全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2012-02-08
作者简介 : 汪文静 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 资源与环境微生物 ; E-mail: wj.rebecca.wang@hotmail.com
通讯作者 : 谢响明 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 资源与环境微生物 ; E-mail: xiangmingx@sina.com
白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶基因的克隆及
生物信息学分析
汪文静 吴慧君 王晓宇 杨颖 厚凌宇 郑瑞珠 谢响明
（北京林业大学生命科学与技术学院，北京 100083）
摘 要： 乙酰木聚糖酯酶可以水解乙酰化木聚糖中的 O-乙酰取代基团，消除该基团对木聚糖酶水解的空间阻碍作用，增强
木聚糖酶对木聚糖的亲和力和降解能力。以白色链霉菌基因组为模板，利用简并 PCR和 TAIL-PCR扩增获得长约 741 bp阅读框片段，
编码 247个氨基酸。生物信息学分析表明，该多肽片段具有 AXE1家族蛋白保守区域；与已知的乙酰木聚糖酯酶蛋白 C端区相比，
相似性较高，二级和三级结构空间排布特点极为相似；初步判定该多肽片段为白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶的 C端区域。
关键词： 白色链霉菌 乙酰木聚糖酯酶 基因克隆 生物信息学
Cloning and Bioinformatic Analysis of Acetyl Xylan Esterase
Gene from Streptomyces albus
Wang Wenjing Wu Huijun Wang Xiaoyu Yang Ying Hou Lingyu Zheng Ruizhu Xie Xiangming
（College of Biologic Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）
Abstract: Acetyl xylan esterase （AXE） can hydrolyze O-acetyl in the acetylated xylan, through which it can eliminate O-acetyl’s steric
hindrance effects to xylanase hydrolysis, and enhance capacity of affinity and degradation to xylan. In this research, a new acetyl xylan esterase
gene is cloned from Streptomyces albus, using degenerate PCR and TAIL-PCR amplified. The open reading frame consists of 741 bp and encodes
247 amino acid. Bioinformatics analysis shows that the peptide fragment has conserved regions of AXE1 family proteins. This region has similar
secondary and tertiary structure with known acetyl xylan esterase protein C-terminal region, suggesting that this peptide fragment is the C-terminal
region of acetyl xylan esterase from Streptomyces albus.
Key words: Streptomyces albus Acetyl xylan esterase Cloning Bioinformatics
乙酰木聚糖酯酶可以水解掉乙酰化木聚糖中木
糖残基 C-2 和 C-3 位上的 O-乙酰取代基团，这种带
有乙酰基团的木聚糖常见于硬木、谷物和其他年生
植物中，但在软木中罕见［1］。乙酰木聚糖酯酶与内
切 -1，4-β-D- 木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-阿拉伯
呋喃糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸苷酶、阿魏酸酯酶和
香豆酸酯酶等共同组成木聚糖降解酶系［2］。其中木
聚糖酶水解木聚糖主链骨架的 β-1，4-糖苷键，是木
聚糖降解酶系中最关键的酶［3］。乙酰木聚糖酯酶可
以消除乙酰基团对木聚糖酶作用时的空间阻碍作用，
增强木聚糖酶对木聚糖的亲和力和降解能力［4］。因
此，乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶共同作用于乙酰化
木聚糖时水解效率会更高。
乙酰木聚糖酯酶于 1985 年由 Biely 等［5］第一
次报道，他们研究了乙酰木聚糖酯酶的酶学特性，
表达条件，调控机制和纯化方法等方面，发现乙酰
木聚糖酯酶对底物乙酰化的木聚糖有着比其他酯酶
更好的活力［6-8］。随后许多编码乙酰木聚糖酯酶的
基因从一些细菌和真菌中克隆出来，并进行了序
列分析。GenBank 中已发表的有 Bacillus pumilus、
Butyrivibrio fibrisolvens、Slividans、Sthermoviolaceus
OPC2250、Aniger、Neocallimastix patriciarum 等。 本
2012年第6期 123汪文静等 ：白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶基因的克隆及生物信息学分析
研究利用简并 PCR 和 TAIL-PCR，首次从白色链霉
菌中获得阅读框片段，并运用生物信息学方法进行
分析旨在为进一步研究该酶的表达、纯化及性质奠
定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
白色链霉菌（Streptomyces albus）购自中国科
学院微生物研究所菌种保藏中心，为卫生药品生
物制品检定所从波兰引进。大肠杆菌感受态细胞
（Escherichia coli）DH5α 购于北京天根生物技术有限
公司。质粒 pMD19-T Vector 购自 TaKaRa 公司。琼
脂糖凝胶回收试剂盒（DC35511-01）购于 Biomiga
公司。质粒小提试剂盒（DP103）购于北京天根生
物技术有限公司。LA Taq酶、Taq酶、T4 DNA 连接酶、
2×GC Buffer I、dNTP Mixture、Marker 购自 TaKaRa
公司。RNaseA、溶菌酶购于北京中科瑞泰生物科技
有限公司。异丙醇、苯酚、氯仿、异戊醇和乙醇等
其他化学试剂为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 设计简并引物 对已报道的其他菌种的
乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列利用（http://pfam.
sanger.ac.uk/）进行比对分析，找到两段保守区
域 PEDFDAFW 和 MDTRGQG， 结 合 密 码 子 的 简
并性以及编码乙酰木聚糖酯酶密码子的使用频
率和菌种偏好性，设计并合成简并引物 ：axe-b F
5-CCCGAGGACTTCGAYGCNTTYTGG-3，axe-b R 5-
GCCCTGGCCSCGNGTRTCCAT-3。
1.2.2 DNA 的提取及简并 PCR 扩增 采用溶菌酶
法［9］提取白色链霉菌基因组 DNA。以白色链霉菌基
因组 DNA 为模板，axe-b 简并引物为引物进行 PCR
扩增，反应程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，50℃ 30
s，72℃ 30 s，30 个循环 ；72℃ 7 min。1.0% 的琼脂
糖凝胶电泳检测 PCR 产物，并用胶回收试剂盒对产
物进行回收。
1.2.3 简并 PCR 产物的 TA 克隆与测序 将回收纯
化的 PCR 产物与 pMD19-T 载体连接，并将连接产
物转化到感受态 E. coli DH5α，并用 Xgal/IPTG/LB 平
板进行蓝白斑筛选。阳性克隆进行PCR和酶切验证，
同时测序检测目的基因片段的完整性。
1.2.4 TAIL-PCR 及目的基因的获得 根据简并 PCR
扩增获得的基因片段设计 3 条退火温度较高的嵌套
特异性引物（sperial primer，SP），并结合 4 条 Tm
值较低的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，
AD）（表 1），以白色链霉菌基因组 DNA 为模板进
行 TAIL-PCR［10］（表 2）。回收 TAIL-PCR 产物并与
pMD19-T 载体连接，转化感受态 DH5α，阳性克隆
进行测序，并对测序结果进行分析。
表 1 特异性引物（SP）和随机简并引物（AD）的序列
引物名称 引物序列（5-3）
Sp1 TACCCGAGGAACTCCACGAC
SP2 CACCAGCCCGCTGTCGAC
SP3 CAGCTCGTCCAGGGTGTCG
AD1 TG（A/T）GNAG（A/T）ANCA（G/C）AGA
AD2 AG（A/T）GNAG（A/T）ANCA（A/T）AGG
AD3 CA（A/T）CGICNGAIA（G/C）GAA
AD4 TC（G/C）TICGNACIT（A/T）GGA
1.2.5 目的基因序列的生物信息学分析 将 TAIL-
PCR 扩增获得的基因片段用 ExPasy-Transnate（http://
web.expasy.org/translate/）进行阅读框的查找与翻
译，所得到的多肽进行 BLAST（http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast.cgi）搜索，查找保守结构域，并搜寻
同源家族蛋白，分析二级结构组成特点［11-13］。利用
Swiss-Model Workplace 中的 Template Identity 进行同
源建模模板的搜索［14, 15］，Swiss Model Workplace 中
的 Automated Mode 工具进行同源建模［15-17］。将获得
的三维模型进行优化并用 PROCHECK 检测其立体化
学合理性，同时，利用 Swiss Model Work Place 中的
Anolea/QMEAN 工具对模型的组装精炼程度进行评
价，ProSA 对模型进行能量合理性评估［18， 19］。
2 结果
2.1 简并PCR扩增得到部分序列
以白色链霉菌基因组 DNA 为模板，以 AXE-b
简并引物进行 PCR 扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶
电泳，结果（图 1）显示，在 300 bp 左右存在一条
大小与理论预计值相近的核酸片段。
2.2 简并PCR产物的TA克隆与测序
将用 AXE-b 简并引物扩增获得的 300 bp 左右
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期124
PCR 产物进行切胶纯化，并与 pMD19-T 载体连接，
转化感受态 DH5α 后，用 X-gal/IPTG/LB 培养基进行
蓝白斑筛选。所挑取的阳性克隆菌落 PCR 及酶切验
证，同时进行测序。将测序所得序列利用 BLASTX
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行序列比对搜
索，发现与 GenBank 中已报道 Streptomyces sp. ACTE
（ZP 06273846.1） 和 Streptomyces avermitilis MA-4680
（NP822477.1）乙酰木聚糖酯酶基因序列的相似性较
高，分别为 78% 和 58%。
图 1 简并 PCR扩增结果
M. DNA Marker ；1. 简并 PCR 产物
2.3 TAIL-PCR及目的基因的获得
根据测序得到的核酸片段设计特异性引物 Sp1、
SP2 和 SP3，与已知简并引物 AD1、AD2、AD3 和
AD4 进行 TAIL-PCR。琼脂糖凝胶电泳（图 2）检测
1. DNA Marker ；2-4. AD1 分别与 sp1/sp2/sp3 为引物的 TAIL-PCR 产物 ；
5-7. AD2 分别与 sp1/sp2/sp3 为引物的 TAIL-PCR 产物 ；8-10. AD3 分别
与 sp1/sp2/sp3 为引物的 TAIL-PCR 产物 ；11-13. AD4 分别与 sp1/sp2/sp3
为引物的 TAIL-PCR 产物
图 2 TAIL-PCR扩增结果
成 分 贮液浓度 使用量（50 μL 体系） 循环次数 反应程序
第一轮 2×GC Buffer Ⅰ Mg2+ Plus 25 μL 1 95℃ 2 min
dNTP mix 10 mmol/L 2 μL 5 94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 2.5 min
Taq酶 5 U/μL 0.5 μL 1 94℃ 30 s，25℃ 1 min，72℃ 2.5 min
嵌套引物 Sp2 10 μmol/L 1.5 μL 10 94℃ 30 s，44℃ 1 min，72℃ 2.5 min
简并引物（AD1、AD2、AD3、AD4） 10 μmol/L 2 μL 15 94℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 2.5 min
基因组 DNA 100 μg/mL 1 μL 94℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 2.5 min
ddH2O 18 μL 94℃ 15 s，44℃ 1 min，72℃ 2.5 min
第二轮 2×GC Buffer Ⅰ Mg2+ Plus 25 μL
dNTP mix 10 mmol/L 2 μL 15 94℃ 15 s，56℃ 1 min， 72℃ 2.5 min
Taq酶 5 U/μL 0.5 μL 94℃ 15 s，56℃ 1 min，72℃ 2.5 min
嵌套引物 Sp2 10 μmol/L 1.5 μL 94℃ 15 s，44℃ 1 min，72℃ 2.5 min
简并引物（AD1、AD2、AD3、AD4） 10 μmol/L 2 μL 1 72℃ 10 min
第一轮产物（1 000 倍稀释） 100 μg/mL 1 μL
ddH2O 18 μL
第三轮 2×GC Buffer Ⅰ Mg2+ Plus 25 μL
dNTP mix 10 mmol/L 2 μL 15 94℃ 15 s，54℃ 1 min，72℃ 2.5 min
Taq酶 5 U/μL 0.5 μL 94℃ 15 s，54℃ 1 min，72℃ 2.5 min
嵌套引物 Sp3 10 μmol/L 1.5 μL 94℃ 15 s，44℃ 1 min，72℃ 2.5 min
简并引物（AD1、AD2、AD3、AD4） 10 μmol/L 2 μL 1 72℃ 10 min
第二轮产物（1 000 倍稀释） 100 μg/mL 1 μL
ddH2O 18 μL
表 2 TAIL-PCR反应体系和条件
2012年第6期 125汪文静等 ：白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶基因的克隆及生物信息学分析
的蛋白的正确读码框，可以获得如下氨基酸序列
片段 ：
利用 Compute pI/Mw 分析所获得氨基酸序列片
段理化性质，该多肽的理论等电点为 5.98，分子量
为 26.718 13 kD。对该氨基酸多肽进行 BLAST 搜
索，查找保守结域并搜寻同源家族蛋白，结果（图
3）显示，该氨基酸多肽含有与乙酰木聚糖酯酶家族
（AXE1）蛋白相同的保守结构域，并且与一条已经
鉴定的乙酰木聚糖酯酶蛋白（ZP_06575637.1）氨基
酸序列的一致性达到 75%，（E-Value 为 4e-101）。
扩增产物，切胶回收 PCR 产物并与 pMD19-T 载体
连接，转化感受态 DH5α，用 X-gal/IPTG/LB 培养基
进行蓝白斑筛选，挑选阳性克隆进行质粒提取测序。
最后得到长度为 949 bp 的目的基因片段。
2.4 生物信息学分析
2.4.1 序列分析及同源性比较 将 TAIL-PCR 扩增
所得核酸序列片段去除载体碱基序列，与简并引
物 AXE-b 扩增所得核酸序列片段进行拼接，利用
ExPASy-Transnate（http://web.expasy.org/translate/）
进行阅读框的查找与翻译，选择能编码大小合适
图 3 保守结构域的查找
2.4.2 同源建模模板的搜索与分析 该氨基酸多肽
与 3m81_C（海栖热袍菌乙酰木聚糖酶晶体结构）氨
基酸序列的一致性达到 51.98%（Evalue ：1.00e-40），
并且两者的二级结构组成相似性较高（图 4）。因此，
可以利用 3m81_C 晶体结构作为目的氨基酸序列同
源建模的模板。
图 4 axe-b与 3m81_C氨基酸序列的比对结果
2.4.3 同源建模 以 3m81_C 为模板进行同源建模，
三维模型（图 5）显示，该多肽片段由 9 个 α-螺旋
和 1 个 β-折叠组成。其中，9 个 α-螺旋环绕于 β-折
叠的周围，其空间结构排布特点与已知的海栖热袍
菌乙酰木聚糖酯酶晶体结构（1VLQ_A）C 段 180 个
氨基酸残基的空间构象极为相似。由以上结果可以
推测，该多肽片段极大可能为白色链霉菌乙酰木聚
糖酯酶的 C 端多肽区域。
2.4.4 对优化后的模型进行立体化学合理性评
估 检测优化后模型的立体化学合理性，模型的主
链和侧链立体化学构型比较合理，模型分辨率为
2.0Å。结果（表 3）显示，Ramachandran plot quality
（RP）显示蛋白的 Ø、ψ 二面角 87.2% 在核心区
域，10.1% 在允许区域，仅有 0.0% 在不合理区域，
Overall goodness factor（GF）为 0.07（理想情况下，
G 因子值应该大于 -0.5，若小于 -1.0 应该对模型重
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期126
新检测）。
对模型的组装精炼程度进行评估（图 6）发现，
模型中除少数氨基酸残基外，其余氨基酸残基的主
侧链折叠组装均较合理，模型的可信度较高，可作
为进一步研究的模型基础。
用 ProSA 对优化后模型进行能量合理性评估，
结果（图 7）显示，模型除了 N 端少数氨基酸残基以
外，其余大多数氨基酸的配对能、结合能和表面势
能总和均处于负的能量位置，处于稳定状态。
表 3 白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶模型主链和侧链立体化学合理性评估结果
主链 侧链
立体化学参数 No. of band widths from mean 立体化学参数 No. of band widths from mean
合理区域的 tage 氨基酸残基比例 0.3 Chi-1 邻位交叉负扭转角标准偏差 -1.6
Ω 扭转角标准偏差 -0.3 Chi-1 反式扭转角标准偏差 -2.3
每 100 个氨基酸残基中彼此距离
小于 2.6Å 的氨基酸残基数目 -0.4 Chi-1 邻位交叉正扭转角标准偏差 -1.9
ζ 扭转角标准偏差 -1.0 Chi-1 扭转角合并标准偏差 -2.1
主链结合能标准偏差 -0.3 Chi-2 反式扭转角标准偏差。 -2.2
蛋白结构的总体状态 1.5
主链键长 99.5% 合理，0.5% 不合理
主链键角 97.8% 合理，2.2% 不合理
3 讨论
乙酰木聚糖酯酶（acetyl xylan esterase，AXE）
作为半纤维素酶系成员之一，在提高纤维资源的生
物降解性，开发为饲料酶制剂投入工业化生产及生
物漂白等方面显示出良好的效果。迄今为止，国内
外对 AXE 的研究鲜见报道。随着 Biely 等对 AXE
图 6 利用 Anolea / QMEAN工具对模型的组装精炼程度评估结果
深色 .α-螺旋 ；浅色 .β-折叠
图 5 白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶的空间结构
2012年第6期 127汪文静等 ：白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶基因的克隆及生物信息学分析
存在于真菌纤维素和半纤维素降解系统中的报道，
AXE 与其他木质纤维素降解酶的协同作用已逐步得
到认可。目前已在 T. reesei、A. niger、S. commun、A.
pullula、S. olivochromogenes等中发现它们对 AXE 有
很高的特异性，能使木聚糖脱酰基。通过对重组乙
酰木聚糖酯酶酶学性质的研究发现，在缺乏 AXE 时，
木聚糖酶难以接近高度酰化的木聚糖的主链骨架 ；
添加 AXE 时，可以明显改善木聚糖的溶解性和降解
速度 ［20-22］ 。
一些真菌和细菌的 AXE 已经被克隆并在真核
或原核生物中异源表达。根据氨基酸序列的相似
性，目前为止 AXE 分布于 14 个碳水化合物酯酶家
族（carbohydrate esterase family，CE）中的 7 个家族，
CE1-CE7［23］。在家族 4 中的 AXEs，通常不仅具有
木聚糖乙酰酯酶活性，还有几丁质脱乙酰酯酶活
性，它们与几丁质脱乙酰酯酶具有同源性。研究还
发现，AXEs 存在同工酶，如 Thermoanaero bacterium
sp. JW/SL-YS485 中的 AXE Ⅰ和 AXE Ⅱ［24］，它们都
能使乙酰化的木聚糖脱乙酰。据推测，AXE Ⅰ在胞
内作用于短链的乙酰化低聚木糖，AXE Ⅱ在胞外去
除木聚糖的乙酰基［25］。
据 X 射线晶体学对乙酰木聚糖酯酶的空间三维
结构的研究发现，属于家族 5（CE5）的乙酰木聚糖
酯酶的核心区域有着 α/β/α 的三明治折叠结构以及
Ser-His-Asp 的催化尾部结构［26， 27］。而本研究所获
得的 AXE 多肽片段的三维模型是由 9 个 α-螺旋和 1
个 β-折叠组成，其中，9 个 α-螺旋环绕于 β-折叠的
周围，与已知的海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶晶体结
构（1VLQ_A）C 段 180 个氨基酸残基的空间构象极
为相似。利用 3m81_C 为模板，进行同源建模，并
对模型做动力学优化和合理性评估，结果表明，所
建模型的主链和侧链立体化学构型比较合理，模型
除了 N 端少数氨基酸残基以外，其余大多数氨基酸
的配对能、结合能和表面势能总和均处于负的能量
位置，处于稳定状态。主侧链折叠组装均较合理，
模型的可信度较高，可以作为进一步研究的模型
基础。
4 结论
从白色链霉菌的基因组中首次扩增获得长度为
949 bp（开放阅读框为 741 bp）的基因片段，所编码
氨基酸片段与 Streptomyces sp. ACTE（ZP06273846.1）
和 Streptomyces avermitilis MA-4680（NP822477.1）乙
酰木聚糖酯酶基因序列的相似性较高，分别为 78%
和 58%，并且具有 AXE1 家族蛋白保守区域，其三
级结构空间排布的特点与 PDB 数据库中已知晶体
结构的乙酰木聚糖酯酶 C 段区域极为相似。初步判
定该多肽片段为白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶的 C 端
区域。
参 考 文 献
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曲线 ：氨基酸残基内能（一般情况下，能量总和为正值的区域为不可
信区域）；粗线 ：以每 40 个氨基酸残基为单位的平均能量作为核心位
置氨基酸的能量 ；细线 ：以每 10 个氨基酸残基为单位的平均能量作
为核心位置氨基酸残基的能量
图 7 利用 ProSA对 axe-b进行能量评估结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期128
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（责任编辑 马鑫）