全 文 ：第 １４卷第 ２期
２０１６年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００６
收稿日期：２０１５－１１－０９
基金项目：国家自然科学基金（２１４７６１１２）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１４０９３３）；材料化学工程国家重点实验室自主课题（ＺＫ２０１４０３）
作者简介：孙朱贞（１９９０—），女，安徽马鞍山人，研究方向：微生物学、发酵工程；徐　 虹（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｕｈ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
一株产 ε 聚赖氨酸的白色链霉菌遗传转化体系
孙朱贞１，２，冯小海１，２，许召贤１，２，曹长虹１，２，徐　 铮１，２，徐　 虹１，２
（１． 南京工业大学 材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 ２１０００９；
２． 南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：为了更好地研究 ε 聚赖氨酸（ε ＰＬ）生物合成的分子机制以及构建 ε ＰＬ高产基因工程菌株，拟建立一
株 ε ＰＬ产生菌株 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 的遗传转化体系。 通过对培养基类型、孢子预萌发处理、培养基中
Ｍｇ２＋浓度等条件进行考察，以 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）为供体菌，成功地将 ｐＩＢ１３９ 质粒导入 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ
ＰＤ １中。 结果表明：质粒转化效率达到（３±０􀆰 ４） × １０－６个接合转化子 ／受体。 接合子传代实验和 ＰＣＲ 结果发现，
ｐＩＢ１３９质粒能够稳定整合在 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １染色体的 ａｔｔＢ位点上。 本研究建立了一株 ε ＰＬ生产菌株的遗传转
化体系，为从分子水平上研究 ε ＰＬ的合成及 ε ＰＬ高产菌株的构建奠定了基础。
关键词：ε 聚赖氨酸；白色链霉菌；遗传转化体系；ｐＩＢ１３９
中图分类号：Ｑ９３３；Ｓ４７６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０２－００２７－０６
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ａ ε⁃ｐｏｌｙ⁃ｌ⁃ｌｙｓｉｎｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ
ＳＵＮ Ｚｈｕｚｈｅｎ１，２，ＦＥＮＧ Ｘｉａｏｈａｉ１，２，ＸＵ Ｚｈａｏｘｉａｎ１，２，ＣＡＯ Ｃｈａｎｇｈｏｎｇ１，２，ＸＵ Ｚｈｅｎｇ１，２，ＸＵ Ｈｏｎｇ１，２
（１． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ε⁃Ｐｏｌｙ⁃ｌ⁃ｌｙｓｉｎｅ （ ε⁃ＰＬ） ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ， ｗｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ⁃１，ａ ｗｅｌｌ⁃ｋｎｏｗｎ ε⁃ＰＬ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｓｔｒａｉｎ． Ｐｌａｓｍｉｄ ｐＩＢ１３９ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ⁃１ ｗｈｅｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）
ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｄｏｎｏｒ． Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｎｊｕｇａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａ ｍａｘｉｍａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ
（３􀆰 ０±０􀆰 ４）× １０⁃６ ｐｅｒ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＩＢ１３９ ｗａｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｉｎｔｏ ｔｈｅ ａｔｔＢ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ⁃１ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＩＢ１３９ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ａｆｔｅｒ
ｐａｓｓｉｎｇ ｓｅｖｅｒａｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｉｓ ｉｎｔｅｒ⁃ｇｅｎｅｒｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ⁃１ ｗｉｌｌ
ｐｒｏｖｉｄｅ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ε⁃ＰＬ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｈｉｇｈ ε⁃ＰＬ ｏｖｅｒ⁃ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ε⁃ｐｏｌｙ⁃ｌ⁃ｌｙｓｉｎｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；ｐＩＢ１３９
　 　 ε 聚赖氨酸（ε ｐｏｌｙ Ｌ ｌｙｓｉｎｅ，ε ＰＬ）是由
Ｌ 赖氨酸的 α 氨基和 ε 羧基通过酰胺键连接而
成的同型聚氨基酸。 由于其良好的抑菌性和生物
安全性，ε ＰＬ 已经作为一种天然的食品及化妆品
防腐剂被多个国家批准使用［１－２］。 ２０１４年我国批准
ε ＰＬ及其盐酸盐作为新型食品添加剂可以在食品
行业中使用［３］，极大地推动了国内 ε ＰＬ 的生产和
研究工作。
在工业上，ε ＰＬ 主要是通过放线菌发酵获得。
自 １９７７年第 １株 ε ＰＬ 产生菌株被筛选出来，研究
者们通过新型菌株筛选、高效菌株诱变、发酵体系优
化等措施大大提高了微生物合成 ε ＰＬ的效率［４－６］，
但是关于 ε ＰＬ合成机制的研究却较少。 究其原因
是缺少 ε ＰＬ相关产生菌株的遗传转化体系。 遗传
转化体系是对菌株进行基因鉴定分析、代谢途径改造
和其他遗传操作的前提。 ２０００～２００６年期间，Ｐａｎｄｅｙ
等［５，７－１１］利用基于 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＩＦＯ１４１４７内源质粒复制
子构建的复制型质粒建立了适用于 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ
ＩＦＯ１４１４７的接合转移体系，并借助此遗传转化体系
进行了 ε ＰＬ的合成机制探索。 但由于此工作是基
于 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＩＦＯ１４１４７内源质粒复制子展开的，并不
能为其他 ε ＰＬ产生菌株所借用。 尽管近年来多个
ε ＰＬ研究小组指出 ε ＰＬ产生菌株遗传转化体系
构建的重要性［１２－１４］，但是由于放线菌丝状菌体形态、
较厚的细胞壁以及较长的生长周期等特点，未见有其
他关于 ε ＰＬ生产菌株遗传转化体系及其分子改造
的报道［１５－１８］。
目前链霉菌常用的遗传转化体系有 ３ 种：原生
质体转化、电转化和接合转移。 在此 ３种方法中，接
合转移由于其操作简便、转化效率高、稳定性好而
被应用于许多链霉菌中。 根据相关报道表明，不同
链霉菌进行接合转移的培养基是不同的，例如，方
志锴等［１９］研究金色链霉菌遗传转化体系时发现 ＭＳ
培养基为其最理想的接合转移培养基； Ｐａｒｋ 等［２０］
发现 ＩＳＰ ４是 Ｓ． ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ２９０３２最适接合
转移培养基，而以ＡＳ ２和 ＩＳＰ ２ 作为接合转移培
养基时无 Ｓ． ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ２９０３２接合子长出；朱
云霞等［２１］发现 ＩＳＰ ４ 是抗生素 Ｂａｇｒｅｍｙｃｉｎ 生产菌
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． Ｔü４１２８最适的接合转移培养基。 因
此，本文中，笔者尝试采用接合转移的方法应用于
遗传转化体系的建立，并尝试上述几种培养基，最
终选择转化效率最高的培养基，作为本实验的最适
培养基。 在此基础上对实验过程中各条件进行优
化，以达到最高的转化效率。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株与质粒
ε ＰＬ高产菌株 Ｓ． ａｌｕｂｌｕｓ ＰＤ １，由徐虹老师
课题组筛选、诱变获得，保藏于中国典型培养物保
藏中心，保藏号为 ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１１０４３。 ｐＩＢ１３９ 质粒
是由 ｐＳＥＴ１５２质粒发展而来的大肠杆菌 链霉菌穿
梭型质粒，其中包含红霉素抗性基因强启动子、
ｐＵＣ１８复制子、阿泊拉霉素抗性基因以 ϕ３１ 的整合
酶基因和整合位点。 Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）为
接合转移供体菌。 ｐＩＢ１３９ 质粒和 Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７
（ｐＵＺ８００２）菌株均由武汉大学瞿旭东老师馈赠。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
ＬＢ培养基（ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０，酵母粉 ５，ＮａＣｌ
１０，固体培养基加 ２０ ｇ ／ Ｌ琼脂。
胰蛋白胨大豆肉汤（ＴＳＢ）培养基（ ｇ ／ Ｌ）：ＴＳＢ
３０，购于 Ｏｘｏｉｄ公司。
接合转移用培养基有 ＭＳ 培养基（ｇ ／ Ｌ）：甘露醇
２０，大豆粉 ２０，琼脂 ２０。 ＡＳ １培养基（ｇ ／ Ｌ）：酵母粉
１０，Ｌ 丙氨酸 ０􀆰 ２，Ｌ 精氨酸 ０􀆰 ５，可溶性淀粉 ５，ＮａＣｌ
２􀆰 ５，Ｎａ２ ＳＯ４ １０，琼脂 ２０； ｐＨ ７􀆰 ５。 ＩＳＰ ２ 培养基
（ｇ ／ Ｌ）：酵母粉 ４，麦芽提取物 １０，葡萄糖 ４，琼脂 ２０。
ＩＳＰ ４培养基（ｇ ／ Ｌ）：可溶性淀粉 １０，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２，
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ２，ＣａＣＯ３ ２，ＮａＣｌ １，Ｋ２ＨＰＯ４ １，ＺｎＳＯ４ １，
ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １，ＭｎＣｌ２ １，琼脂 ２０；ｐＨ ７􀆰 ２。 所有接合
转移用固体培养基均添加 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＭｇＣｌ２。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 菌株对抗生素的敏感性
测试
为了确定用于 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 菌株进行遗传
操作的选择标记，笔者考察 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １对阿泊
拉霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、硫链丝菌
素、萘啶酮酸等 ６ 种常用抗生素的抗性水平。 试验
中分别配制了含 ０、５、１０、２５、５０ 和 １００ μｇ ／ ｍＬ 上述
抗生素的 ＭＳ 平板。 之后将 ２００ μＬ 含有约 １０８ 个
Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １的孢子悬浮液均匀涂布于平板上，
３０ ℃培养 ７ ｄ后对平板上菌落长出情况进行统计，
确定 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １对各种抗生素的敏感性。
１􀆰 ２􀆰 ２　 接合转移
接合转移方法参照链霉菌操作手册，且进行了
适当的优化。 首先将 ｐＩＢ１３９ 质粒通过热激转化法
转入 Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）中，得到供体菌株
Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＴｌ２５６７ （ ｐＵＺ８００２， ｐＩＢ１３９）。 挑取 Ｅ． ｃｏｌｉ
ＥＴ１２５６７（ ｐＵＺ８００２， ｐＩＢ１３９）单菌落接种在 ５０ ｍＬ
ＬＢ培养基（含有 ５０ μｇ ／ ｍＬ 的阿泊拉霉素、卡那霉
素和氯霉素）中，３７ ℃培养至 ＯＤ６００达到 ０􀆰 ５ 左右，
离心收集菌体。 使用同等体积的新鲜 ＬＢ 培养基洗
涤菌体 ２次，以除去菌体上附着的抗生素，将洗涤好
的供体菌悬浮于 ０􀆰 ５ ｍＬ 新鲜 ＬＢ 培养基中待用。
８２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
同时，将事先冻藏的 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １的孢子（约 １０８
个）悬浮于 ＴＳＢ 培养基中，然后经过热激处理诱导
孢子萌发后悬浮于 ０􀆰 ５ ｍＬ 新鲜 ＬＢ 培养基中。 最
后，将处理好的 Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２，ｐＩＢ１３９）
和 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １孢子混合均匀分别涂布于 ＭＳ、
ＡＳ １、ＩＳＰ ２、ＩＳＰ ４ 固体培养基中，３０ ℃培养
１５～１８ ｈ 后，将 １ ｍＬ 含有阿泊拉霉素和萘啶酮酸
（质量浓度分别为 ５０ 和 ２５ μｇ ／ ｍＬ）的无菌水覆盖，
以杀灭平板上的大肠杆菌和未发生质粒转化的 Ｓ．
ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １。 ３０ ℃培养 ７ ｄ后统计平板上接合子
菌落长出情况。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １菌株对抗生素的敏感性测试
表 １为 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 菌株对抗生素的敏感
性试验结果。 由表 １可知：Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 对硫链
丝菌素和阿泊拉霉素非常敏感，分别在质量浓度为
５和 １０ μｇ ／ ｍＬ时即可完全抑制 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 在
ＭＳ平板上的生长；对卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉
素表现出较强的抗性，在 １００ μｇ ／ ｍＬ 的平板上仍有
少量 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １菌落长出。 鉴于此，硫链丝菌
素和阿泊拉霉素的抗性基因可以作为 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ
ＰＤ １进行遗传操作的选择标记，以建立其遗传转
化体系。 本研究中选择的质粒是含有阿泊拉霉素
抗性基因和 ϕ３１ 整合酶基因的大肠杆菌 链霉菌穿
梭质粒 ｐＩＢ１３９。 萘啶酮酸是链霉菌属间接合转移
过程中常用的一种可完全抑制供体菌（大肠杆菌）
生长的化学药品，因此在选择用于 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １
菌株进行遗传操作选择标记的同时也考察了 Ｓ．
ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 对萘啶酮酸的敏感性，最终发现 ５０
μｇ ／ ｍＬ的萘啶酮酸可抑制部分 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 的
生长，而在 ２５ μｇ ／ ｍＬ 萘啶酮酸时 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １
即可较好的生长，因此在接合转移过程完成后，选
定萘啶酮酸的工作浓度为 ２５ μｇ ／ ｍＬ，可以高效地抑
制供体大肠杆菌的生长而对 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 的生
长没有影响。
表 １　 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １菌株对不同抗生素的抗性
Ｔａｂｌｅ １　 Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ⁃１
抗生素种类
抗生素在 ＭＳ培养基中的质量浓度 ／ （μｇ·ｍＬ－１）
０ ５ １０ ２５ ５０ １００
阿泊拉霉素 ＋＋＋＋＋ ＋ － － － －
卡那霉素 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋
氯霉素 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋
硫链丝菌素 ＋＋＋＋＋ － － － － －
萘啶酮酸 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋＋ ＋＋＋ －
２􀆰 ２　 培养基类型对 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 接合转移效
率的影响
　 　 表 ２为不同培养基对 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 的接合
转移效率的影响结果。
表 ２　 培养基类型对接合转移效率的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ
ｉｎｔｅｒ⁃ｇｅｎｅｒｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ
培养基 转移效率
ＡＳ １ （６􀆰 ０ ±０􀆰 ３）× １０－８
ＩＳＰ ２ （２􀆰 ０±０􀆰 ５）× １０－８
ＩＳＰ ４ ０
ＭＳ （４􀆰 ０±０􀆰 ５）× １０－７
　 　 由表 ２可知，固体培养基种类对 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ
１的接合转移效率具有很大影响。 使用 ＭＳ 培养基
接合转移时的效率最高，为 （４􀆰 ０ ± ０􀆰 ５） × １０－７，而
ＩＳＰ ４作为接合转移培养基并没有转化子长出。 因
此，选定 ＭＳ培养基为 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 接合转移时
使用的培养基。
２􀆰 ３　 孢子热激处理对 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 接合转移
效率的影响
　 　 除了培养基的选择，对受体菌孢子进行热激
处理能够在一定程度上提高接合转移的效
率［１９，２１－２２］ 。 因为链霉菌孢子成熟后细胞壁较厚，
不易与大肠杆菌发生接合转移；但经过热激处理
后能够促使孢子快速萌发，进而能够提高接合转
９２　 第 ２期 孙朱贞等：一株产 ε 聚赖氨酸的白色链霉菌遗传转化体系
移的效率。 根据链霉菌孢子常用热激温度，选取
３０ ～ ６０ ℃下对孢子处理不同的时间来研究热激处
理对接合转移效率的影响，结果见图 １。 由图 １ 可
知，在孢子进行 ５０ ℃热激处理 １０ ｍｉｎ时接合转移
效率最佳。 太高和太低的热激温度均不利于 Ｓ．
ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 接合转移的进行，可能是由于太高
的热激温度会对孢子造成损伤而太低的热激温度
下孢子萌发不完全。
图 １　 孢子热激处理温度对 Ｓ． ａｂｕｌｕｓ ＰＤ １
接合转移效率的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｏｒｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓ⁃
ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １
２􀆰 ４　 其他处理条件对接合转移效率的影响
除培养基种类和热激处理条件以外，培养基中
ＭｇＣｌ２的浓度和供体菌 ／受体菌的比例同样对接合转
移效率有着重要的影响。 因此，后续对接合转移培
养基中不同 ＭｇＣｌ２的浓度 （５、１０、２０、４０、６０ 和 ８０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ）进行试验，发现初始条件的培养基中含 １０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２时接合转移效率最高。 同样，改变供
体菌和受体菌的比例也未进一步提高接合转移的
效率。 最终以 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １孢子作为受体菌，５０
℃热激处理 １０ ｍｉｎ，使用含有 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２的
ＭＳ 培养基进行接合转移，其转化效率最高，为
（３􀆰 ０±０􀆰 ４）×１０－６（图 ２）。 此外，抗生素覆盖时间也
对接合转移效率同样影响显著：就本实验而言，１６ ～
１８ ｈ覆盖效果最佳；时间少于 １６ ｈ，接合转移不完
全；时间长于 １８ ｈ，由于菌丝体大量生长，工作浓度
的抗生素则无法完全抑制未发生接合转移的 Ｓ．
ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １生长。
２􀆰 ５　 ｐＩＢ１３９质粒在 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 菌株中的稳
定性测试
　 　 为了检测 ｐＩＢ１３９质粒在 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 菌株
中的稳定性，将转化子接种到不含抗生素的 ＭＳ 培
养基中培养 ５ ｄ，再转接到新的不含抗生素的 ＭＳ 培
养基中。 转接 １０代后，随机挑选 １００个单菌落分别
图 ２　 优化前和优化后 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １
接合子在平板上的生长情况
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｅｆｏｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
转接到含有阿泊拉霉素的 ＭＳ 平板上，结果这些单
菌落全部可以在含有阿泊拉霉素的 ＭＳ 平板上生
长。 该实验表明 ｐＩＢ１３９质粒在 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 中
稳定存在，并未发生质粒丢失的情况。 Ｈａｍａｎｏ
等［１１］在此前的研究中截取 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＩＦＯ１４１４７内源
质粒 ｐＮＯ３３的复制子，并基于此复制子构建了一系
列在适用于 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＣＲ１（内源质粒 ｐＮＯ３３被消除
的 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＩＦＯ１４１４７ 菌株）的复制型质粒。 但是
由于游离质粒的不稳定性，在使用该质粒的过程中
需要添加 ２５ μｇ ／ ｍＬ 新霉素来维持质粒的存在，若
投入工业化生产中， １０ ｔ的发酵罐则需要添加 １７５ ｇ
的新霉素（按装液量 ７０％计算），而按照目前的市场
价格，生产成本将增加 ７１４ 元；且若后期分离不当，
则会造成 ε ＰＬ产品的抗生素污染，将无法作为食
品防腐剂应用到食品生产中。 ｐＩＢ１３９ 质粒能稳定
整合在 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １染色体上，因此使用 ｐＩＢ１３９
质粒对 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 基因组进行修饰则可避免
相应抗生素的使用，节约生产成本，更适用于工业
菌株规模化生产。
２􀆰 ６　 ｐＩＢ１３９在 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １中整合位点的确定
　 　 ｐＩＢ１３９属于链霉菌基因整合型质粒，不能单独存
在于细胞质中，而是通过整合酶和 ａｔｔＰ位点整合到链
霉菌基因组的 ａｔｔＢ位点上。 目前已发现多个链霉菌的
ａｔｔＢ位点，并且该位点多存在于染色体缩合蛋白或者
匹林类似蛋白（ＳＣＯ３７９８）中［２３］。 通过对 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ
ＰＤ １基因组序列的分析，发现了１个 ＳＣＯ３７９８相似蛋
白（图 ３（ａ））。 为了进一步验证此位点即为 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ
ＰＤ １中 ａｔｔＢ插入位点，以此位点两翼的核苷酸序列
设计引物，进行 ＰＣＲ，获得了 ｐＩＢ１３９质粒的全部碱基
０３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
以及部分 ａｔｔＢ序列（结果未列出）。 这个实验结果表明
ｐＩＢ１３９质粒成功地插入到了 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １染色体
的 ａｔｔＢ 位点上（图 ３（ｂ））。 后续的实验同时证明
ｐＩＢ１３９质粒的引入并未引起 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １菌株表
型以及 ε ＰＬ生产能力的变化，因此 ｐＩＢ１３９质粒适用
于 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １菌株改造。
图 ３　 ｐＩＢ１３９插入 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １位点分析
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐＩＢ１３９⁃ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ ｏｆ Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ⁃１
３　 结论
通过对上述几种条件的探索，最终确定：以 Ｓ．
ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １ 孢子作为受体菌，５０ ℃热激处理 １０
ｍｉｎ，使用含有 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２的 ＭＳ 培养基进行
接合转移，且 １６ ｈ 后进行抗生素覆盖，其转化效率
最高，达到（３􀆰 ０±０􀆰 ４） ×１０－６；经过传代实验和 ＰＣＲ
验证表明 ｐＩＢ１３９ 质粒能够稳定存在于 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ
ＰＤ １ 染色体的 ａｔｔＢ 位点上。 在此研究中除了
ｐＩＢ１３９质粒，也曾尝试将复制型质粒 ｐＩＪ７０２ 和温敏
型质粒 ｐＫＣ１１３９导入到 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １中，但并未
得到相对应的转化子，猜测这些质粒的复制子不能
在 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １中行使其功能，只能作为自杀型
质粒存在，但这些质粒携带同源片段可以进行 Ｓ．
ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １特定基因的敲除工作。 因此，笔者建
立了相对高效的 ε ＰＬ 生产菌株 Ｓ． ａｌｂｕｌｕｓ ＰＤ １
的遗传转化体系，为将来 ε ＰＬ 生产菌株在分子水
平上的研究奠定了基础。
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（责任编辑　 荀志金）
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