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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):132-139
海洋微生物药物是海洋药物与生物技术重要的
交叉领域，海洋真菌作为海洋微生物的重要组成类
群，具有生物活性代谢产物丰富且相对易于培养的
优点，从海洋真菌中筛选生物活性物质已成为海洋
收稿日期 ：2014-11-06
基金项目 ：国家自然科学基金项目（20902009），中国博士后科学基金项目（2011M500051，2012T50258），广东省“扬帆计划”引进紧缺
拔尖人才项目（201433009），广东海洋大学引进人才科研启动项目（E15155），广东海洋大学创新强校工程项目（GDOU2014030502，
GDOU2014050203），广东海洋大学自然科学研究项目（C14519）
作者简介 ：鲍海燕，女，硕士研究生，研究方向 ：海洋真菌的生物活性，E-mail ：baohaiyanbhy@163.com ；谷朋娟同为本文第一作者
通讯作者 ：张翼，男，硕士生导师，研究方向 ：海洋药用生物资源的研究与利用 ；E-mail ：hubeizhangyi@163.com
海洋真菌提取物损伤大肠杆菌 DNA 活性的筛选及
活性菌株研究
鲍海燕1  谷朋娟1  张翼2  穆军3  冯妍2  赵辰燕1
（1. 大连交通大学环境与化学工程学院，大连 116028 ；2. 广东海洋大学食品与科技学院 广东省水产品加工与安全重点实验室 水产品深加
工广东普通高等学校重点实验室，湛江 524088 ；3. 浙江海洋学院海洋科学与技术学院，舟山 316022）
摘 要 ： 从海洋微生物中筛选抗菌、抗肿瘤物质是海洋药物研究的热点之一，而筛选模型在研究中起着重要作用。建立了
可用于抗菌及潜在抗肿瘤活性物质筛选的大肠杆菌差异性 DNA 修复试验模型，并运用该模型对海洋共附生真菌的提取物进行了筛
选。结果显示，5 株海洋真菌的提取物具有较强的选择性抑制 DNA 损伤修复基因缺陷型大肠杆菌的活性，可能具有 DNA 损伤作用。
对这 5 种活性真菌进行了分子生物学鉴定，而且薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）- 活性追踪显示这些菌株可产生较多样
化的活性物质。
关键词 ： 海洋微生物 ；大肠杆菌差异性 DNA 修复试验模型 ；鉴定
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.020
Screening the Extracts of Marine Fungi for the Activity of Damaging
the DNA of Escherichia coli and Researches on Active Strains
Bao Hanyan1 Gu Pengjuan1 Zhang Yi2 Mu Jun3 Feng Yan2 Zhao Chenyan1
（1.College of Environmental and Chemical Engineering，Dalian Jiaotong University，Dalian 116028 ；2.College of Food Science and
Technology of Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory for Processing and Safety of Aquatic Products，Key
Laboratory of Further Processing Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088 ；3. College of Marine
Science and Technology，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022）
Abstract ： Screening of antimicrobial and antitumor agents from marine microorganisms is one of the hot spots for the research of marine
drugs, and screening models play an important role in the study. The authors set up an Escherichia coli differentiated DNA damage repair test
model, which can be used for the screening of antimicrobial and potential antitumor substances. This model was further applied to screen the
bioactivities of the extracts of marine symbiotic fungi. As the result, five marine fungal strains’ extracts showed strong selective inhibition to
E. coli strains with DNA damage repairing genes-deficiency, i.e, the potential of damaging DNA. The five strains were identified by molecular
biological methods. Furthermore, analyses by thin layer chromatography（TLC）and high performance liquid chromatography（HPLC）-bioactivity
tracing revealed that these strains produced diverse bioactive substances.
Key words ： marine microorganisms ；Escherichia coli differentiated DNA damage repair test model ；identification
2015,31(8) 133鲍海燕等：海洋真菌提取物损伤大肠杆菌DNA活性的筛选及活性菌株研究
药物研究的热点，据不完全检索，仅天然产物数据
库（Dictionary of Natural Products 2011）中收录的海
洋真菌抗菌与抗肿瘤活性化合物就已达 87 个［1］，新
的报道仍不断涌现［2，3］。
众所周知，高效、灵敏、可靠的药物筛选模型
对药物发现非常关键。就抗肿瘤药物筛选而言，最
常用的细胞毒体外筛选模型也存在一些局限性，如
对实验条件的要求和运行成本都比较高，不太适合
大量粗提物样品的经济快速筛选。而从药物作用机
理来看，很多抗肿瘤或抗菌药物的作用机制主要
是作用于 DNA，而多数对 DNA 有损伤的物质虽有
一定毒性但也有抗肿瘤或抗菌作用，其中毒副作用
小的可望用做临床药物［4］。大肠杆菌（Escherichia
coli）差异性 DNA 损伤修复试验（Differentiated DNA
damage repair test，DDRT）是一种用于检测物质对
DNA 损伤能力的试验方法，它以一对大肠杆菌菌株
（其中一个具有正常的 DNA 损伤修复能力，而另外
一个存在相应的基因缺陷）经样品处理后生长受抑
制程度的差异来判断样品是否具有损伤 DNA 的作
用，该方法被用于环境毒物遗传毒性评价，也被用
于抗菌与潜在抗肿瘤物质活性筛选，该方法用于筛
选抗肿瘤药物，简单快速，与肿瘤细胞株模型的结
果具有一定的相关性［5-7］，还可兼顾抗菌活性，且
适合于大量粗提物样品的快速经济筛选。本研究建
立该方法并对本实验室保藏的分离自大连潮间带海
洋生物的共附生真菌［8，9］发酵提取物进行活性筛选
与相关研究，旨在为从海洋微生物中筛选抗菌抗肿
瘤物质用于海洋药物研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 供筛选菌株 ：本实验室保藏的海洋真
菌 66 株 ；指示菌株 ：来自耶鲁大学菌种库，包括野
生型大肠杆菌和缺陷性大肠杆菌两种，编号分别为
AB1157（+）、AB3027（-）。
1.1.2 培养基　海洋真菌培养基（1 L）：蔗糖 20 g、
马铃薯汁 500 mL、4% 的人工海水 500 mL、pH 自然。
如需固体培养基，则加入 1.5%-2% 的琼脂粉。营养
琼脂培养基（1 L）：蛋白胨 10 g、牛肉膏 3 g、NaCl 5 g、
琼脂粉 15 g、纯水 1 000 mL、pH 自然。均高压蒸汽
灭菌。
1.2　方法
1.2.1 指示菌悬液的制备 指示菌 E. coli AB1157
（+） 和 AB3027（-） 的 斜 面 经 37℃ 两 次 活 化 培 养
后，在超净台中加入少量无菌生理盐水洗涤菌落摇
匀，分别倒入无菌试管，并均稀释至 0.5 麦氏浊度
（OD600 = 0.136）。
1.2.2 大 肠 杆 菌 差 异 性 DNA 损 伤 修 复 模 型 的 验
证 采用平皿滤纸片法检测博莱霉素、丝裂霉素、
阿霉素、5- 氟尿嘧啶、氨苄青霉素、紫杉醇 6 种药
物各自对这两株大肠杆菌指示菌的抑制差异性。
将 100 μL 指示菌［AB1157（+）或 AB3027（-）］
悬液均匀涂布在营养琼脂平板表面，静置待表面稍
干，用镊子贴上滴加有 5 μg 和 2 μg 药物（溶剂为
25 μL 纯水或甲醇）并晾干的无菌滤纸片，每个指
示菌种、每种药物、每个剂量做 3 个平行，以滴加
25 L 甲醇并晾干的滤纸片为阴性对照。每个平皿均
匀贴 7 片滤纸片，背面做好标记。将平皿于 4℃倒
置扩散过夜后，取出于 37℃倒置培养 12-16 h，取
出、测量记录抑菌圈直径，并用抑菌圈直径数据计
算药物对这两株指示菌的抑菌圈直径比［AB3027
（-）/AB1157（+）］以及该比值的平均值和标准差，
并采用 t 检验分析其比值与 1 之间的差异显著性
（n=9）。
1.2.3 海洋真菌的发酵与提取 将在固体培养基上
培养 3 d 活化的待筛菌种，接种到每个含 100 mL 海
洋真菌液体培养基的 500 mL 锥形瓶中，无菌透气膜
封口后 28℃静置培养 20 d。培养结束后，加入少量
乙酸乙酯过夜杀菌，抽滤分离菌丝体与发酵液。菌
丝体用 100 mL 甲醇浸泡过夜后抽滤，得滤液 ；发酵
液用 1/2 体积乙酸乙酯萃取 3 次，收集乙酸乙酯层 ；
将菌丝体提取物与发酵液提取物合并后旋转蒸发仪
45℃浓缩至干，用少量甲醇∶二氯甲烷（1∶1）多
次溶解洗涤后转入样品瓶，定容至 3 mL，冷藏备用。
1.2.4 活性物质的筛选
1.2.4.1 初筛 将每种样品一个滤纸片（滴加 25 μL
提取物）晾干后贴到涂有 100 μL 指示菌 AB3027（-）
的营养琼脂平皿上，使用模型验证相同的方法培养，
并观察、测量抑菌圈直径。对于抑菌圈较明显（抑
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8134
菌圈大于 8 mm）的样品，使用同样的方法重复筛选
1 次（二次初筛）。
1.2.4.2 复筛　将初筛得到的样品用两种指示菌缺
陷型 AB3027（-）和野生型 AB1157（+）共同实验，
进行复筛。配制两种指示菌的新鲜菌悬液，每种指
示菌、每个样品做 3 个平行。在培养箱中 37℃培养
12-16 h 后取出，测量记录不同样品分别对两种指
示菌抑菌圈的直径，并进行数据分析，选出具有强
DNA 损伤活性的样品。
1.2.5 强活性菌株的分子生物学鉴定及薄层层析指
纹图谱
1.2.5.1 分子生物学鉴定　对复筛得到的菌株进行
分子生物学鉴定，包括 DNA 提取、PCR 扩增、电
泳以及测序［8］。测序引物为真菌通用引物 ITS1 和
ITS4，将测序得到的核糖体 DNA 内转录间隔区（ITS
rDNA）全序列提交 GenBank 进行 BLAST 检索，与
数据库中已有菌株的 ITS rDNA 序列进行相似性比
较。并用 Clustal W 进行序列比对后，采用 Mega 4.0
软件构建系统发育进化邻接树［10］。
1.2.5.2 薄层层析（TLC） 用毛细管吸取活性样品
各约 5 μL 点样于 GF254 硅胶薄层层析板，置层析缸
中以二氯甲烷∶甲醇（V/V=20∶1）为展开剂展开后
取出晾干，置于 254 nm 及 365 nm 的紫外灯下观察
并拍摄图像，再喷茴香醛 - 硫酸显色剂后加热显色，
用扫描仪记录图像。
1.2.6 强活性样品的高效液相色谱 - 活性追踪
1.2.6.1 液 相 分 离 与 96 孔 板 收 集 活 性 样 品 经
3 000 r/min、20 min 离心后，分别取 20 μL 进行依利
特 P230 型高效液相色谱分析，色谱柱为 4.6×250
mm，5 μm 粒径 Hypersil 填料的 C18 柱，流动相为甲醇 -
水系统（梯度洗脱），流速 0.6 mL/min，将 96 孔板
置于检测器后的流出口，从第 3 孔起每 30 s 一孔依
次收集流分直至 46.5 min（第 96 孔）。收集完毕后，
每孔用甲醇补满，用多道移液枪移 1/2 到另一个空 96
孔板中，一一对应，即一个样品对应两个 96 孔板（分
别用于培养两株大肠杆菌指示菌）做好标记。将 96
孔板置于超净台中，用无菌风吹至近干，再置于洁
净的真空干燥箱中彻底干燥。
1.2.6.2 指示菌孵育与 DNA 损伤活性追踪 先将 96
孔板表面及边缘用酒精棉擦拭后，揭开盖子置于超
净台紫外杀菌 20 min。其后在每块 96 孔板的 A 行
第 1 孔加 180 μL 培养基和 20 μL 的生理盐水（空白），
第 2 孔加入 180 μL 的培养基和 20 μL 的菌悬液（对
照），其余各孔均加入 180 μL 的培养基和 20 μL 的
菌悬液，小心的水平晃动混匀。每个样品对应的两
块 96 孔板中，一个加 AB1157（+）的菌悬液，另一
个加 AB3027（-）的菌悬液。将 96 孔板于 37℃培养
16-18 h 后，在各孔中加入 25 μL 的 MTT 显色剂（2
mg/mL），于 37℃再培养 30 min，拍照，并用酶标仪
测 540 nm 波长下各孔光吸收值（A）。
1.2.6.3 数据处理与作图 使用 Excel 软件，根据公
式［抑菌率（IR）= 100%×（A 对照 -A 样品）/（A 对照 -
A 空白）］计算各孔抑菌率，然后计算每个样品每个时
间点（ti）的对两种指示菌的抑菌率差值，即抑菌率
差值 =IRti，AB3027（-）-IRti，AB1157（+），作抑菌率差值 - 时
间折线图，此即样品的选择性抗大肠杆菌［AB3029
（-）与 AB1157（+）］活性色谱图。通过活性色谱图
与 HPLC 谱图的对照，可指认样品中的活性峰。
2 结果
2.1 筛选模型的验证
理论上讲，如果某药物对这一对指示菌存在无
差别的抑制活性，则抑菌圈直径比值应等于 1。如
图 1 所示，博莱霉素、丝裂霉素 C、阿霉素和 5- 氟
尿嘧啶这 4 种抗肿瘤药物对这两株指示菌［AB3027
（-）/AB1157（+）］的抑菌圈直径比值均大于 1，且
t 值均大于 t0.05（2.306），说明其对两种指示菌抑菌
圈的比值与“1”之间都存在显著差异，其中以博
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0 ≘㣴䶂䴹㍐ ঊ㧡䴹㍐ э㻲䴹㍐C㦟⢙਽〠ሩᤷḷ㧼AB3027/AB1157
Ⲵᣁ㧼സ 䱯䴹㍐ 5-≏ቯ౗஦
5 μg
2 μg
图 1 五种抗菌或抗肿瘤药物对两种指示菌的抑菌圈
直径之比
2015,31(8) 135鲍海燕等：海洋真菌提取物损伤大肠杆菌DNA活性的筛选及活性菌株研究
莱霉素（2 μg）、丝裂霉素（5 μg、2 μg）和阿霉素
（5 μg、2 μg）最为显著，其 t 值均大于甚至远大于
t0.01（3.355）（如丝裂霉素 2 μg 对应的 t 值为 12.38），
说明它们都显示出了预期的 DDRT 差异活性（即对
缺陷型菌株的抑制强于对野生型的抑制）。而氨苄
青霉素在 2 μg 时 t=3.75 略大于 t0.01，可认为与“1”
之间具有显著差异，但差异不算太大，说明在该剂
量下对两种指示菌活性差别较小 ；而在 5 μg 剂量下
t=18.09，远大于 t0.01，说明存在较显著差异，其具体
机制有待研究。另外，筛选中也发现紫杉醇对两种
指示菌均无抑制活性（即无抑菌圈）。
2.2 活性物质筛选结果
2.2.1 初筛结果 考虑到样品数量较多，先用指示
菌 AB3027（-）进行了初筛，从 66 株海洋真菌的提
取物中发现了 48 株样品具有清晰的抑菌圈。在这些
活性样品中有 14 个样品抑菌圈直径大于 8 mm，如
表 1 所示。
表 1 纸片扩散法初筛中显示相对较强抑制 E. coli
AB3027（-）活性的样品
样品名称 抑菌圈直径 /mm 样品名称 抑菌圈直径 /mm
6-N 32.5±1.3 DLEN2008024 13±2.0
6-F 14.5±2.8 DLEN2008015 14±2.5
11-N1 10±0 DLEN2008001 8.5±0.3
15-F 10.5±0.8 DLEN2008008 8±0.8
11-N2 11±1.0 DLEP2008014 8.5±0.3
DLS2008006 10±0 DLEP2008008 10±0.3
DLS2008002 10.5±0.8 DLEN2008006 19.5±4.3
2.2.2 复筛的结果 为考察这些活性样品是否具有
DNA 损伤活性，从上述初筛结果中选取抑菌圈不
小于 10 mm 的 11 个样品，进行了同时拮抗两株指
示菌的复筛实验。结果（表 2）表明，有 5 株真菌
的提取物样品即 6-N、6-F、DLEN2008006、15-F 和
DLEN2008024，表现出明显的选择性抑制缺陷型大
肠杆菌的活性，可用于进一步的菌种鉴定及提取物
成分研究。
表 2 同时使用 E. coli AB1157（+）和 AB3027（-）作为
指示菌的纸片扩散法复筛结果
样品名称
抗 AB1157（+）大肠
杆菌抑菌圈直径 /mm
抗 AB3027（-）大肠
杆菌抑菌圈直径 /mm
6-N 24.0±1.5 31.3±0.5
6-F 11.3±1.9 18.5±0.7
11-N1 9.8±0.6 9.5±0
15-F 10.3±0.9 13.0±0
DLEN2008024 8.3±0.5 11.0±0
DLEN2008015 8.2±0.2 9.3±0.6
11-N2 8.0±0 9.5±0.8
DLS2008002 9.5±0 9.0±0
DLEP2008008 11.2±0 -
DLEN2008006 13.0±2.2 26.5±4.9
DLS2008006 9.0±0 -
2.3 活性菌株的分子生物学鉴定及TLC指纹图谱
通过真菌通用引物 PCR 扩增了该 5 株活性真菌
的核糖体 RNA 基因内转录间隔区（ITS1-5.8S-ITS2
rDNA） 序 列， 测 得 的 序 列 用 BLAST 与 GenBank
中已知序列进行比对，显示它们与已知种属的相
似 度 都 达 到 了 99%-100%（ 表 3）；而 且， 其 序
列 与 GenBank 中 收 录 的 相 同 及 相 近 种 属 的 同 源
序 列 一 起 构 建 了 系 统 发 育 树（ 图 2）， 也 显 示 菌
株 DLEN2008006、6-F 和 15-F 分 别 与 曲 霉 属 的
Aspergillus clavatus、A. sydowii 和 A. fumigatus 亲缘关
系较近，菌株 6-N 和 DLEN2008024 则分别与粪壳菌
纲的 Chaetomium globosum 和 Glomerella acutata 有较
近亲缘关系。由此确定了这些菌株的种属，它们都
表 3 五个活性菌株的测序和比对结果
菌株号 / 样品号 ITS 序列长度 /bp 学名 中文名
与 GenBank 中已知相应种属菌株
序列 Blast 比对相似度 /%
GenBank 序列登录号
6-N 541 Chaetomium globosum 球毛壳霉 99 GU244529
6-F 534 Aspergillus sydowii 萨氏曲霉 99 GU244528
DLEN2008006 567 Aspergillus clavatus 棒曲霉 99 GU266275
15-F 559 Aspergillus fumigatus 烟曲霉 100 GU244530
DLEN2008024 549 Glomerella acutata 尖小丛壳菌 100 GU244527
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8136
属于子囊菌门中的盘菌亚门。
而且，薄层层析（图 3）显示，在同一培养条件
下，这 5 个菌株的次生代谢产物也有较大的差异，
同属于曲霉属的 6-F、15-F 和 DLEN2008006 的次生
代谢指纹差别显著。
品的 HPLC 谱图与其选择性抑制大肠杆菌［AB3027
（-）/AB1157（+）］活性色谱图对应起来。结果（图 4）
显示，该 5 个样品的 HPLC 色谱图呈现较大的差异，
这与分类学及 TLC 分析结果是一致的 ；而且这 5 个
样品中的主要活性色谱峰也各不相同。
菌株 6-N 提取物中选择性抑制缺陷型大肠杆菌
的活性主要集中在保留时间为 8.75 min 的显著色谱
峰，其对缺陷型菌株及野生型菌株的抑制率差值达
到 100% ；6-F 提取物中选择性抑制缺陷型大肠杆菌
的活性色谱峰的分布比较分散，有多个峰抑菌率差
值介于 50%-70% 之间 ；DLEN2008006 提取物中保
留时间 6.25 min 的显著色谱峰显示了最强的选择活
性，其对缺陷型大肠杆菌与野生型菌株的抑制率差
值达到 100% ；15-F 提取物中保留时间为 4.75 min
和 41.25 min 的色谱峰显示了相对较强的选择活性，
其抑制率差值均在 70% 左右 ；而菌株 DLEN2008024
提取物中的色谱峰选择活性相对都比较弱，保留时
间为 5.25 min 的色谱峰达到 50% 左右的抑菌率差值。
另外，上述样品中都存在一些色谱峰具有“负”
的选择活性，即对缺陷型菌株及野生型菌株的抑制
Aspergillus
Glomerella
Chaetomium
class Sordariomycetes
Subdivision Pezizomycotina
Subdivision Saccharomycotina
90
100
99
99
96
99
36
86
88
99
99
89
0.05
KF669482 Aspergillus clavatus
HQ285547 Aspergillus clavatus
HQ698595 Aspergillus clavatus
GU266275 DLEN2008006
FR733879 Aspergillus giganteus
GU244530 15-F
FJ810502 Aspergillus fumigatus
JF815069 Aspergillus fumigatus
AF455465 Aspergillus fumigatus
HG964330 Aspergillus sydowii
GU244528 6-F
EF652451 Aspergillus sydowii
EU543988 Aspergillus sydowii
KC253961 Aspergillus sydowii
GU244527 DLEN2008024
FJ478061 Glomerella acutata
AB729126 Glomerella acutata
JN697576 Glomerella acutata
EU520227 Glomerella glycines
GU183110 Chaetomium cristatum
GU244529 6-N
FJ772001 Chaetomium globosum
GU183111 Chaetomium globosum
AY429050 Chaetomium globosum
Z95942 Saccharomyces cerevisiae
图 2 根据 ITS1-5.8S-ITS2 rRNA 基因序列构建的 5 株活性真菌的系统发育邻接树
1 2 3 4 5
DCM:MeOH=12:1
1 ：6-N ；2 ：6-F ；3 ：15-F ；4 ：DLEN2008006 ；5 ：DLEN2008024
图 3 五种活性样品的薄层层析图像（254、365 nm 双波长
检测）
2.4 活性样品的HPLC-活性跟踪实验
通过 HPLC-C18 柱分离、96 孔板收集及随后对
两种指示菌的抑制活性测试与数据分析，可将各样
2015,31(8) 137鲍海燕等：海洋真菌提取物损伤大肠杆菌DNA活性的筛选及活性菌株研究
率差值为负值，特别是菌株 6-F（保留时间 2.75 min
无紫外吸收的活性峰）和 DLEN2008024（保留时
间 41.25 min 的色谱峰）中都出现了抑菌率差值为
-100% 的色谱峰，这些色谱峰对应的物质也可用于
8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
-100
-50
0
50
100ᣁ㧼⦷ᐞ٬/% ؍⮉ᰦ䰤/min 6-N8.75 min
8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
-100
-50
0
50
100ᣁ㧼⦷ᐞ٬/% ؍⮉ᰦ䰤/min 6-F2.75 min
8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
-100
-50
0
50
100ᣁ㧼⦷ᐞ٬/% ؍⮉ᰦ䰤/min 15-F4.75 min 41.25 min
8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
-100
-50
0
50
100ᣁ㧼⦷ᐞ٬/% ؍⮉ᰦ䰤/min DLEN200800066.25 min
8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
-100
-50
0
50
100ᣁ㧼⦷ᐞ٬/% ؍⮉ᰦ䰤/min DLEN2008024
B
5.25 min
41.25 min
0.00 8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
0
300
600
900
1200
1500૽ᓄᓖ/mAU ؍⮉ᰦ䰤/min 6-F2.75 min0.00 8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
0
300
600
900
1200
1500૽ᓄᓖ/mAU ؍⮉ᰦ䰤/min 6-N8.75 min
0.00 8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
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1500૽ᓄᓖ/mAU ؍⮉ᰦ䰤/min 15-F4.75 min 41.25 min
0.00 8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
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1500૽ᓄᓖ/mAU ؍⮉ᰦ䰤/min DLEN20080245.25 min 41.25 min
A
0.00 8.75 17.50 26.25 35.00 43.75
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图 4 五株活性真菌提取物的 HPLC 色谱图（254 nm，A）和选择性抗大肠杆菌［AB302F（-）/AB1157（+）］活性
色谱图（B）（箭头标明主要活性色谱峰）
非 DNA 损伤机制抗菌药物的研究。
3 讨论
从海洋微生物中寻找抗肿瘤、抗菌活性物质是
海洋药物研究的重要课题，而经济高效的筛选模型
在研究工作中至关重要，一些采用特殊的微生物或
其他低等生物作指示的方法常被用于对大量发酵粗
提物的活性初筛，如大肠杆菌生化诱导分析（BIA）
法、海虾致死法、稻瘟霉法等［11-13］。大肠杆菌差
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8138
异性 DNA 损伤修复试验法（DDRT）用于筛选基于
DNA 损伤机制的抗肿瘤抗菌药物，具有简单、快速、
灵敏和经济的优点，可发现在不同位点、经各种途
径诱导遗传损伤的样品，且能兼顾抗菌与抗肿瘤活
性，适合于需要大量微生物发酵粗提物样品的筛选。
大肠杆菌菌株对 E. coli 343/591 和 E. coli 343/636 曾
被引入国内用于该方法［14］，本研究则采用了曾用于
环境遗传毒理研究的大肠杆菌菌株对 E. coli AB3027
（-）（DNA 损伤修复基因缺陷型）和 E. coli AB1157
（+）（具有正常 DNA 损伤修复功能的野生型）来建
立该模型［7］。
在该模型对 DNA 损伤活性物质的响应能力验
证实验中，博莱霉素、丝裂霉素 C、阿霉素和 5- 氟
尿嘧啶这 4 种抗肿瘤药物都显示出了预期的 DDRT
差异活性（即对缺陷型菌株的抑制强于对野生型
的抑制），这可能与它们的作用机制均针对 DNA 有
关［15-18］；而前人药理学研究指出紫杉醇作用于微管，
与 DNA 无关［19，20］，本研究也显示它对这两株指示
菌均无抑制。这些结果表明由这对大肠杆菌菌株组
成的 DDRT 模型确可用于检测选择性损伤 DNA 的
物质。当然该模型也存在一定局限性，在具体应用
中最好能与肿瘤细胞株等模型结合使用，进行分级
筛选，但作为一个经济的初筛模型仍然具有自身的
价值。
使用该筛选模型，本研究发现 5 株海洋真菌显
示出了较强的 DDRT 差异活性，很可能具有 DNA
损 伤 活 性， 它 们 均 来 自 子 囊 菌 门（Chaetomium、
Aspergillus 和 Glomerella 属）。目前已经报道发现的
作用机制为损伤 DNA 的真菌天然产物并不多，检
索表明天然产物词典（Dictionary of Natural Products
on DVD） 中 收 录 的 真 菌 产 生 的 直 接 或 间 接 损 伤
DNA 活性的化合物仅 9 例报道，主要来自子囊菌
（Paecilomyces、Alternaria、Fusarium 和 Oidiodendron
属 ） 和 担 子 菌（Marasmius、Curvularia 和 Lactarius
属），化合物类型包括蒽醌或萘醌衍生物、二萜衍
生物、生物碱以及含吡喃酮或呋喃酮结构的化合物
等［1］。而本研究发现的菌株不同于这些已经报道的
种属，且系统发育分析及 TLC、HPLC-活性跟踪显
示它们具有生物学和化学的多样性，因此从中发现
新的 DNA 损伤活性物质可能性较大。
值得注意的是，这些菌株中弥散分布、含量较
低但仍显示出中低选择活性（对两种指示菌的抑制
率差值多数在 40%-60% 之间）的色谱峰多样性也
很高，这为寻找多样性的 DNA 损伤活性物质提供了
启示和深入研究的线索。其中有些活性峰可能是因
为含量低，使得差别显现得还不够充分，如果加大
进样量，可能会更加凸显。另外，也不排除其中有
些是受到指示菌的生长状态不均衡、96 孔板间移液
操作不准确等实验误差的影响所造成的假阳性，采
取更多的实验重复可能会排除这种影响。
当然，尽管对 DNA 损伤修复基因缺陷型大肠
杆菌的选择性抑制表明这些样品可能作用于大肠杆
菌的 DNA，但其损伤效应还有待彗星实验的直观
验证［21］，其抗肿瘤潜力及对高等动物正常体细胞
DNA 是否具有损伤作用也有待深入研究。
4 结论
本研究建立了一种基于缺陷型 / 野生型大肠杆
菌菌株对的 DNA 损伤活性筛选模型，该模型对于
丝裂霉素 C、阿霉素等抗肿瘤药物都有较好的响应，
可用于抗菌及潜在抗肿瘤活性物质的筛选，因其成
本低廉、操作简单的特点尤其适合海洋微生物等涉
及大量粗提物的活性筛选。运用该模型，我们对实
验室保藏的海洋真菌菌株进行了筛选，发现了 5 株
活性海洋真菌，鉴定了其种属并对其 TLC 特征及活
性成分进行了追踪分析，研究表明这些菌株具有较
好的生物与化学多样性。
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（责任编辑 李楠）