全 文 ：·综述与专论· 2012年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-07-28
基金项目 : 福建省自然科学基金（2010J01207）, 福建省重点项目（2008Y0084）
作者简介 : 尹帮旗 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 基因药物 ; E-mail:yinbangqi526@163.com
通讯作者 : 李招发 , 男 , 博士 , 副研究员 , 研究方向 : 基因工程和生物医学工程 ;E-mail:lizhaofa@hqu.edu.cn
AAV 在基因治疗中的靶向修饰研究进展
尹帮旗1 连文昌1 惠二京1 李招发1,2
（1华侨大学分子药物学研究所 , 泉州 362021 ；2华侨大学分子药物教育部工程研究中心 , 泉州 362021）
摘 要 : 安全、有效、具有靶向性的病毒载体是基因治疗药物在临床上得以应用的关键。AAV 是微小病毒科的一种，它能
以其低的免疫原性及广泛的宿主性对人及灵长类进行感染，并且经过改造后的 AAV 病毒能更有效的靶向性特定组织及肿瘤细胞。
重点对 AAV 病毒载体的衣壳蛋白基因工程修饰、转录调控修饰和转录后 microRNA 干扰表达修饰及衣壳蛋白化学修饰靶向机理，
以及改造方法进行介绍。修饰后的 AAV 能改善其感染引起的性免疫反应、转染效率和肿瘤靶向性。
关键词 : 基因治疗 基因工程修饰 腺相关病毒 重组腺相关病毒
Progress in Targeting Modification of Viral Vector AAV in
Gene Therapy
Yin Bangqi1 Lian Wenchang1 Hui Erjing1 Li Zhaofa1,2
（1Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021 ；2Molecular Medicine Engineering Research Center of the
Ministry of Education，Huaqiao University，Quanzhou 362021）
Abstract: Safe, effective and targeting viral vector is the key of gene therapy for clinical application. Adeno-associated virus （AAV）
belong to the family of Parvoviridae. It is a small virus which can infects humans and some other primate species with low-immunogenicity and
extensive host cell. Beside, modificated AAV can target the specifical tissus and tumor cells effectively. In this article, introduce the principles
and methods of the genetic engineering modification of AAV capsid proteins, the transcription regulation modification of target gene expression,
the post-transcription regulation modification of microRNA interference in target genes translation, and the chemic modification of AAV capsid
proteins were introduced. The modificated AAV can improve the immune response from self-assemble of virus, its transfection ratio, its tumor
target.
Key words: Gene therapy Genetic engineering modification Specific promoter Adeno-associated virus （AAV） rAAV
AAV 病毒载体因其高转染率、持续性表达及感
染细胞范围广等优势，在基因治疗的载体选择中备
受青睐［1］。但在将外源基因导入细胞的过程中，病
毒载体的非特异性感染及携带基因的非特异性表达
常引起免疫反应及脱靶现象，以致 AAV 作为靶向
载体在基因治疗中的应用受到限制［2］。因此开发
安全、有效、高靶向的 AAV 病毒载体是基因治疗
取得进一步成功的关键。修饰后的 AAV 病毒载体
成功的作为靶向基因治疗载体的应用，使病毒载体
靶向治疗在造福人类的道路上又向前迈进了坚实的
一步，它不但能解决 AAV 病毒的非特异性感染及
脱靶现象，还能够消除转基因引起的免疫反应。开
发肿瘤靶向的 AAV 病毒载体，是拓展基因治疗的
新领域。本研究就 AAV 靶向修饰的基因工程修饰、
转录调控修饰及转录后调控的 RNA 干扰修饰及化
学修饰的研究进展作一综述。
1 AAV 衣壳蛋白基因工程修饰
1.1 AAV衣壳蛋白的插入和突变修饰
AAV 基 因 组 由 两 个 大 的 开 放 读 码 框（open
reading frames，ORFs）， 即 rep and cap［3］。rep ORF
编码 4 个与病毒复制、DNA 包装及转录调节和选择
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期34
性剪接相关的蛋白。cap ORF 编码 AAV 的 3 个主要
结构蛋白 VP1、VP2 和 VP3，这 3 个蛋白是 cap ORF
由 p40 启动子启动通过选择剪切，从不同的起始密
码子开始表达产生的，且拥有相同的终止密码子。
因此，VP1、 VP2 和 VP3 拥有相同的 C-末端。VP1、
VP2 和 VP3 C-末端 530 个左右的氨基酸序列是完全
相 同 的，VP2 在 N 端 比 VP3 多 65 个 氨 基 酸 残 基，
VP1 又比 VP2 在 N 端多 135 个氨基酸残基［4-6］。
目前 AAV 衣壳蛋白基因水平修饰方法主要有两
种，其一是在 AAV 基因的耐受位点插入基因片段改
变其衣壳表位 ；其二是采取一定的方法诱导 AAV 衣
壳蛋白基因发生改变产生新型衣壳表位［7-9］。
Yang 等［10］利用插入修饰的方法顺利的开发出
一种能靶向 CD34 细胞的 AAV。Chapman 和 Wu 等［11,12］
进一步研究发现，在 AAV 衣壳蛋白的一些特定的位
点插入一些氨基酸序列不会影响 AAV 基因的衣壳包
装和转染，如在 AAV2 的 VP1 的 N端 34 氨基酸处，
VP2 的 N-末端处（图 1-A），以及在推测为衣壳蛋白
的表面环区域（图 1-B，图 1-C）的 266 氨基酸处、
447 氨基酸处和 591 处和 664 氨基酸处插入血球凝
集素（hemagglutinin，HA）都不会影响 AAV 衣壳包装，
并且能改变其转染趋向性。Loiler 等［13］制备一种带
有（ApoE）配体的 AAV 颗粒，ApoE 配体能靶向胰
岛细胞和肝细胞低密度脂蛋白受体，rAAV/ApoE 病
毒大大的增强了胰岛细胞和鼠肝细胞的转导效率，
这种新病毒颗粒与天然的 rAAV2 相比，改造后的
rAAV/ApoE 颗粒对胰岛细胞和鼠肝细胞的感染效率
分别提高了 220 倍和 4 倍。
图 1 衣壳蛋白可插入和突变修饰对应的氨基酸位点图
随 后，Grifman，Nicklin 和 White 等［14-16］ 研 究
团队分别利用插入修饰的方法制备了靶向 CD13 表
达细胞、HUVEC 细胞、动脉粥样硬化损伤细胞修饰
的 AAV 颗粒。除此之外，其他研究团队也分别通过
插入修饰的方法，在 AAV 衣壳上插入选择肽制备了
具有不同靶向性。如 Shi 等［17］制备靶向整合素表达
A. VP1 和 VP2 可以插入特异性配体的氨基酸位点示意图；B. 丙氨酸突变分布和血球凝集素（hemagglutinin，HA）插入突变位点，是由 Chapman 等 [11]
对比细小病毒衣壳蛋白序列推测所得的 AAV 衣壳蛋白二级结构示意图，圆形和方形的部位为丙氨酸突变位点、插上小旗子的圆和方形表示 HA 插
入突变位点，箭头部位表示 β-折叠，螺旋线部位表示 α-螺旋 ；C. 一个参照 CPV VP2 结构而得的 AAV VP3 二聚体正二十面体的二重轴电脑分子模
拟图 [12]，粗线部位表示 β-折叠，箭头所示部位表示 VP3 肝素结合区域，黑色方框表示 VP3 其余部位，圆点（432）表示 R432 突变成一个丙氨酸，
其余圆点分别表示 HA 插入突变位点氨基酸残基位点
2012年第2期 35尹帮旗等 ：AAV 在基因治疗中的靶向修饰研究进展
细胞 ；White 等［18］制备的靶向内皮细胞 ；Work 等［19］
制备的靶向肺和脑脉管系统 ；Yu 等［20］制备的靶向
心组织的 AAV 颗粒，并且获得很好的靶向基因治疗
效果。
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能
之间复杂关系的有力工具，也是实验室中改造和优
化基因常用的手段，对某个已知基因的特定碱基进
行定点改变、缺失或者插入可以改变对应氨基酸
序列和蛋白质结构，可以进一步了解蛋白质结构
和功能之间的关系，探讨蛋白质的结构域。虽然
AAV2 作为基因治疗载体有着多种优越特性，但天
然的 AAV2 病毒作为基因治疗载体时存在抗体敏感
性［21］。Huttner 等 在 AAV2 衣 壳 蛋 白 的 第 587 氨 基
酸后的肝素结合位点附近进行插入突变发现，人血
清中和这种插入突变 AAV2 的能力平均减少了 15
倍［9］。Lochrie 等［22］ 进一步用点突变技术在 AAV2
外表面 64 处进行了 127 个点突变修饰发现，其中有
10 个单氨基酸位点突变（S267A，S267T，R459A，
R471A，D494E，N496A，N497H，K532A，R585K
和 R588K），4 个多氨基酸位点突变（S498A/R729K，
R471A/G586A，R471A/N587A 和 R471A/G586A/
N705A）的 AAV2 的转染效率明显高于野生型 AAV2，
特 别 是（V708K） 位 点 突 变 的 AAV2， 与 野 生 型
AAV2 相比，鼠单克隆抗体（A20）抗体与（V708K）
位点突变的 AA2 的结合能力减少了 10 倍，鼠单克
隆抗体（A20）抗体中和突变的 AA2 的能力减少
了 220 倍，免疫球蛋白中和（W502A）位点突变的
AAV2 的能力减少了 10 倍。Stachler［23］采用类似的
方法，通过特定位点突变修饰制备了有更好靶向性
的新的 rAAV 颗粒。
综上可知，天然的 AAV 经过对衣壳蛋白进行插
入和突变修饰能很好的改善其基因治疗的靶向性及
降低其被抗体中和的特性，从而提高修饰后的 AAV
的转染率，修饰后的 AAV 病毒载体与野生型 AAV
相比能具有更好的应用价值。
1.2 定向筛选AAV衣壳蛋白的嵌合体
到 2008 年为止已经发现了 12 种不同血清型的
AAV 病毒颗粒，这些不同血清型 AAV 颗粒的理化特
性各异［24］。研究表明，不同血清型的 AAV 的转染率
及组织特异性有着很大的差别［25］，并且发现来自人不
同组织的 AAV 也存在一定差异，但是有很近的亲缘
关系［26-28］。这 12 种 AAV 的遗传进化树，见图 2-A。
A. AAV1-12 的进化树，描述了各种血清型之间的进化关系 [33] ；B. 重叠
PCR 构建重组 AAV 衣壳基因文库示意图 [34] ；C. 对重组 AAV 衣壳蛋白进
行特异性筛选 [29]
图 2 AAV 嵌合体修饰图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期36
根据 AAV 病毒颗粒的这种同源性可以通过 PCR 改组
（shuffling）或 PCR 交错延伸（staggered extension proce
dure，STEP）重组具有同源性不同血清型 AAV 衣壳
蛋白的 DNA 序列得到新的杂合 rAAV 衣壳蛋白 DNA
序列（图 2-B）。因此，可以通过这种重组方法构建
新 rAAV 病毒文库 , 然后进行定向进化筛选，能制备
抗抗体中和的新型 rAAV 病毒颗粒。Maheshri 等［29］
用 PCR 突变和 PCR 重组方法构建并筛选到体外减
少抗体对其中和能力（图 2-C），体内改变受体结合
特性的新型 rAAV 病毒颗粒，在体外，经过两轮定
向筛选得到的新 rAAV 颗粒与野生型 AAV 相比，抗
体中和新 rAAV 病毒颗粒的能力减少到原来的 96 倍。
随后 Grimm 等［30］用类似的方法在血清抗体存
在的环境下筛选到高效感染人肝细胞系的嵌合体
rAAV 颗粒。Li 等［31］也用类似的方法筛选到高效转
导仓鼠黑色素瘤 CS1 细胞的 rAAV 颗粒 ；Ward 等［34］
也用类似的方法筛选到与已知 AAV 相比能更好的结
合肝癌 Hep G2 细胞的新 rAAV 颗粒，Maersch 等［32］
用类似的方法对 AAV 免疫表位随机重组筛选优化也
得到了能逃避免疫（immune-escaping）的新的 rAAV
病毒颗粒。
综 上 可 知， 天 然 的 AAV 经 过 PCR 改 组
（shuffling），PCR 交错延伸及错配 PCR 进行衣壳蛋
白重组，定向进化筛选能得到转染效率更高，特异
性和抗中和能力更强的新型 rAAV 病毒载体。
2 构建转录调控的 rAAV 病毒载体
真核生物基因由编码 mRNAs 序列和非编码序
列组成［35,36］。非编码序列主要由启动子和增强子组
成，启动子是位于编码序列前面一段碱基序列，经
常被用作基因治疗转录调节的靶向位点。效应元件
是一类影响转录因子结合调节基因转录的功能序列，
一些效应元件位于启动子内，但大多数效应元件位
于启动子外，这些效应元件经常成簇存在，形成增
强子或沉默子区域。任何细胞特异基因转录表达的
时效性由启动子和细胞自身转录因子相互作用决
定［35-37］。基因治疗转录靶向是用病毒载体带上特异
启动子和治疗基因进入特定细胞里，能在该细胞环
境下持续特异表达的治疗基因方法（图 3）, 这样的
转录调控表达能增强病毒载体在基因治疗中的靶向
综上可知，构建转录调控的 rAAV 能改善 AAV
在基因治疗中的脱靶现象，使 AAV 介导的基因治疗
在疾病治疗中得到更广泛的应用。
转录靶向基因治疗原理图，用肿瘤内皮细胞启动子驱动治疗基因
的特异表达来达到特异性治疗肿瘤的效果，这种方法只用肿瘤内
皮细胞特殊启动子，而不用正常生理水平的启动子，从而达到靶
向肿瘤的治疗效果
图 3 AAV 转录水平调控图
性［38］。
Mochizuki 等［39］构建由巨细胞病毒（cytomega-
lovirus，CMV）启动子启动的苯基丙氨酸羟化酶（phe-
nylalanine hydroxylase, PAH） 基 因 组 成 的 rAAV 基
因治疗病毒，在 40 周治疗试验过程中，明显缓解
了苯丙酮尿症症状，使苯基丙氨酸羟化酶基因缺
陷鼠的行为得以恢复，取得了很好的治疗效果。随
后 Bartoli 等［40］，Shahrokh 等［41］ 和 Zhang 等［42］ 与
其研究团队分别构建了携带钙调蛋白 3 基因，视网
膜紫质激酶启动子启动的锥视杆细胞感光体基因，
端粒酶启动子启动的 TRAIL 基因的 rAAV 病毒颗粒，
并用这些重组的 AAV 对其基因缺陷病及肝细胞癌进
行基因治疗，均获得了理想的治疗效果。研究显示，
这种 AAV 介导的转录靶向治疗对肿瘤内皮细胞也有
很好的靶向治疗效果［43］。
2012年第2期 37尹帮旗等 ：AAV 在基因治疗中的靶向修饰研究进展
3 构建转录后 microRNA 调控的 rAAV 病毒
载体
microRNA 能 调 节 AAV 病 毒 载 体 的 靶 向 性 主
要是因为它能作为一种转录后小分子调节物来实现
对基因表达转录后水平的调控。这种调控机制主
要通过 5 端的前 2-8 个核苷酸的种子序列（Seed
sequence） 识 别 mRNA 3 端 非 翻 译 区（3UTR） 来
实现转录后水平基因的表达调控［44］。因此，将含
有组织特异性或肿瘤特异性的 microRNA 靶向元件
（miRNA target element, miRTE）的靶盒置于目的基因
或 AAV 病毒载体关键元件的 3UTR 区，就能通过
内源性 microRNA 来调控目的基因的表达，达到转
录后水平调控，并实现 AAV 病毒载体的靶向性［45］。
许 瑞 安 等［47］ 的 研 究 发 现， 含 有 miR-122 和
miR-142-3p miRTE 的辅助质粒产生的 rAAV 病毒载
体能解决其在基因治疗中由于自我复制引发的免
疫 问 题， Wolff 等［48］ 以 质 粒 DNA 为 载 体， 将 4 个
miR-142-3p miRTE 克隆到目的基因的 3UTR，得出
了相同结果，由 microRNA 调节的靶向性 AAV 病
毒载体可以消除转基因表达引起的免疫反应。构建
microRNA 调节的低免疫原性同时携带肿瘤特异性启
动子 AAV 病毒载体，来研究 AAV 病毒载体在基因
治疗中的靶向性，是 AAV 病毒载体在基因靶向治疗
中的新研究方向。
4 AAV 衣壳蛋白化学修饰
聚乙二醇修饰又称分子的 PEG 化（PEGylation），
将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，能影响蛋
白质的空间结构，使蛋白质生物活性发生改变。聚
乙二醇修对病毒颗粒衣壳蛋白修饰主要是降低病毒
颗粒的抵抗蛋白酶水解的能力，减低免疫原性和毒
性，延长体内半衰期，降低血浆清除率等。Lee 等［49］
对 AAV 病毒载体进行 PEG 修饰时，发现修饰后的
AAV 病毒血浆清除率明显提高。
羟丙甲丙烯酸甲酯 poly-［N-（2-hydroxypropyl）
methacrylamide］（HPMA）与 PEG 有类似的修饰效果，
活化的 HPMA 共聚物对病毒载体进行修饰时，主要
是通过覆盖病毒衣壳蛋白表面的抗原决定簇来达到
减低病毒载体免疫原性，延长其体内半衰期，降低
血浆清除率的效果。Fisher 等［51］ 以 HPMA 为基础
的共聚物（Copolymers）对腺病毒（Adv）进行化学
修饰，能明显增强 Adv 的抗血浆清除能力。Robert
等［50］用带有氨基反应活性的噻唑烷 - 硫酮（amine-
reactive thiazolidine-2-thione （TT） groups）HPMA 共
聚物作为 decalysine（K10）K10 和基础纤维生长因
子（basic fibroblast growth factor （FGF2）） 的 连 接 子
（linkage）对 AAV5，AAV8 进行化学修饰，修饰后
的 AAV5GFP-HPMA-K10，AAV5GFP-HPMA-FGF2，
AAV8GFP-HPMA-K10，AAV8GFP-HPMA-FGF2， 与
修饰前的 AAV5，AAV8 相比免疫原性和血浆清除率
明显降低，体内半衰期增强，从而提高了其在基因
治疗中的靶向性和转染效率。
综上可知，通过活化的 PEG 和 HPMA 等高聚物
对 AAV 衣壳蛋白进行化学修饰，能较大程度地提高
AAV 病毒载体的免疫原性和血浆清除率，延长体内
半衰期，使 AAV 病毒载体在基因治疗中的靶向性和
转染效率。
5 展望
基因治疗在人类疾病治疗中的地位越来越来重
要。特别是对癌症［51］、糖尿病［55］、血友病［52］等顽
固性疾病的治疗用常规方法很难完全治愈。基因治
疗在治愈这些顽固性疾病中优势越发明显，其应用
前景被人们普遍看好。因此，只有开发一种能够高效、
靶向、治疗可控及持续、低免疫原性的基因治疗方法，
才能更好的治疗这些顽固性疾病。AAV 病毒载体以
其能有效感染不分裂的细胞、低的病原性及实现长
期持续基因表达等特点，已经广泛用于基因治疗研
究［26］。但是由于 AAV 病毒载体本身［53］及其转基因
产物的非特异性表达等缺点［2］常引起免疫反应，不
能实现基因治疗持久治疗的效果。因此 AAV 病毒载
体作为基因治疗的载体的靶向性、治疗基因的可控
性、免疫原性等仍是当前基因治疗迫切需要解决的
问题。
AAV 病毒载体靶向修饰成为提高 AAV 病毒载
体在基因治疗中的新思路。本实验室长期从事用
AAV 病毒载体作为基因治疗载体对血友病［46, 52］、
癌症［54］、糖尿病［55］等恶性疾病进行基因治疗研究。
并在努力尝试开发 AAV 衣壳蛋白基因工程修饰、
构建转录调控及转录后调控的重组 AAV 病毒载体，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期38
特别是近期通过构建转录后调控的重组 microRNA
干扰的 AAV 病毒载体，成功开发了一种新型的、
细胞特异性的、内含多个组织特异如肝特异和造血
特异序列拷贝的 microRNA 结合序列的基因片段，
通过转录后调控包装蛋白基因片段的翻译表达，彻
底解决了在以肝脏为靶器官的血友病基因治疗中
具有复制能力的 AAV 病毒污染问题［47］。如果将这
些优点同时应用于病毒包装的辅助质粒和目的基
因质粒，将能同时解决因载体本身和转基因产物分
别诱发的免疫反应问题。相信随着靶向修饰 AAV
病毒载体的开发成功，基因治疗这门年轻的学科定
能造福人类。
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（责任编辑 狄艳红）
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