全 文 ：生物技术通报
·技术与方法· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
云南松基因组微卫星富集文库的构建
许玉兰1，2 张瑞丽2 田斌2 蔡年辉2 康向阳1 段安安2
（1. 北京林业大学 林木育种国家工程实验室，北京 100083 ；2. 西南林业大学 国家林业局西南地区生物多样性
保育重点实验室，昆明 650224）
摘 要 ： 采用磁珠富集法构建云南松微卫星富集文库。云南松基因组 DNA 经 Rsa Ⅰ酶切，与特定接头连接，再用接头特异
引物进行 PCR 扩增。连接扩增产物与用生物素标记的（AG）12、（AT）12、（CG）12、（GT）12、（ACG）12、（ACT）12 和（CCA）8
探针杂交，通过链霉亲和素偶联的磁珠捕捉含接头和微卫星序列的片段并扩增，将获得的片段连接到 pMD-19T 载体上，转化至大
肠杆菌 JM109 感受态细胞中，成功构建了云南松微卫星富集文库。通过 PCR 检测从文库中筛选阳性克隆，在 383 富集阳性菌落中
获得阳性克隆 257 个，经测序分析，在获得的 159 条序列中，有 143 条含有 SSR， 其中完美型占 65.73%， 非完美型占 23.78%， 混
合型占 10.49% 。结果表明，磁珠富集法构建云南松基因组微卫星文库高效、可行的，文库的构建为微卫星位点的分离、遗传多样
性的分析等奠定基础。
关键词 ： 云南松 富集文库 微卫星
Construction of Microsatellite-enriched Library of Pinus yunnanensis
Xu Yulan1，2 Zhang Ruili2 Tian Bin2 Cai Nianhui2 Kang Xiangyang1 Duan Anan2
（1. College of Biological Science and Technology of Beijing Forestry University，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing
Forestry University，Beijing 100083 ；2. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Forestry Administration，
Southwest Forestry University，Kunming 650204）
Abstract:  Microsatellite-enriched libraries in Pinus yunnanensis were constructed using an enrichment method with biotin-labeled probes
and streptavidin-coated magnetic beads.Genomic DNAs of P. yunnanensis were extracted and digested with restriction enzyme Rsa 1. Adapters
were ligated to the end of restriction fragments. Ligated products were amplified by PCR with primers complementary to adapters. The PCR
products were hybridized with biotin-labeled simple sequence repeat probes（AG） （AT） （CG） （GT）12（ACG）, （ACT）12 and（CCA） 12, 12, 12, 12,
8. The hybridized complex was caught by magnetic beads coated with streptavidin. The biotinylated hybrids were isolated on the magnetic
particles according to the strong affinity between biotin and streptavidin. The selected DNAs were amplified by PCR with primers complementary
to adapters and cloned into pMD-19T plasmid vector, and then transformed into E. coli JM109 hosts. SSR enriched genomic DNA library of P.
yunnanensis was constructed. A total of 257 positive clones were selected by PCR from 383 transformants in the microsatellite-enriched library,
and 143 clones were found to contain simple sequence repeats（SSR）among 159 sequences. Among them, 94（65.73%）were perfect repeat,
34 imperfect（23.78%）and 15（10.49%）compound repeat. The results indicated that the method was efficient to construct the microsatellite-
enriched library of P. yunnanensis. The library will be useful for further research on the isolation of microsatellite markers and the analysis of
genetic diversity. .
Key words:  Pinus yunnanensis Enriched library Microsatellite
云 南 松（Pinus yunnanensis） 自 然 分 布 于 东 经 荒山造林的先锋树种和治理水土流失的重要树种，
96-108° 、北纬 23-30° 之间， 是分布区域内瘠薄 占云南省林地面积的 52% 、占有林地蓄积的 32%，
收稿日期 ：2013-07-17
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31260191）， 云南省自然科学基金项目（2010CD065）， 云南省省院省校教育合作咨询共建重点学科
（211015）， 云南省教育厅研究生项目（2012J052）
作者简介 ： 许玉兰， 女， 副教授， 博士研究生， 研究方向 ： 林木遗传育种的研究 ；E-mail ：xvyulan@163.com
通讯作者 ： 康向阳， 男， 博士， 博士生导师， 教授， 研究方向 ： 林木遗传育种的教学与研究 ；E-mail ：kangxy@bjfu.edu.cn
段安安， 男， 博士， 博士生导师， 教授， 研究方向 ： 林木遗传育种的教学与研究 ；E-mail ：duananan@gmail.com
94 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
在云南林业经济生产和生态建设中占有举足轻重的
作用［1，2］。然而， 目前云南松的退化现象比较明显，
急需对现有的资源进行评价， 以制定切实可行的遗
传保护策略。遗传变异的研究在开展植物育种及保
护策略中的作用已引起广泛的重视［3］， 分子标记是
分析遗传变异的有效途径［4，5］， 其中微卫星标记具
有高度的多态性而成为常用的分子标记。这种多态
性早在 1989 年 Weber 和 May［6］就提出检测的方法，
即采用成对的特异引物（ 由少数核苷酸组成， 通过
与微卫星侧翼序列来设计） 对基因组总 DNA 扩增，
凝胶电泳检测， 从而实现对不同个体扩增产物多态
性的检测。扩增引物的分离需要克隆和测序获得［7］。
目前， 微卫星分子标记在云南松的研究中应用
较少。鉴于此， 本研究利用磁珠富集法［8］构建云南
松微卫星 DNA 富集文库， 为进一步筛选云南松微卫
星遗传标记奠定基础， 以期利用微卫星标记进行云
南松群体遗传结构分析， 为云南松种质资源的评价、
核心群体的构建以及保护策略的制定提供遗传学
信息。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源 云南松样品材料取自 2 年生云南
松幼嫩新鲜针叶。
1.1.2 主 要 试 剂 所 需 基 因 组 提 取 试 剂 盒 购 于
Tiangen，DNA 限 制 性 内 切 酶 Rsa Ⅰ 、Xmn Ⅰ 和 连
接酶 T4 购于 New England Biolabs（NEB），Taq DNA
聚 合 酶 购 于 TaKaRa，Dynabeads 链 霉 亲 和 素 磁 珠
M-280 试 剂 盒（Dynalbeads M-280 Streptavidin，112-
05D）、磁珠收集器（Dynal MPC，123-20D） 和琼脂糖
购于 Invitrogen， 克隆连接载体 pGEMR-T Easy 购于
Promega， 转化用的大肠杆菌 JM109 感受态细胞及其
它生化试剂购于 TaKaRa， 所需接头、引物及探针均
由生工生物工程（ 上海） 有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 利用基因组提取试剂盒
（Tiangen）， 按照试剂盒说明书对云南松幼嫩新鲜针
叶进行基因组 DNA 提取。
1.2.2 接头制备 采用 SuperSNX 接头， 序列为 ：
SuperSNX-F ：5-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC
-3 ；SuperSNX-R ：5-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTT-
AAACAAAA-3。
将 SuperSNX-F（100 μmol/L）和 SuperSNX-R（100
μmol/L） 各 1.4 μL， 再加入 NaCl（0.5 mol/L）1.4 μL
以及 ddH2O 2.8 μL， 将该混合物 7 μL 快速混匀， 在
PCR 仪上 95℃，5 min， 关机缓慢冷却至室温， 即制
成双链接头。
1.2.3 基 因 组 DNA 的 酶 切 及 与 接 头 的 连 接 用
Rsa Ⅰ 限制性内切酶消化基因组 DNA， 同时加入
Xmn Ⅰ 酶防止接头发生自连，1.5% 琼脂糖检测。
酶 切 片 段 在 T4 连 接 酶 的 作 用 下 加 上 双 链 接
头， 混 匀，16 ℃ 过 夜。 以 SuperSNX-F 为 引 物 进
行 PCR 扩增检测连接反应， 反应体系为 25 μL， 包
括 10×PCR Buffer 2.50 μL，100×BSA 2.50 μL，
10 mmol/L dNTPs 1.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，
100 μmol/L SuperSNX-F 1.30 μL，5 U/μL Taq 酶 0.20
μL， 连接产物模板 2.00 μL，ddH2O 补足。反应程序
为 ：72℃ 2 min，95℃ 2 min ；95℃ 20 s，60℃ 20 s，
72℃ 90 s，25 个循环；15℃ 10 min 。扩增产物用 1.0%
琼脂糖检测。
1.2.4 磁珠富集法分离微卫星 用于磁珠亲和捕
捉 的 微 卫 星 探 针 为 ：（AG）12、（AT）12、（CG）12、
（GT）12、（ACG）12、（ACT）12 和（CCA）8， 分 别
在其 3 端标记上生物素， 用这些微卫星探针与连
接 产 物 进 行 杂 交， 按 Dynabeads 链 霉 亲 和 素 磁 珠
M-280 试剂盒操作指南， 捕捉含微卫星的 DNA 片
段， 洗脱掉其它非杂交片段。对富集杂交产物 PCR
扩增， 反应体系为 25 μL， 包括 10×PCR Buffer 2.50
μL，100×BSA0.62 μL，10 mmol/L dNTPs 1.38 μL，
25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，100 μmol/L SuperSNX-F
1.30 μL，5 U/μL Taq 酶 0.20 μL， 连接产物模板 4.00
μL，ddH2O 补足。反应程序为 ：95 ℃ 2 min ；95 ℃
20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，30 个 循 环 ；72 ℃ 30
min，15℃ 10 min 。扩增产物用 1.0% 琼脂糖检测。
1.2.5 富集文库构建与鉴定 将富集获得的富含微
卫 星 DNA 片 段 与 pGEMR-T Easy 载 体 相 连 接， 再
转化到感受态细胞 JM109 建立微卫星富集文库。涂
布于含有 IPTG 、X-Gal 和氨苄青霉素的 LB 平板上，
37℃ 上培养 10-16 h 。富集文库中的阳性克隆采用
PCR 筛选， 以 M13+/M13-为引物，LB 平板上挑选的
95 2014年第1期 许玉兰等 ： 云南松基因组微卫星富集文库的构建
阳性菌落为模板， 反应体系为 20 μL， 包括 10×PCR
Buffer 2.50 μL，10 mmol/L dNTPs 0.50 μL，25 mmol/L
MgCl2 2.00 μL，10 pmol/L M13+/M13-各1.00 μL，5 U/μL
Taq 酶 0.20 μL， 模板 2.00 μL，ddH2O 补足。反应程
序为 ：95℃ 3 min ；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，
35 个循环；72℃ 8 min，15℃ 10 min 。扩增产物用 1.0%
琼脂糖检测［9］。
对 PCR 检测到的阳性克隆进行测序， 对测序
结果进行分析以鉴定文库中微卫星 DNA 的富集效
率。对序列去除载体后用 SSRHunter 进行微卫星的
查找［10］。
2 结果
2.1 基因组DNA 提取
提取的基因组 DNA 如图 1 所示， 琼脂琼脂糖检
测显示， 基因组比较完整， 无明显降解， 浓度和纯
度均较高， 可用于后续试验。
1 2 3 4 5 6 7 M
bp
2000
1000
750
500
250
100
1-7 ： 基因组 DNA ；M ：DL2000 DNA Marker
图 1 云南松基因组 DNA
2.2 基因组酶切
用 Rsa Ⅰ 限制性内切酶消化基因组 DNA， 酶切
产物用 1.5% 琼脂糖检测， 结果如图 2 。从图 2 可
知， 大部分酶切片段集中在 300-1 000 bp 之间， 说
明 DNA 已被酶切， 满足构建云南松基因组微卫星富
1 2 3 4 5 6 7 M
bp
2000
1000
750
500
250
100
1-7 ： 酶切片段 ；M ：DL2000 DNA Marker
图 2 云南松基因组 Rsa Ⅰ 酶切
集文库的需要。
2.3 酶切片段与接头的PCR 检测
酶切片段在聚合酶的作用下与人工双链接头连
接， 对连接的产物进行 PCR 扩增，1.0% 琼脂糖检
测，结果如图 3 。片段在 500-1 000 bp 均匀弥散分布，
DNA 酶切片段和接头连接成功， 得到的产物可用于
构建云南松基因组微卫星富集文库。
1 2 3 4 5 6 7 M
bp
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
1-7 ： 接头连接产物 ；M ：100 bp DNA Ladder Marker
图 3 接头连接产物 PCR 扩增
2.4 杂交富集产物检测
杂交、富集后的产物为模板获得的 PCR 扩增产
物， 经 1.0% 琼脂糖检测（ 图 4）， 片段主要分布于
300-1 000 bp 之间， 富集效果较好。
1 2 3 4 5 6 7 M
bp
1500
1000
900
800
700
600
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300
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100
1-7 ： 富集片段产物 ；M ：100 bp DNA Ladder Marker
图 4 云南松微卫星富集片段 PCR 扩增
2.5 微卫星富集文库构建及鉴定
以富集反应得到的 DNA 产物为模板进行 PCR
扩增， 将 PCR 扩增产物与载体连接后转入大肠杆菌
JM109 感受态细胞， 获得微卫星富集文库。从微卫
星富集文库中随机挑取白色阳性菌落，PCR 扩增检
测菌落的插入片段， 筛选可能含有微卫星片段的阳
96 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
性克隆， 扩增产物经 1.0% 琼脂糖检测， 结果如图 5 所示。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M
bp
1500
1000
900
800
700
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200
100
1-24 ： 阳性克隆 PCR 扩增产物 ；M ：100 bp DNA Ladder Marker
图 5 云南松微卫星富集文库阳性克隆 PCR 鉴定
有一条扩增带的即为插入片段全长带， 该克
隆内可能含有微卫星插入片段。从图 5 可以看出，
从 左 往 右， 泳 道 1 、4 、6 、7 、8 、9 、10 、11 、12 、
13 、14 、15 、16 、17 、19 、20 、21 、22 、24 中 有 扩
增条带， 均有可能含有微卫星插入片段。在 383 个
阳性菌落中，257 个菌落获得 PCR 扩增条带， 插入
片段在 400-1 000 bp 之间， 即 PCR 检测阳性率为
67.10% 。
2.6 克隆测序
对 含 PCR 扩 增 条 带 的 257 个 重 组 克 隆 进 行
DNA 测序， 在 159 条已获得的序列中， 有 143 条含
有重复次数不少于 3 次的微卫星序列，PCR 检测筛
选的微卫星序列效率为 55.64%（143/257）， 富集效
率为 37.34%（143/383）。获得的序列去除载体序列
后， 采用 SSRHunter 软件进行 SSR 的搜索。搜索后
的序列， 按 Weber 的分类标准把微卫星序列划分为
完美型（Perfect）、非完美型（Imperfect） 和复合型
（Compound）3 类 ； 将测序得到的 143 条微卫星序列
进行分类， 其中完美型 94 条（65.73%）、非完美型
34 条（23.78%） 和复合型 15 条（10.49%）， 部分序
列的重复序列和侧翼序列结果表 1 。
3 讨论
微卫星标记可以通过基因组分离、数据库序列
信息以及近缘种的转移等方面获得。传统微卫星的
分离是先构建基因组文库， 然后选择合适的探针对
基因组文库进行扫描， 这一过程需要大量的人力和
时间。为避免传统分离微卫星方法中进行基因组文
库的构建和扫描， 研究者相继提出一些改进的方法，
如起初的在随机扩增多态性 DNA 方法［11］的基础
上改进以扩增未知的微卫星， 通过重复锚定随机引
物［12］或 RAPD 引物扩增， 随后用微卫星探针对扩
增条带进行 Southern 杂交［13，14］， 此外还有阳性选择
性克隆［15］、RAPD 扩增产物的克隆和阵列克隆等［16］，
这些方法很快就取代传统耗时耗力建库和扫描的方
法［17］， 与此同时， 也有采用引物延伸来构建微卫星
富集文库， 较早采用这种方法分离微卫星的是 AC
富集文库， 阳性克隆得率 40%-50%［18］， 甚至高达
100%［19］， 但步骤繁琐， 没有得到很好的应用［17］。
与这些方法相比， 磁珠富集法是先杂交富集再建库，
省去了建立较大的基因组文库， 并在此基础上进行
大量筛选工作， 具有周期短、操作简便、目的性强、
阳性克隆率高、一次可获得大量的微卫星序列等优
点［20］。经阳性菌落的挑选、扩增、测序分析，PCR
检测筛选的微卫星序列效率为 55.64%（143/257），
富集效率为 37.34%（143/383）， 相比较而言， 传统
方法在植物中的阳性克隆比例仅为 0.059%-5.8%，
平 均 2.3%［17］。 此 外， 本 研 究 PCR 检 测 准 确 率 高
达 89.94%（143/159）， 与采用含有 SSR 的序列为引
物的方法 PIMA（PCR-based isolation of microsatellite
arrays） 相差无几。邓欣等［9］研究报道， 从 104 个
克隆测序分析中得到 97 个含有微卫星序列， 筛选的
微卫星序列准确率达到 93.27% 。说明利用磁珠富集
97 2014年第1期 许玉兰等 ： 云南松基因组微卫星富集文库的构建
表 1 云南松部分微卫星重复序列及其侧翼序列
克隆 5 侧翼序列 重复序列 3 侧翼序列 序列长度（bp） 类型
Y06 TCAGGGGAGC （ACC）6 TAGGGGAGGA 604 P
Y07 TGGATTGAAG （AC）3 CATATTCCAA 330 P
Y08 TCATATTCTG （CA）10…（AC）5 GCCCATTAGA 488 C
Y09 TATGTTTTTC （TA3） AATGTCTGCG 517 P
Y10 ACCATGGTGG （AGGTGG）3 TACGGGTGAA 377 P
Y12 ATTCAAACTT （GA）5…（GA）3…（GA）6 CTTGGAGAGT 386 I
Y14 TTACACTGAT （ACC）3…（ACC）3 TACTACACCT 332 I
Y16 TGACTAGTGA （TGG）4 CGGTGTGGGT 506 P
Y19 TCTAAAGGAT （GT）7 AGATTTTGAT 558 P
Y21 ACCATAAGGG （AGAGG）2…（AGAGG）3…（AGAGG）2 ACAATGAGGA 376 I
Y22 ATGCTGTGGG （TGC）3…（CTG）3…（TGC）3 AGTGGGCTCT 420 C
Y23 CAATGCATGT （CA）3…（TC）3 ATTTGGATCG 252 C
Y27 CATGAAAACT （CA）7 CGCATGGATT 138 P
Y28 TAGGAGATTC （GA）7 GGATTTTTCT 568 P
Y29 CTTCACCCAT （ACC）4 TCCACCATAG 475 P
Y30 GCTATTACAC （CA）5…（CA）2…（CA）4 ATATAAATCT 579 I
Y36 GAGACCTCTG （TC）3 ACAGGCCTGA 324 P
Y37 CCTTTTTTTC （ACA）3 TTTTAATCCA 514 P
Y41 GTAGGCTTAC （AT）3 GCCAGGAAGT 324 P
Y44 GCTATTCACC （TA）3 CCTTTACCTT 341 P
Y45 TTTATGTATA （TG）3 AGTGTGTGTG 591 P
Y46 GAGTCACCCT （TC）3 TTCTTCGGTG 575 P
Y48 AGCAAGCGTT （ATTC）3…（TTCA）3 CCCCACGGAC 751 C
Y49 CTTCACCCAT （ACC）4 TCCACCGCAG 478 P
Y51 TACCATCAAA （CT）2（AC）5…（CA）2 CCCTTCACAT 585 C
Y52 GAATACATGG （AT）3 TTCCTAAAGA 464 P
Y53 AACCCTAACA （AG）11 GGGCCCAAAG 485 P
Y54 CAGACGTGTG （GA）5…（GA）7 AGTGTGAAGA 614 I
Y55 TAGGGTGCAT （CA）4…（CA）3 TGACATACAA 443 I
Y56 CTGTGGTGGA （GGT）4 ATAGGTGAAG 477 P
Y59 AGCAGAATCA （CT）10 GTGCTGAACT 491 P
Y63 TTCCCCATCC （GA）3…（GA）3 TGAAAATGAA 435 I
Y65 GGGAGTCAAG （GA）3…（GA）7…（GA）3 CCAATGAAGC 242 I
Y66 AGATCTTCAT （CA）6 CTCACACCAT 634 P
Y69 AGAACTCACA （CT）3 TGTTGTAGAT 236 P
Y71 CTTCACCCAT （ACC）3 TCCACCACAG 475 P
Y72 TGAGCTGTAT （TG）3 TAACAGAGGT 311 P
Y73 AAAGTCAAGA （AGG）5 ATGTTGCCCT 659 P
Y75 TAGCAGAATC （CT）8 GCCGAACTTT 657 P
Y76 TCCTCATTGT （CCTCT）2…（CCTCT）3…（CCTCT）2 CCCTTATGGT 298 I
Y77 ACAATGATAA （TGG）3 GGGTGTTGGT 471 P
Y80 TTCTGCCAGA （TG）3…（TG）3 GCATCGGTAG 628 I
Y86 AAACATGAAA （AC）5…（AC）3 CTGCTAAAAA 149 I
Y88 AGTTGTATGT （TG）4…（TG）4 ACGCACACTA 449 I
Y89 TTAGCCCGCG （CCA）3…（CCA）2 CAGTTCAACA 461 I
Y90 CTTCACCCAT （ACC）4 TCCACCATAG 486 P
Y93 AAATCAAGCC （ACA）3 AAAGAAGTGC 617 P
Y99 TCCCACACCT （CCA）6 TCAACATGTT 647 P
Y100 TTTATTGTTT （CA）3…（CA）7…（AT）3 TCGTAATAAA 293 C
Y102 GTTGAATGAC （GGT）4 GGCGGTGTGG 727 P
Y336 TATACATTTA （AC）10 AATTTCAAGA 172 P
P ： 完美型（Perfect）；I ： 非完美型（Imperfect）；C ： 复合型（Compound）
98
4
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
法进行云南松微卫星文库的构建是高效、可行的。
经测序分析， 在 143 条含有 SSR 的序列中， 完美型
占 65.73%， 非完美型占 23.78%， 混合型占 10.49% 。
Winter 等［21］研究认为， 在真核生物基因组中， 一
般完美型比例要显著高于非完美型， 本研究与该规
律相符。
磁珠富集法涉及到高质量基因组 DNA 的获得、
酶切消化、连头与酶切片段 DNA 的连接、连接产物
的富集、载体连接克隆等步骤， 各个过程是连续且
相互依存的， 较关键的一步是磁珠富集的效率和特
异性［9］， 不含 SSR 的 DNA 也被吸附到磁珠表面形
成非专一性吸附［22］， 直接影响微卫星序列获得的效
率。对不同的探针长度、杂交条件和洗脱条件报道
较多， 然而利用这些条件对微卫星富集效率的影响
开展调查分析较少［17］。起初 Kandpal 等［23］对洗脱
时的温度提出一定的标准， 以尽可能地洗掉非专一
性吸附的多余片段， 仅保留富含微卫星序列的目的
片段。Gao 等［20］研究报道将杂交温度和首次洗涤温
度提高到 60℃ 可基本消除非专一性吸附的现象。邓
欣等［9］在花生的微卫星分离中， 将杂交温度和首次
洗涤温度提高到 68℃， 取得了较满意的效果。本研
究中将该温度提高到 66℃， 也获得比较好的结果。
因此， 不同物种 SSR 富集文库构建时， 其富集的条
件可能不一样， 富集过程杂交和洗涤的温度需要进
行比较和优化。
结论
采用磁珠富集法进行云南松基因组微卫星文库
的富集， 在随机挑选的 383 个阳性克隆中， 有 257
个菌落含有扩增条带 ； 在获得的 159 条序列中， 有
143 条含有 SSR， 其中完美型占 65.73%， 非完美型
占 23.78%， 混合型占 10.49% 。磁珠富集法构建云南
松基因组微卫星文库高效、可行。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）