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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):236-241
抗体药物由于具有靶点明确、临床疗效显著、
副作用少等优点已成为当今生物医药产业发展的主
流，其中动物细胞大规模培养技术是生产抗体药物
最主要的技术手段。在细胞培养过程中由于乳酸和
CO2 的累积使得培养 pH 下降，需要通过补碱的方式
来维持培养 pH 的稳定。然而由于大型生物反应器
转速的限制，导致反应器混合效率的下降，使得补
碱过程中反应器内形成 pH 不均一的现象，影响细
胞的生理状态。然而当前对 pH 不均一性的研究主
要集中在对微生物发酵领域［1］，在动物细胞培养领
域的研究却较少［2］。因此深入大型反应器中 pH 不
均一性对细胞的影响，对于表达重组蛋白药物的哺
收稿日期 ：2015-01-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21106045）
作者简介 ：刘金涛，男，博士，研究方向 ：动物细胞与组织工程 ；E-mail ：jtliu0416@gmail.com
通讯作者 ：范里，男，讲师，研究方向 ：动物细胞与组织工程，E-mail ：fanli@ecust.edu.cn ；谭文松，男，教授，研究方向 ：动物细胞与组织工程，
E-mail ：wstan@ecust.edu.cn
大型反应器内 pH 不均一性对 CHO 细胞流加培养
过程的影响
刘金涛1  王星懿1  范里1  邓献存1，2  刘旭平1  谭文松1
（1. 华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海 200237 ；2. 浙江海正药业股份有限公司，台州 318000）
摘 要 ： 为了研究大型反应器中 pH 不均一性对 CHO 细胞流加培养过程的影响，并将培养过程顺利地放大到生产规模，根
据大型反应器的混合特性，构建了搅拌式反应器与平推流反应器串联的规模缩小装置用于模拟大型反应器中的 pH 不均一性。结果
表明停留时间为 30 s 时，整个培养过程和对照相比并无显著的差异，这表明此时补碱所导致的 pH 不均一性并未对流加培养工艺
造成影响。而随着停留时间的延长，反应器内 pH 不均一的程度越大，细胞生长和产物表达受到抑制越明显 ；与此同时，乳酸和氨
的累积显著增加，而关键质量属性唾液酸和生物学活性也随之降低。
关键词 ： CHO 细胞 ；规模缩小 ；pH 不均一性 ；TNFR-Fc ；反应器放大
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.003
Effect of pH Heterogeneity in Large-scale Bioreactor on Fed-batch
Culture Process of CHO cells
Liu Jintao1 Wang Xingyi1 Fan Li1 Deng Xiancun1，2 Liu Xuping1 Tan Wensong1
（1.State Key Lab of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237 ；2. Hisun Pharmaceutical
Co.Ltd，Taizhou 318000）
Abstract:  In order to study the effect of pH heterogeneity in large-scale bioreactor on cell culture process of CHO cells, we established
a scale down model consistent of stirred tank reactor and plug flow reactor to simulate the pH heterogeneity of large-scale bioreactor based on
the mixing characteristic. The results showed that the scale down process with 30 s residence time has no statically difference with the control
process. However, significant effect on cell growth, cell metabolism and protein production were found when increased the residence time of PFR.
Cell growth rate decreased accompanied by tremendously increase of ammonia and lactate when increased the pH heterogeneity. In addition, the
titer, sialic acid content and bioactivity of antibody fusion protein were also decreased when increased the pH heterogeneity.
Key words:  CHO cells ；scale down ；pH heterogeneity ；TNFR-Fc ；scale up
2015,31(10) 237刘金涛等：大型反应器内 pH不均一性对 CHO细胞流加培养过程的影响
乳动物细胞培养工艺的放大和抗体工业化的生产过
程具有重要的借鉴意义。
本研究以表达人肿瘤坏死因子受体 II-Fc 抗体融
合蛋白（TNFR-Fc）的 CHO 细胞为研究对象，通过
构建规模缩小系统模拟大型反应器中的 pH 不均一
性，认识 pH 不均一性对 CHO 细胞的生长、代谢和
表达的影响，为动物细胞培养工艺的放大过程优化
提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 细胞株和培养基
实验所用细胞株为表达 TNFR-Fc 的重组 CHO
细胞［3］。基础培养基和流加培养基为实验室自主开
发。培养基配制所用试剂均购自 Sigma-Aldrich 公司。
1.2 细胞培养
从细胞库中复苏重组 CHO 细胞，以（2-3）×105
cells/mL 活细胞密度接种于摇瓶中，置于 37℃、5%
CO2 的 培 养 箱 中 培 养， 转 速 为 120 r/min， 作 为 实
验用的种子细胞。取对数生长期的 CHO 细胞，以
约 1.0×106 cells/mL 的 活 细 胞 密 度 接 种 至 反 应 器
（BIOSTAT A-plus，Sartorius），培养体积为 1 L。每
24 h 取样，计数。培养液经 10 000 r/min 离心 10 min
后取上清于 -20℃保存，用于实验结束后营养物、代
谢副产物、TNFR-Fc 的检测。培养时反应器操作条
件：DO 为 50%，温度为 37℃，搅拌转速为 150 r/min，
pH 为 7.0（dead band 设为 ± 0.02）。pH 的控制采用
深层通入 CO2 或者补入 1 mol/L NaOH 溶液的方式。
流加策略采用葡萄糖控制模型［4］。
1.3 分析方法
细胞密度和活力采用 Bio-Rad TC20TM 自动计数
仪。葡萄糖、乳酸、氨的检测采用 NOVA Bioprofile
400。产物浓度的检测采用 Protein A-HPLC（Applied
Biosystems）的方法，方法参见文献［5］。上清收获
后采用 rProtein A 亲和层析柱（GE Healthcare）纯化
并收集抗体。唾液酸含量根据《中国药典》（2010
年版三部）中唾液酸检测方法测定。生物学活性
的测定方法同文献［6］。多聚体的检测采用凝胶排
阻 色 谱（SEC） 的 方 法， 色 谱 柱 为 TSK-Gel G3000
SWXL（4.6 mm×30 cm，Tosoh Bioscience），方法参
见文献［7］。
2 结果
2.1 规模缩小系统的构建
大型反应器在表层补碱过程中会产生两个区域，
高 pH 区域和主体 pH 区域（图 1）。为了使大型反
应器 pH 不均一的现象在实验室规模反应器上重现，
采用构造两个独立的装置方式来分别模拟大型反应
器的充分混合区域和混合不均匀的区域。图 1 所示
为 搅 拌 式 反 应 器（Stirred tank reactor，STR） 和 平
推流反应器（Plug flow reactor，PFR）串联组成的
STR+PFR 系统。两个装置之间进行不断的循环从而
创造出两个反应器浓度不均一的现象，不均一性的
程度通常由两个装置的大小、培养基在 PFR 中的停
留时间所决定的。停留时间（Residence time，RT）
是指物料从进入 PFR 的时间算起至离开 PFR 时为止
所经历的时间。停留时间越长，则高浓度物料从进
入 PFR 至在 STR 中完全混合所需的时间也就越长，
细胞受到高浓度物料的作用时间也就越长。因此通
过控制停留时间的长短则可以控制细胞与高浓度物
料的接触时间，从而可以反映大型反应器内的不均
一程度。
C2:Feed-zonepoint of addition
C2:Feed-zonepoint of addition
PFR
C1
STR
C1
C2
图 1 规模缩小模型模拟反应器的 pH 不均一性
STR 采用一个 2 L 搅拌式反应器（工作体积 1
L）用于模拟大型反应器的主体区域。PFR 总体积为
80 mL，主体为一根体积为长度 90 cm，内径 9.6 mm
的硅胶管，两端各通过长度 50 cm，内径 4.8 mm 的
硅胶管（Masterflex）串联到反应器上，PFR 内培养
基流动速度采用蠕动泵控制，培养过程中 PFR 至于
37℃水浴锅中。碱液的补入位置位于 PFR 入口端，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10238
碱液补加采用连续补加的方式，这使得 PFR 区域会
形成一个较高的 pH，用于模拟大型反应器的补碱区
域。通过控制培养基在 PFR 中的流动速度，可以控
制培养基在该区域内停留的时间。
2.2 pH不均一性对细胞生长、代谢和表达的影响
基 于 上 述 构 建 的 STR+PFR 装 置， 考 察 pH 不
均一性对流加培养过程的影响。实验设计如表 1 所
示，其中 Control 作为实验对照，补碱区域在 STR 中，
PFR 仅进行培养液的循环，其他实验条件的补碱区
域在 PFR 中。
表 1 不同培养条件中补碱位置和停留时间
Culture reactor Alkali feeding area RT/s
Control STR+PFR STR 30
SP-30 STR+PFR PFR 30
SP-60 STR+PFR PFR 60
SP-120 STR+PFR PFR 120
2.2.1 细胞生长和代谢 通过在不同培养条件下的
对比实验（图 2）可知，与 Control 相比停留时间
为 30 s 的条件下对细胞的生长和维持无显著的影
响，随着培养过程中停留时间的增加细胞生长受到
明显抑制。特别是 SP-120 的流加培养过程，细胞
生长速度明显慢于其他条件，比生长速率只有 0.46
day-1，在培养第 5 天达到的最大细胞密度为 8.2×106
cells/mL，分别是 SP-30 和 SP-60 培养过程的 75.9%
和 87.2%。值得注意的是该培养过程细胞并未有明
显的维持，自培养第 6 天后即出现细胞死亡现象，
比死亡速率为 0.11 day-1，分别是 SP-30 和 SP-60 培
养过程的 2.3 倍和 9 倍，且细胞活性快速下降。培
养结束时细胞活性仅为 49.7%。
细胞代谢方面，与 Control 相比停留时间为 30
s 的条件下对乳酸和氨的代谢无显著的影响（图
3），随着培养过程中停留时间的增加，细胞生长
阶 段 乳 酸 的 比 生 成 速 率 明 显 增 加。 在 SP-120 的
流加培养过程中，乳酸的比生成速率达到了 2.5
mmol/（109cells·day）， 在 培 养 第 5 天 达 到 的 最 大
为 49.8 mmol/L，分别是 SP-30 和 SP-60 培养过程的
1.87 倍和 1.12 倍，之后乳酸缓慢消耗，到培养结
束时仍有 34 mmol/L 的乳酸。与乳酸代谢相似，随
着停留时间的增加氨的浓度也明显增加，培养结束
时 SP-120 的培养过程的氨浓度达到了 12.3 mmol/L，
与 SP-30 和 SP-60 培养过程相比分别提高了 23% 和
55.7%。由此可见，因停留时间增大导致细胞较长时
间暴露在高 pH 的环境中会显著地引起细胞代谢的
改变。
2.2.2 抗体融合蛋白的表达和产物质量 表 2 所示
为不同培养条件下 TNFR-Fc 的浓度。在 SP-30 条件
下，TNFR-Fc 的最高浓度为 1.29 g/L，这与 Control
条件下 TNFR-Fc 的浓度基本一致。随着培养过程中
停留时间的增加，产物的最高浓度和比生成速率均
有不同程度的下降。在 SP-120 条件下，由于细胞
生长和维持不利，TNFR-Fc 的最高浓度仅为 404.1
mg/L，仅是 SP-30 培养过程的 32.1%。对比不同条
件下蛋白的比生成速率可以发现，TNFR-Fc 的平均
0
0
2V
ia
bl
e
ce
ll
de
ns
iti
y/
106 cells·mL-1 
4
6
8
10
12
2 4 6 8 10 12 14
Time/d
0
0
2V
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y/
106 cells·mL-1 
4
6
8
10
12
A
B
2 4 6 8 10 12 14
Time/d
Control
SP-60
SP-120
SP-30
Control
SP-60
SP-120
SP-30
图 2 不同培养条件下细胞的生长（A）和细胞活力（B）
2015,31(10) 239刘金涛等：大型反应器内 pH不均一性对 CHO细胞流加培养过程的影响
比生成速率也显著下降，仅为 6.3 pg/cell/d，分别为
SP-30 和 SP-60 培养过程 39.6% 和 63%。由此可见，
混合时间越长，反应器内 pH 不均一程度越大，细
胞暴露在高浓度 pH 区域的时间也就越长，从而越
不利于 TNFR-Fc 的表达。
表 2 培养条件对 TNFR-Fc 浓度和比生成速率的影响
Control SP-30 SP-60 SP-120
Final concentration/（g·L-1） 1.26 1.29 0.89 0.46
Specific protein product-
ivity/（pg·cell-1·d-1）
15.7 15.9 10.0 6.3
图 4 所示为不同培养条件下 TNFR-Fc 的分子排
阻色谱色谱图。SP-30 条件下除了含有少量多聚体外，
产物主峰均一。而在 SP-60 和 SP-120 条件下，产物
出现了两个峰的现象，特别是在 SP-120 的条件下，
两个峰现象更加明显。根据分子排阻色谱的原理可
以推断，两个峰现象的出现表明了产物的分子大小
或者形态结构发生了较大程度的改变。
0
0
10
La
ct
at
e/
mmol·L-1 
20
30
40
50
60
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A
m
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/mmol·L-1 
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B
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Time/d
Control
SP-60
SP-120
SP-30
Control
SP-60
SP-120
SP-30
图 3 不同培养条件下乳酸（A）和氨（B）的生成曲线
min10 15 20 25 30
ᖂаॆ
0
50
100
150
200
250
300
Contrd SP-30 SP-60 SP-120
图 4 不同条件下 TNFR-Fc 的分子排阻色谱色谱图
对不同培养条件下 TNFR-Fc 唾液酸含量进一
步分析可知（图 5-A），SP-30 条件下 TNFR-Fc 的唾
液酸与 Control 相比并无显著性差异。而在 SP-60 和
SP-120 条件下，TNFR-Fc 的唾液酸含量都有不同程
度的下降，特别是在 SP-120 条件下 TNFR-Fc 唾液
酸含量仅为 SP-30 条件下的 74%。此外，对生物学
活性分析发现也有类似现象（图 5-B），SP-60 和 SP-
120 条件下 TNFR-Fc 的生物学活性分别是 SP-30 条
件下的 93.2% 和 78.8%。由此可见，停留时间在 30
s 时，反应器内的 pH 不均一程度并未对产物的唾液
酸和生物学活性造成显著的影响，但是继续增大停
留时间，TNFR-Fc 的唾液酸含量和生物学活性的下
降程度也越大。
上述结果说明，停留时间为 30 s 时，整个培养
过程和 Control 相比并无显著的差异，这表明此时补
碱所导致的 pH 不均一性并未对流加培养工艺造成
影响。而随着混合时间的延长，反应器内 pH 不均
一的程度越大，细胞在高浓度 pH 区域的停留时间
也就越长，从而对流加培养过程中细胞生长、代谢、
产物表达以及产物质的不利影响也越大，主要表现
在 ：（1）细胞生长受到抑制，乳酸和氨的累积显著
增加 ；（2）TNFR-Fc 的表达受到抑制，并且关键质
量属性唾液酸和生物学活性也随之降低。
3 讨论
当前搅拌式生物反应器已经成为生物制药领域
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10240
的主要生产装置［8］，反应器内的搅拌系统不仅为细
胞悬浮在反应器内提供充分的混合能力，还保证了
反应器内的营养物质均一性分布。与微生物和植物
细胞不同，动物细胞的外层为细胞膜，细胞较脆弱，
易受剪切力的影响，因此动物细胞培养过程中反应
器通常设置较低的转速。然而转速的降低则会导致
反应器混合能力的下降，会进一步导致大型生物反
应器中的 pH、DO、营养物浓度在反应器内分布不
均一［9］。考虑到大型反应器在线实验的困难性，如
无法控制微环境范围、控制细胞进入微环境的频率
和时间、实验费用大等特点，此项工作多使用“规
模缩小模型”（Scale down model）的方法，对诸多
工艺参数进行研究，确定关键工艺参数及操作范
围［10，11］。小型的搅拌式反应器由于混合时间很短，
刚进入反应器的新鲜物料能够达到瞬间的完全混合，
使得整个反应器内各处物料的浓度完全相同。而对
于平推流反应器而言，物料以一致的方向向前移动，
所有物料在反应器内的停留时间相同，不存在返混
的现象［12］。基于搅拌反应器和平推流反应器的特点，
构建两级串联搅拌反应器 - 平推流反应器系统，用
于模拟大型反应器中 pH 不均一性对流加培养工艺
的影响。
通过上述培养过程的系统研究，我们明确了停
留时间与产品关键质量控制参数（唾液酸和产物活
性）间的联系，并确认 pH 不均一为流加培养工艺
放大过程中的关键控制参数。结合上述研究结果，
停留时间为 30 s 的培养过程中细胞生长，代谢，产
物表达特别是产品质量属性并未受 pH 不均一的影
响。超过 30 s 时，细胞生长受到抑制且维持不利，
乳酸大量生成，关键质量控制参数（唾液酸和产物
活性）均有不同程度的降低。因此，流加培养工艺
放大到大型反应器时应当通过减少补碱量、加强反
应器的混合效果、降低反应器的混合时间等手段，
降低反应器内因补碱导致的 pH 不均一的程度。此外，
有待在细胞水平和分子水平上深入研究 pH 不均一
性对细胞作用的机理。
4 结论
通过采用规模缩小技术对大型反应器内的 pH
不均一进行模拟，结果表明，停留时间为 30 s 时，
对流加培养过程并无显著的影响。而当停留时间延
长到 60 s 和 120 s 时，则会引起细胞生理状态和代
谢的变化，乳酸大量累积，特别是停留时间为 120 s
时，最终 TNFR-Fc 的最高浓度仅为 462 mg/L，在分
子筛排阻色谱的图谱中出现两个后修饰不同的产物，
唾液酸和生物学活性仅是 SP-30 的 74% 和 78.8%。
根据规模缩小模型的模拟，流加培养工艺放大过程
中应当通过增强反应器的混合效果、降低反应器的
混合时间等手段，从而降低反应器内因补碱导致的
pH 不均一的程度。
参 考 文 献
［1］ Käβ F, Junne S, Neubauer P, et al, Process inhomogeneity leads
to rapid side product turnover in cultivation of Corynebacterium
0
Control SP-30 SP-60 SP-120
0.2
N
or
m
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Control SP-30 SP-60 SP-120
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0.8
1.0
1.2
B
图 5 不同培养条件下 TNFR-Fc 唾液酸（A）和生物学活
性（B）
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（责任编辑 马鑫）