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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
苹果早期落叶病是多种能够引起苹果树早期落
叶病害的总称，主要包括苹果斑点落叶病、苹果褐
斑病、苹果灰斑病、苹果圆斑病和苹果轮斑病等。
其中，斑点落叶病、褐斑病是我国苹果主产区普遍
发生且危害最为严重的病害之一 ［1-3］。从 20 世纪 70
年代开始有此病害发生的报道后，各苹果主产区相
收稿日期 ：2013-05-14
基金项目 ：陕西省科学院青年基金项目（2010k-27）
作者简介 ：冉淦侨，女，硕士，助理研究员，研究方向 ：植物保护 ；E-mail ：ranganqiao@163.com
枯草芽孢杆菌 BS24 在苹果叶面的定殖及其对
叶面菌群的影响
冉淦侨1  王楠2  戴佳锟3  赵文娟1  任平1  秦涛1
（1. 陕西省科学院酶工程研究所，西安 710600 ；2. 郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州 450001 ；
3. 陕西省酶工程技术中心，西安 710600）
摘 要 ： 为了进一步明确枯草芽孢杆菌 BS24 对苹果早期落叶病的生防作用，分别对 BS24 菌株在苹果叶面上的定殖作用及
其对叶面其它微生物种类和数量的影响进行了考察。结果表明，在田间条件下，BS24 菌株能在苹果叶面成功定殖，但随时间的变
化呈下降趋势 ；在无降雨等恶劣天气影响的情况下，喷施菌剂 15 d 后，叶面检测到的 BS24 菌株的活菌量从最初的 2.52×107 CFU/g
成熟叶下降至 2.11×105 CFU/g 成熟叶。与未喷施菌剂的叶面微生物菌群对比，喷施菌剂后苹果叶面菌群的数量显著下降 ；且种类
上，喷施菌剂后的苹果叶面细菌种类少了栖稻假单胞菌、洛菲不动杆菌、 Bacillus lehensis 和玫瑰库克氏菌；真菌种类少了细交链孢菌、
Eupenicillium janthinellum 和大丽轮枝菌。
关键词 ： 苹果早期落叶病 枯草芽孢杆菌 定殖 微生物分离纯化 分子鉴定
Colonization of Bacillus subtilis BS24 on the Apple Leaf Surface and
Their Effects on the Leaf Microbial Flora
Ran Ganqiao1 Wang Nan2 Dai Jiakun3 Zhao Wenjuan1 Ren Ping1 Qin Tao1
（1. Institute of Enzyme Engineering，Shaanxi Academy of Science，Xi’an 710600 ；2. School of Food and Bioengineering，Zhengzhou
University of Light Industry，Zhengzhou 450001 ；3. Enzyme Engineering Technology Center of Shaanxi Province，Xi’an 710600）
Abstract:  To confirm the biocontrol efficacy of the Bacillus subtilis BS24 strain against apple early defoliation disease, the colonization of
BS24 strains on apple leaves and their effects on the other microbial species and populations were studied respectively. The results showed that
under field conditions BS24 strains could colonize on apple leaves, but the population size declined with prolonging time. In the absence of rain
and other inclement weather situations, the population size of BS24 strain increased from the initial 2.5×107 cfu/g to 2.1×105cfu/g after spraying
the microbial agents for 15 days. Compared with the apple leaf microorganisms without spraying agents, the microbial populations on apple leaves
declined after 20 days of spraying agents, meanwhile the bacteria of Pseudomonas oryzihabitans, Acinetobacter lwoffii, Bacillus lehensis and
Kocuria rosea and the fungi of the Alternaria alternate, Eupenicillium janthinellum and Verticillium dahliae were not detected.
Key words:  Apple early defoliation diseases Bacillus subtilis Colonization Isolation and purification of microorganism Molecular
identification
继发生，且发病率逐年上升，危害越来越大［4，5］。
据报道，2000-2006 年陕西省部分县区苹果早期落
叶病发病率达 100%，造成了大面积的苹果减产，损
失巨大。
目前，苹果早期落叶病的防治多采用化学方法，
但防效并不理想。近年来一些学者着重研究生物防
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期132
治，取得了可喜成绩。陈亮等［6］从苹果树根际土壤
样品中分离筛选出对该病具有广谱拮抗作用的枯草
芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS24 菌株 ；试验表明，
该菌对苹果斑点落叶病和褐斑病的病原菌拮抗效果
显著，对苹果其他几种病害如灰斑病、圆斑病、轮
斑病、腐烂病、轮纹病、炭疽病等的病原菌也有较
好的拮抗效果，具有良好的生防应用潜力。本研究
进一步对该 BS24 菌株在苹果叶面的定殖能力及其对
叶面微生物菌群的影响进行研究，旨在为该菌株的
生防机理提供理论依据，同时为其田间应用提供理
论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌 BS24 菌株由西北
大学生命科学学院陈五岭教授提供 ；病原菌 ：苹果
斑 点 落 叶 病 病 原 菌（Alternaria alternata f. sp. Mali，
AAM）、苹果褐斑病病原菌（Marssonina coronaria（Ell
Et Davis）Davis，MCD）由陕西省微生物研究所馈赠。
1.1.2 培养基 BS24 菌株的培养用营养肉汤培养
基 ；BS24 菌 株 发 酵 培 养 基 配 方（g/L）：蛋 白 胨 5
g，蔗糖 10 g 牛肉膏 5 g，氯化钠 5 g，酵母膏 5 g，
pH7.2-7.4 ；真菌培养用 PDA 培养基 ；真菌分离培养
基是在孟加拉红培养基中加入过滤除菌的 0.1 g/L 链
霉素 ；真菌纯化培养基采用孟加拉红培养基 ；细菌
培养和纯化用营养琼脂培养基 ；细菌分离培养基是
在营养琼脂培养基中加入过滤除菌的 0.1 g/L 钠他霉
素 ；放线菌培养和纯化用高氏一号培养基 ；放线菌
分离培养基是高氏一号培养基加入过滤除菌的 0.075
g/L 重铬酸钾和 0.002 g/L 青霉素 ；苹果斑点落叶病
病原菌及苹果褐斑病病原菌都用 PDA 培养基。
1.1.3 主要溶液 10 g/L 链霉素溶液，1 g/L 利福平
溶液，100 g/L 纳他霉素溶液，均参见冉淦侨［7］的
方法配制。
10 g/L 重 铬 酸 钾 溶 液 ：准 确 称 取 1.000 0 g 重
铬酸钾，先用 50 mL 蒸馏水溶解，加水定容至 100
mL，装于棕色瓶中，避光常温保存，保质期 3 个月。
1 g/mL 青霉素溶液 ：准确称取 1.000 0 g 青霉素，
加入于 500 mL 蒸馏水中，充分混合溶解后加水定容
至 1 000 mL，-18℃冰箱保藏备用。
电泳缓冲液（TAE）：参照《分子克隆》［8］中要
求配制。
1.1.4 供试品种及地块 供试苹果品种为红富士，
树龄 16 年 ；地点为陕西省乾县乾陵山坡上，试验用
地为坡地，黄壤土，垄植，海拔约 930 m，面积约
100 m2 左右。
1.2 方法
1.2.1 抗利福平标记菌株的诱导与培养 首先测定
BS24 菌株对利福平的敏感浓度为 0.006 g/L，然后配
制利福平浓度分别为 0.005、0.007、0.01、0.02、0.04、
0.08、0.16 和 0.32 g/L 的营养肉汤培养基及相应的营
养琼脂平板，接下来采用含利福平的营养肉汤梯度
与平板梯度交替培养法［9］对 BS24 菌株进行诱导与
培养，最终获得抗利福平标记菌株 BS24-r。
1.2.2 BS24 在苹果叶面的定殖及其数量检测 参照
冉淦侨［7］的方法进行。具体方法如下 ：将 1.2.1 中
的抗利福平标记菌株 BS24-r 接种于装有 100 mL 营
养肉汤培养基的 500 mL 三角瓶中，30℃、180 r/min
培养 12 h，制成种子液。按 5% 的接种量将种子液
接入装有 100 mL 发酵培养基的 500 mL 三角瓶中，
30℃、180 r/min 下培养 48 h，制成菌量为 2.84×109
cfu/mL，芽孢率为 85% 的液体微生物菌剂。田间喷
施菌剂时，按比例将菌剂稀释 100 倍，制成活菌量
为 2.84×107 CFU/mL 的菌悬液。BS24-r 菌悬液均匀
喷施于苹果叶面，分别于 1、3、7、11、15、17 和
20 d 取样回收，果园采样按五点取样法［10］，采集成
熟叶片 50 片，在无菌条件下将其充分混合，然后随
机取 20 片，用直径为 1 cm 的无菌打孔器取叶片组
织块，称取其中 3 g 叶片组织块放入含有 300 mL 无
菌水的三角瓶中（在瓶中加入玻璃珠），150 r/min 摇
床振荡 30 min 后，用无菌水对菌悬液做梯度稀释，
每处理设 3 个重复。采用平板系列稀释法测定菌数，
取 0.1 mL 的稀释液涂于含有 0.32 g/L 的利福平营养
琼脂平板中，每个稀释度设 3 次重复，在 30℃下培
养 72 h 后，计数生长在培养基表面的菌落。
1.2.3 对苹果叶面微生物菌群的影响 通过对喷施
和未喷施 BS24 菌剂的苹果叶面微生物进行分离鉴
定，研究 BS24 菌株对苹果叶面其它微生物的种类及
数量的影响。
2013年第10期 133冉淦侨等 ：枯草芽孢杆菌 BS24 在苹果叶面的定殖及其对叶面菌群的影响
1.2.3.1 叶面微生物的分离与计数 叶子标样的采
集与处理同 1.2.2，用无菌水将菌悬液按 10-1、10-2、
10-3 和 10-4 做系列梯度稀释，取 0.1 mL 稀释液分别
涂布于真菌分离培养基、细菌分离培养基和放线菌
分离培养基表面，每个稀释度设 3 次重复，30℃下
培养 2 d 后开始对细菌和放线菌计数，培养 3 d 后开
始对酵母菌和霉菌计数。根据菌落大小、形态和颜
色等表型特征将分离菌株进行初步分类，对不同类
别的菌株进行编号，并采用平板划线分离法对其进
行纯化（划线纯化 3 代），得到纯菌株后转至相应的
斜面培养基上培养，待长出菌落后，置于 4℃冰箱
保藏备用。
1.2.3.2 叶面微生物的鉴定 形态鉴定 ：将纯化后
的细菌和放线菌分别转接至营养琼脂平板上，真菌
转至 PDA 平板上，30℃恒温培养，观察其菌落形态。
细菌制片方法 ：挑取细菌单菌落制片，结晶紫染色，
显微镜下观察其菌体形态。真菌制片方法 ：取 10
mL 已灭菌的 PDA 培养基倾注于直径 9 cm 的平板上，
待培养基凝固后，用灭过菌的手术刀将培养基切成
1 cm 的正方块，并将此培养基块置于灭菌的载玻片
上，载玻片置于平板中的 U 型管上（直径 9 cm 的平
板上铺上一层滤纸，用灭过菌的 2%（V/V）的甘油
将滤纸充分浸湿，滤纸上放置一个 U 型管，并将载
玻片置于 U 型管上 ；U 型管的作用为支撑载玻片防
止其滑落到下面的滤纸上）。挑取真菌菌丝或孢子沿
培养基块的四边接种，接种后的培养基块表面盖上
灭过菌的盖玻片，合上平板盖，置于 30℃恒温培养；
培养 3 d 后，每隔 1 d 将平板中的载玻片取出置于显
微镜下观察其菌丝、孢囊及孢子形态；参照魏景超［11］
的专著进行初步鉴定。
分子鉴定 ：具体方法参照冉淦侨［7］的细菌、放
线菌和真菌的分子鉴定方法进行。
2 结果
2.1 BS24在苹果叶面的定殖
苹果叶面喷施含抗利福平标记菌株 BS24 菌液
后 0-20 d 内，平均每天气温 15℃ -26℃，风力 1-2 级，
其间 16-18 d 有连续降雨。从图 1 结果可知，1-15 d，
受田间恶劣环境条件影响（如紫外线照射、空气干燥、
刮风等），BS24 菌株表现出明显的不适应，菌量从
最初的 2.52×107 CFU/g 成熟叶降至 2.11×105 CFU/g
成熟叶，降幅达 99.16%；16-18 d，受连续降雨的影响，
菌量进一步大幅下降至＜ 103 CFU/g 成熟叶，直到喷
施菌剂后 20 d，叶面上仍然回收不到目标菌。综上
所述，BS24 菌株能在苹果叶面上定殖，但只能定殖
一段时间。
从 菌 量 的 消 长 动 态 看， 处 理 7 d 后，BS24 菌
株在苹果叶面上菌量下降至 1.565×106 CFU/g 成熟
叶，临近其发挥防效作用的最低菌浓度标准（1×106
CFU/g 成熟叶）。因此，BS24 菌株对苹果早期落叶
病的防效可维持 7 d。田间施用时，为了确保 BS24
菌株在田间的生防效果，有必要在喷施菌剂 7 d 后
再对叶面补喷一次菌剂，使其保持一定的种群优势。
此外，从试验结果可知，降雨对 BS24 菌株在苹果叶
面上的定殖有显著影响，降雨后菌量大幅下降。因此，
降雨后也有必要再补喷一次菌剂。
1.00E+00
1.00E+01
1.00E+02
1.00E+03
1.00E+04
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122
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图 1 芽孢杆菌 BS24 菌株在苹果叶面上的定殖动态
2.2 对苹果叶面微生物菌群的影响
通过对喷施 BS24 菌剂前后的苹果叶面微生物
进行分离鉴定，考察 BS24 菌株对苹果叶面其它微
生物的种类及数量的影响情况。结果表明，就菌群
数量而言，喷施菌剂 20 d 后，喷施菌剂的叶面细菌
数量（1.3×105 CFU/g）显著小于未喷施菌剂叶面的
细菌数量（5.2×105 CFU/g）；喷施叶面的真菌数量
（2.1×104 CFU/g）显著小于未喷施菌剂叶面的真菌
数量（5.6×104 CFU/g）；喷施与未喷施菌剂的苹果
叶面均未检出放线菌。
就菌群种类而言，喷施菌剂 20 d 后，从喷施菌
剂前后的苹果叶面上共分离到 11 株优势细菌，17
株优势真菌。经过菌落及菌体形态初步鉴定后，筛
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期134
选出 9 株不同的细菌（图 2，图 3），6 株不同真菌（图 4，
图 5），并通过 16S rDNA 和 18S rDNA 序列测定对其
进行分子鉴定（表 1，表 2）。表 1 结果显示，喷施
与未喷施叶面拥有共同的优势细菌，即成团泛生菌
（Pantoea aqqlomerans）、微小杆菌属（Exiguobacterium
acetylicum）、氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）、
吉氏芽孢杆菌（Bacillus qibsonii）和巨大芽孢杆菌
（Bacillus megaterium）；栖稻假单胞菌（Pseudomonas
oryzihabitans）、洛菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）、
芽孢杆菌属（Bacillus lehesis），以及玫瑰库克氏菌
（Kocuria rosea）仅为未喷施叶面上优势菌属，喷施
叶面未检出，说明 BS24 菌株对这 4 种细菌有一定
的抑制作用。表 2 结果显示，小孢毛霉（Rhizopus
microsporus）、 黄 曲 霉（Aspergillus flavus） 和 斜 卧
青 霉（Penicillium decumbens） 为 喷 施 与 未 喷 施 叶
面共同拥有的优势真菌 ；细交链孢菌（Alternaria
alternate）、Eupenicillium janthinellum 和 大 丽 轮 枝 菌
（Verticillium dahliae）仅为未喷施叶面优势真菌，喷
施叶面未检出或数量较少，说明 BS24 菌株对这 3 种
真菌有一定的抑制作用。
px-1 px-2 px-3 px-4 px-6
px-7 px-8 px-10 px-11
px-1
px-7 px-8 px-10 px-11
px-2 px-3 px-4 px-6
图 2 苹果叶面 9 种优势细菌的菌落形态特征（营养琼脂培养基上培养 48 h）
图 3 苹果叶面 9 种优势细菌的菌体形态特征（结晶紫染色）
pz-1 pz-2 pz-3 pz-5 pz-7 pz-10
图 4 苹果叶面 6 种优势真菌的菌落形态特征（PDA 培养基上培养 5 d）
2013年第10期 135冉淦侨等 ：枯草芽孢杆菌 BS24 在苹果叶面的定殖及其对叶面菌群的影响
3 讨论
Kloepper［12］认为，生防菌在靶植物位点上能否
有效定殖是生防菌能否稳定、持久发挥防效的一个
重要因素。在实际应用中，生防菌的定殖能力受菌
株自身的特性和外在环境等诸多因素的影响，这是
生防菌田间防效不稳定的重要原因之一。因此，在
田间条件下对生防菌进行定殖能力的研究十分必
要。本研究结果表明，在田间条件下，拮抗菌株
BS24 能在苹果叶面定殖，但只能定殖一段时间。在
实际应用中，为了确保生防菌的防效，有必要在处
理 7 d 后再进行一次强化接种，使其保持一定的种
群优势。此外，降雨后菌量大幅下降，因此降雨后
也有必要再补喷一次菌剂。与未喷施菌剂的苹果叶
面菌群对比，喷施菌剂后的苹果叶面真菌种类少了
Eupenicillium janthinellum 和大丽轮枝菌，细交链孢
菌在数量上也较喷施前显著减少 ；由于细交链孢菌
为黑斑病病原菌［13，14］，大丽轮枝菌为黄萎病病原
菌［15-17］，因此，研究结果再一次证明了 BS24 菌株
对苹果叶面病原菌具有广谱拮抗性。
据张庆等［18］研究报道，苹果叶面附生微生物
由真菌、细菌、酵母菌以及放线菌和自生固氮菌等
组成，且在不同的生育期，微生物的种类和数量差
别较大，没有哪一类在数量上始终占优势。其中，
放线菌与自生固氮菌有时检测不到，有时又大量出
现，波动大，本研究所得结果与张庆结果基本一致。
在本研究中，我们从苹果叶面上仅分离到细菌和真
菌，放线菌、自生固氮菌、酵母菌都未能检出。此
外，据张庆［18］报道，苹果叶面的附生微生物，真
菌 以 Cladosporium、Alternaria、Penicillium、Botrytis
等出现频率较高，细菌以 Bacillius、Pseudomonas、
pz-1 pz-2 pz-3 pz-5 pz-7 pz-10
图 5 苹果叶面 6 种优势真菌的菌丝形态特征
表 1 苹果叶面 9 种优势细菌的 16S 序列比对结果
菌株 菌落颜色 菌体形态
16S 片段
相似度（%）
鉴定结果
占未喷施菌剂叶面菌落
总数的百分比（%）
占喷施菌剂叶面菌落
总数的百分比（%）
px-1 金黄 短杆状 99 栖稻假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans） 9.3 0
px-2 淡黄 球状 98 成团泛生菌（Pantoea aqqlomerans） 10.3 18.6
px-3 土黄 球状 99 微小杆菌属（Exiguobacterium sp.） 11.5 15.4
px-4 奶白 球状 99 洛菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffii） 9.5 0
px-6 黄色 椭圆状 99 氧化微杆菌（Microbacterium oxydans） 10.7 19.1
px-7 土黄 长杆状 99 吉氏芽孢杆菌（Bacillus qibsonii） 12.1 21.2
px-8 土黄 杆状 99 芽孢杆菌属（Bacillus lehensis） 10.8 0
px-10 土黄 杆状 100 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium） 17.5 25.7
px-11 奶黄 球 状 99 玫瑰库克氏菌（Kocuria rosea） 8.3 0
表 2 苹果叶面 6 种优势真菌的 18S 序列比对结果
菌株
16S 片段
相似度（%）
鉴定结果
占未喷施菌剂叶面菌落
总数的百分比（%）
占喷施菌剂叶面菌落
总数的百分比（%）
pz-1 99 小孢毛霉（Rhizopus microsporus） 11.3 20.1
pz-2 100 细交链孢菌（Alternaria alternate） 20.2 6.3
pz-3 98 黄曲霉（Aspergillus flavus） 10.3 32.0
pz-5 99 斜卧青霉（Penicillium decumbens） 16.9 41.6
pz-7 98 Eupenicillium janthinellum） 21.3 0
pz-10 98 大丽轮枝菌（Verticillium dahliae） 20.0 0
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期136
Xanthomonas 等 的 出 现 频 率 较 高， 这 与 本 研 究 结
果不一致。在本研究中，真菌仅检出 Alternaria 和
Penicillium， 细 菌 仅 检 出 Bacillius 和 Pseudomonas。
由此说明，不同地区、不同品种的苹果叶面微生物
差别较大，分析其原因可能是由于地理位置、气候
类型以及生态条件的不同引起的苹果叶面微生物种
群的差异。
4 结论
在田间条件下，枯草芽孢杆菌 BS24 菌株能在苹
果叶面上定殖，但只可定殖一段时间。喷药后第 15
天，BS24 菌株在苹果叶面上菌量从最初的 2.5×107
CFU/g 成熟叶下降至 2.1×105 CFU/g 成熟叶。与未喷
施菌剂的苹果叶面菌群对比，喷施菌剂后苹果叶面
微生物菌群的数量和种类均发生改变 ；数量上，喷
施菌剂后叶面的细菌数量（1.3×105 CFU/g）显著小
于未喷施菌剂叶面的细菌数量（5.2×105 CFU/g），
真菌数量（2.1×104 CFU/g）也明显小于未喷施菌
剂的真菌数量（5.6×104 CFU/g）；种类上，喷施菌
剂后叶面细菌种类少了栖稻假单胞菌、洛菲不动
杆菌、 lehensis 芽孢杆菌和玫瑰库克氏菌 ；真菌少了
Eupenicillium janthinellum 和大丽轮枝菌，细交链孢
菌在数量上也较喷施前减少了。
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（责任编辑 马鑫）