 Candida albicans 10231
Staphylococcus aureus 206 Saimonella 47
图 1 菌株 MQ-86 的 M2+ 培养基发酵粗提物对部分受试菌
的抑制效果
A B
C
5 μm
5 μm
图 2 菌株 MQ-86 的形态特征
使由微生物引起的感染性疾病得到有效的控制，但
同时也导致许多致病菌对抗生素类药物产生了严重
的耐药性，特别是耐药性的肠杆菌和葡萄球菌的蔓
延，极大地危害着人类的健康［16］。万古霉素被公认
为是目前最有效的抗生素，但耐万古霉素的金黄色
葡萄球菌也已出现［17］。2010 年在南亚发现的新型
超级病菌 NDM-1［18］，它对除替加环素和黏菌素以外
的所有已知抗生素都具有耐药性。耐药菌株的逐渐
增多及其耐药性的不断增强限制了现有抗生素的临
床治疗效果，寻找和开发新型抗生素资源势在必行。
放线菌代谢具有多样性，能够产生的生物活性物质
极其丰富，是新型抗生素的主要来源。海洋放线菌
研究起步较晚，目前从海洋分离到的放线菌有 18 个
属，约占放线菌总属数的 10%，可见未知的海洋放
线菌资源数量巨大，从海洋放线菌中发现新型抗菌
2013年第7期 123陈美群等 ：一株抗多重耐药菌海洋放线菌的筛选及其活性分析
活性物质的机率较高［19］。
本研究从 71 株海洋放线菌中筛选到一株产高活
性抗菌物质的放线菌 MQ-86，对其进行了初步鉴定
和抗耐药菌活性的研究。初步鉴定 MQ-86 为小链霉
菌，链霉菌是产抗菌素类物质的重要资源菌种，国
内外研究表明链霉菌产生的抗菌素类物质具有较好
的抑菌效果和无毒副作用等优点［20，21］，具有重要的
商业和医用价值，但目前对小链霉菌（Streptomyces
parvus）的研究资料仍相对匮乏。除孙建龙等［22］从
大连海域分离的小链霉菌 PH33 对番茄溃疡病菌具
有较强的抑制活性、康银花等［23］报道的小链霉菌
NIM521 能对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）
有强烈抑制活性和田兆丰等［24］ 分离的小链霉菌
Yn168 能够拮抗 3 种植物病毒外，未发现有关小链
霉菌抑制病害菌及耐药菌的报道。本研究分离的菌
株（Streptomycete parvus）MQ-86 的发酵产物粗提物
对共耐 18 种常用抗生素的耐药性大肠杆菌 480/460
（耐环丙沙星、左氧氟沙星、氨苄西林、头孢他啶、
头孢噻肟、头孢西丁、四环素、氯霉素、卡那霉素、
庆大霉素、链霉素）和耐药性金黄色葡萄球菌 206（耐
环丙沙星、氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、四环
素、氯霉素、头孢曲松、青霉素、苯唑西林、红霉素、
替卡西林、磺胺甲恶唑、阿米卡星）都有明显的抑
制作用，表明菌株 MQ-86 具有可观的研究前景和药
用潜力。目前我们正在对该菌株的代谢产物进行分
离纯化，并进行其结构的鉴定和活性测试，以期为
新型药物的开发提供研究基础。
4 结论
采用平板打孔抑菌法筛选对多重耐药菌的抑制
作用 ；通过菌株形态学特征、生理生化特征和 16S
rDNA 序列对菌株进行分类鉴定。结果显示，筛选
到一株对多株多重耐药菌均有较强抑制作用的海洋
放 线 菌 MQ-86， 菌 株 MQ-86 的 M2
+ 培 养 基 粗 提 物
对普通的大肠杆菌（Escherichia coli）8739、金黄色
葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）6538、 白 色 念 珠
菌（Candida albicans）10231 和共耐 18 种主要抗生
素 的 多 重 耐 药 性 大 肠 杆 菌（Escherichia coli）480、
大肠杆菌（Escherichia coli）460、金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus）206 都 有 较 好 的 抑 制 效 果。
菌株 MQ-86 对多株多重耐药菌均具有较强的抑制活
性，经初步鉴定为小链霉菌（Streptomyces parvus）。
参 考 文 献
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图 3 菌株 MQ-86 的 16S rDNA 序列系统进化树
99
100
73
44
70
99
0.002
Streptomyces parvus NRRL B1455NR 043833.1
MQ-86KC183721
Streptomyces flavofuscus NRRL B-2594EF178690.1
Streptomyces parvus HBUM174870EU841619.1
Streptomyces flavofuscus CGMCC 4.1938JQ924409.1
Streptomyces bikiniensis DS40581X79851.1
Streptomyces lateritiusAF454764.1
Streptomyces lavendulae IFO 12343D85111.1
Streptomyces subrutilus DSM 40445X80825.1
Streptomyces peucetiusAB045887.1
Streptomyces phaeochromogenesAF500071.1
Streptomyces tauricusAB045879.1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期124
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（责任编辑 马鑫）